通過定量分析植物初級代謝產(chǎn)物和酶代謝庫發(fā)現(xiàn)除草劑新作用位點

Franck E. Dayan *, Stephen O. Duke

a Agricultural Biology, College of Agricultural Sciences, Colorado State University, Fort Collins, CO 80523, USA

b Natural Products Utilization Research, Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, University, MS 38677, USA

1. 引言

具有明顯的新的分子靶標(biāo)[作用位點（SOA）]的商業(yè)除草劑已經(jīng)有30多年沒有被使用了[1]。在此期間，進化出的獨特的抗除草劑雜草的數(shù)量增加了約5倍，現(xiàn)在，多種惡性雜草對幾種具有不同SOA的除草劑都產(chǎn)生了抗性[2]?？刂瞥輨┠退幮匝葑冿L(fēng)險的一種方法是，將具有不同作用方式（MOA）的幾種除草劑組合使用，類似于混合藥物延遲耐藥性的演變。與抗生素和其他一些藥物（如抗癌藥）一樣，我們迫切需要一種具有新SOA的化合物用于耐藥性管理。

不幸的是，由于抗草甘膦作物的巨大成功以及由此導(dǎo)致的除草劑市場價值下降，在20世紀(jì)90年代中期，農(nóng)藥化學(xué)工業(yè)減少了在除草劑發(fā)現(xiàn)方面的投資[1]。參與除草劑發(fā)現(xiàn)的公司的迅速合并[3]也導(dǎo)致除草劑發(fā)現(xiàn)方面總體投資的下降。發(fā)現(xiàn)具有新SOA的除草劑的迫切需求激發(fā)了人們對實現(xiàn)這一目標(biāo)的方法的研究興趣。過去，除草劑的發(fā)現(xiàn)一直依賴于通過大型化學(xué)庫的合成和評估來識別具有良好除草活性的先導(dǎo)化合物（高通量篩選）。另一種方法是優(yōu)化具有新型分子靶標(biāo)的中等活性化合物的結(jié)構(gòu)，以期能開發(fā)出分子靶標(biāo)不變但可增強靶位點活性和可用于農(nóng)業(yè)的商品。如三苯酮類除草劑，該除草劑是通過優(yōu)化化感物質(zhì)纖精酮（allelochemical leptospermone）的結(jié)構(gòu)而得到的[4]。纖精酮和這類商業(yè)除草劑類似物可抑制二羥苯基丙酮酸雙加氧酶（HPPD）的活性[5]，HPPD是最新引入的除草劑SOA。許多其他具有新型分子靶標(biāo)的天然植物毒素可作為發(fā)現(xiàn)除草劑的起始模板[6]。但是，到目前為止，還沒有人通過這種方法生產(chǎn)出具有新SOA的商業(yè)除草劑。同樣地，對與潛在除草劑靶標(biāo)酶結(jié)合的小分子進行計算機模擬（生物理性設(shè)計），以及使用潛在靶標(biāo)酶的體外實驗來篩選大型組合化學(xué)庫，也未能得到具有新作用靶位點的商業(yè)化產(chǎn)品。最后，使用基因敲除技術(shù)尋找通過新的作用靶位點已經(jīng)識別出的潛在的新的除草劑靶標(biāo)（參考文獻[7]中有詳細(xì)討論），但并未找到這些靶標(biāo)的有良好除草活性的分子。這種方法存在的一個問題是，敲除突變體通常會完全消除靶標(biāo)酶的活性，而化學(xué)物質(zhì)很少能100%抑制該酶的活性。因此，用基因敲除獲得的致死表型不會轉(zhuǎn)化為除草活性，而會通過化學(xué)作用部分抑制靶標(biāo)的活性。為了更好地評估除草劑的SOA，我們需要一種基因敲除的校正方法。

雖然人們對發(fā)現(xiàn)具有新SOA的除草劑的方法有著濃厚的興趣，但很少有論文為此類發(fā)現(xiàn)提供新的策略和見解。一個例外是，使用基因組學(xué)方法，從編碼天然植物毒素生物合成途徑的酶的基因簇中，發(fā)現(xiàn)植物毒素的靶標(biāo)酶（如參考文獻[8]）。能夠產(chǎn)生抑制初級代謝酶的毒素的微生物，通常在毒素合成的基因簇中具有抗性基因[9]。在某些情況下，抗性基因編碼了毒素靶標(biāo)的突變型抗性形式。因此，研究微生物植物毒素有可能發(fā)現(xiàn)新的潛在除草劑及其SOA。這種方法是有前途的，但未經(jīng)證實。例如，盡管通過這種方法發(fā)現(xiàn)了支鏈氨基酸合成途徑酶-二羥基酸脫水酶（DHAD）的微生物產(chǎn)生的天然產(chǎn)物抑制劑（天冬氨酸），但該抑制劑是酶的弱抑制劑和弱除草劑[10]。盡管DHAD在一段時間內(nèi)一直被認(rèn)為是潛在的除草劑SOA（如參考文獻[9]中的討論），但目前還沒有出現(xiàn)抑制DHAD的商業(yè)除草劑。

圖1. 本文討論了兩種新的用于識別除草劑靶標(biāo)的潛在方法。第一種是識別被抑制后引起植物毒性代謝產(chǎn)物積累的酶（左），第二種是識別植物組織中低分子濃度的靶位點（右）。

本文討論了兩種新的除草劑靶標(biāo)識別方法。第一種是識別被抑制后引起植物毒性代謝產(chǎn)物積累的酶（圖1），第二種是鑒定植物組織中低分子濃度的靶位點（圖1）。這兩種方法都可能會識別出能夠響應(yīng)低劑量除草劑的靶位點。從環(huán)境和毒理學(xué)的角度來看，低劑量是可取的，而且如果一個化合物分子的生產(chǎn)成本昂貴，低劑量的特性可以使其作為除草劑在經(jīng)濟上可行。

2. 初級代謝酶的毒性前體

大多數(shù)商業(yè)除草劑在雜草中只有一個主要的分子靶位點。在某些情況下，除草劑以同一類型酶的幾種變體為靶標(biāo)，如含有絲氨酸-蘇氨酸蛋白磷酸酶抑制劑內(nèi)毒素和抑制長鏈脂肪酸合成酶的除草劑。這些靶標(biāo)幾乎都是初級代謝的酶。非酶靶標(biāo)的除草劑包括光合系統(tǒng)II的光合電子流抑制劑（如阿特拉津和敵草?。?、光合系統(tǒng)I的能量轉(zhuǎn)移劑（如百草枯和敵草快）以及與非酶蛋白F-box蛋白結(jié)合的生長素類除草劑[如2,4-二氯苯氧基乙酸（2,4-D）]，F(xiàn)-box蛋白可以介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達。

通過抑制酶阻斷初級代謝途徑通常是致命的，但是，用化學(xué)制劑完全阻斷代謝途徑又很困難。除阻斷部分代謝途徑外，植物毒性化合物的積累還應(yīng)提高除草劑的藥效。一些非常成功的除草劑和一些天然植物毒素發(fā)揮作用的主要原因是植物性毒性的中間代謝產(chǎn)物或代謝產(chǎn)物的衍生物的積累（圖1）。最明顯的例子是原卟啉原氧化酶（PPO）抑制劑（表1）[11]。PPO抑制劑類除草劑種類相對較多。PPO是一種存在于線粒體和質(zhì)體（如葉綠體）中的酶，參與生產(chǎn)血紅素和葉綠素所需的卟啉的生物合成。盡管這類抑制劑抑制了PPO，但它們會導(dǎo)致PPO的酶促產(chǎn)物原卟啉IX（PPIX）的積累。在光和分子氧存在的情況下，PPIX有劇毒，因為在這種條件下，PPIX充當(dāng)一種光敏色素，并生成單線態(tài)氧，進而產(chǎn)生其他活性氧（ROS）。當(dāng)PPO被抑制時，其前體原卟啉原IX會積累并退出卟啉途徑，通過PPO以外的方式在對細(xì)胞中單線態(tài)氧和其他ROS防護相對較弱的位置上被氧化成PPIX。正常情況下，PPIX和其他卟啉途徑中間體的濃度非常低，并且僅限于線粒體和質(zhì)體中的卟啉途徑，這些地方較好地防護了ROS，尤其是在葉綠體中。這種作用方式的優(yōu)點是，致命的ROS水平可能是通過抑制植物中部分PPO的活性而產(chǎn)生的。最有效的PPO抑制劑是一些活性最強且施用量最低（每公頃幾克）的除草劑。在致死劑量下，所有除草劑都會產(chǎn)生ROS，這是嚴(yán)重生化和生理破壞的三級作用。而ROS會進一步破壞植物的生理和生化特性。有許多文章誤以為這種普遍的三級作用是初級作用。使用PPO抑制劑時，ROS的產(chǎn)生更接近于PPO抑制的主要產(chǎn)物。

乙酰乳酸合酶（ALS）抑制劑是一大類除草劑（表 1）。ALS是支鏈氨基酸（纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸）合成途徑中的第一個酶。從理論上講，如果ALS抑制劑的作用完全取決于支鏈氨基酸的消耗，則該合成途徑中其他兩種酶的任意一種都可以作為除草劑的靶標(biāo)。然而，有許多來自不同化學(xué)類別的商用抗ALS除草劑，并沒有以該合成途徑中其他兩種酶作為靶標(biāo)。酮酸還原異構(gòu)酶（KARI）和DHAD（該合成途徑中的第二種酶和第三種酶）的良好體外抑制劑已被發(fā)現(xiàn)[12-14]。但是，利用KARI和DHAD抑制劑開發(fā)商業(yè)除草劑的研究一直都沒有成功。這三種酶之間的一個區(qū)別是，只有ALS底物a-酮丁酸酯（2KB）具有植物毒性。2KB可以通過轉(zhuǎn)氨作用被轉(zhuǎn)化為對植物有毒的2-氨基丁酸酯（2-AB），而2KB和2AB在用ALS抑制劑處理的高等植物中積累[15]。盡管Shaner和Singh [16]認(rèn)為，由于2AB與ALS抑制劑的除草作用之間沒有良好的相關(guān)性，缺乏良好的相關(guān)性并不能排除它們沒有參與作用的可能性。在同一篇論文中，他們表明，用高濃度纈氨酸處理玉米幼苗會抑制幼苗生長和2AB的積累。2AB的植物毒性可能導(dǎo)致這一生長抑制。他們的實驗結(jié)果缺乏良好相關(guān)性，這可能是由于參與植物毒性的2AB庫的細(xì)胞定位的混淆效應(yīng)。ALS抑制劑也會導(dǎo)致奎寧酸鹽（一種來自莽草酸途徑的植物毒素）的積累，如參考文獻[17]所述。ALS如何導(dǎo)致奎寧酸鹽的積累尚不清楚。與大多數(shù)商業(yè)除草劑相比，最好的ALS抑制劑可以在極低的劑量下有效地除草。

AAL（Alternaria alternataf. sp.lycopersici）毒素是一種天然的植物毒素，它可以在極低的劑量下起效。通過抑制神經(jīng)酰胺合酶（植物中的CS或鞘氨醇N-?；D(zhuǎn)移酶），它可以導(dǎo)致鞘氨醇基CS前體鞘氨醇類和4-羥基鞘氨醇迅速而高水平地積累（表1）[18]。即使在亞微摩爾濃度下，該作用也非常迅速和強烈。此外，外源供應(yīng)的CS前體會引起與AAL毒素類似的植物毒性癥狀[19]，這表明前體的積累是膜功能迅速喪失的原因，而不是由神經(jīng)酰胺合成所引起的。健康植物組織中CS前體的含量非常低，但是神經(jīng)酰胺及其糖基化形式是植物質(zhì)膜的重要組成部分[20]。游離鞘脂堿基能夠迅速破壞質(zhì)膜的完整性[19]，這可能是由于這些化合物對質(zhì)膜完整性有直接影響，而其他機制對其有間接影響。AAL毒素和其他結(jié)構(gòu)相關(guān)的CS抑制劑（如伏馬菌素）對CS前體的積累也有類似的作用[21]。盡管許多人已經(jīng)將誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡看作AAL毒素的MOA（如參考文獻[22]），但與AAL毒素對CS前體的作用相比，這些作用顯然是毒素對CS的次級或三級作用，正如植物中與百草枯毒性相關(guān)的細(xì)胞凋亡顯然是除草劑的二級作用一樣[23]。在陽光充足的情況下，大量ROS的產(chǎn)生會迅速破壞質(zhì)膜，因此百草枯導(dǎo)致的細(xì)胞死亡速度很快，細(xì)胞無法參與凋亡過程。

草銨膦（glufosinate）是一種廣譜的非選擇性除草劑，可使植物迅速死亡（接觸活性）。草銨膦是D-和L-磷脂酰絲菌素的外消旋混合物。L-磷脂酰絲菌素是潮鏈霉菌（Streptomyces hygroscopus）的天然產(chǎn)物，該對映異構(gòu)體是草銨膦的唯一活性成分。它被用于非農(nóng)作物區(qū)和抗草銨膦轉(zhuǎn)基因作物中的雜草管理。它可以抑制谷氨酰胺合成酶（GS）的活性，GS是一種存在于植物葉片中的高豐度酶，草銨膦在植物氮同化中起著至關(guān)重要的作用（表1）[24]。同源異構(gòu)體GS1位于細(xì)胞質(zhì)中，而同源異構(gòu)體GS2存在于葉綠體中[25]。GS2將光呼吸產(chǎn)生的氨同化為谷氨酰胺[26,27]。盡管已有幾種已知的GS抑制劑（大多數(shù)是由微生物產(chǎn)生的化合物），但草銨膦是唯一一種被開發(fā)成商業(yè)除草劑的分子[6]。

表1 涉及有毒前體積累和（或）低濃度靶位點（SOA）的除草劑MOA

草銨膦不可逆地與GS結(jié)合，導(dǎo)致由光呼吸途徑產(chǎn)生的氨積累。雖然草銨膦的作用機理與其對光呼吸途徑的改變有關(guān)，但是草銨膦的毒性與氨的積累并沒有直接的關(guān)系，而是與ROS迅速積累及隨后的脂質(zhì)過氧化相關(guān)[28]。ROS的來源尚不清楚，但可能與用該除草劑處理過的敏感植物中觀察到的碳同化抑制有關(guān)。這種抑制可能是由于光呼吸途徑中某些中間體（磷酸乙醇酸、乙醇酸和乙醛酸）的積累所致。其中有一些中間體是1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（又稱RUBP羧化酶或Rubisco）的強抑制劑[29,30]，因此可以被認(rèn)為是天然植物毒素。

草甘膦（glyphosate）是世界上使用最多的除草劑[31]。它只有一種SOA，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸（EPSPS）合酶，但是目前關(guān)于通過對EPSPS合酶的抑制來殺死植物的作用機理仍不完全清楚（表1）[32]。EPSPS合酶是莽草酸合成途徑的一種酶，該合成途徑負(fù)責(zé)產(chǎn)生芳香氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸）。大多數(shù)植物中都含有極低水平的莽草酸-3-磷酸酯（EPSPS的底物）和莽草酸酯（EPSPS合酶的底物），但是在用草甘膦處理過的植物中有大量莽草酸酯積累，而奎寧酸鹽含量較低[莽草酸途徑的中間體（3-脫氫奎寧酸酯）的另一種產(chǎn)物]?？鼘幩猁}水解酶與莽草酸酯作用生成奎寧酸鹽[33]。有趣的是，ALS抑制類除草劑（參見上文）也會導(dǎo)致奎寧酸鹽的積累[17]。通過任何抗性機制對草甘膦產(chǎn)生抗性的植物，不會積累莽草酸酯，因此測量草甘膦對莽草酸酯的反應(yīng)是一種檢測草甘膦抗性的快速生物測定方法[34]。我們尚未發(fā)現(xiàn)莽草酸酯的植物毒性數(shù)據(jù)，但奎寧酸鹽具有中等植物毒性，可能會引起類似ALS抑制劑和草甘膦的作用[17,35,36]。奎寧酸鹽的某些作用，如對碳水化合物代謝的作用與草甘膦的作用類似[35]。因此，草甘膦的除草作用至少有一部分可能是由于高水平的奎寧酸鹽。

雖然在大多數(shù)植物組織中，莽草酸酯和奎寧酸鹽的含量都非常低，但是仍有少數(shù)植物種類積累了大量的莽草酸酯[如八角茴香（Illicium verum）和甜菊（Liquidamber styraciflua）] [37,38]和奎寧酸鹽[如金雞（Chinchona officianalis）] [39]。我們假設(shè)這類植物能夠?qū)⑦@些化合物與正常生長發(fā)育所涉及的細(xì)胞分開，以避免自毒，正如許多其他會導(dǎo)致植物自毒作用的化合物那樣[40]。

許多年前，Cornish-Brown [41]預(yù)測，由于代謝中間體的大量積累，通過非競爭性抑制作用生效的農(nóng)藥可能特別有效。如果中間體對靶標(biāo)生物有毒，那么這種效果將被放大。草甘膦是商業(yè)上唯一已知的非競爭性（不與莽草酸酯競爭）酶抑制劑類除草劑，它會導(dǎo)致兩種中間體的大量積累。因此，抑制合成具有植物毒性前體的酶的非競爭性酶抑制劑類除草劑可能特別有效。

次級代謝中會產(chǎn)生許多植物毒性代謝產(chǎn)物，但產(chǎn)生這些代謝產(chǎn)物的酶不太可能成為良好的除草劑靶標(biāo)。原因有以下幾個方面。首先，次級代謝產(chǎn)物毒性很大，必須將它們分隔開或排泄出去，避免自毒作用。例如，在腺毛表皮下的空間中將高植物毒性的青蒿素分隔開以遠(yuǎn)離細(xì)胞質(zhì)[40,42]。液泡中有一些具有植物毒性的化合物，這些化合物不會對細(xì)胞造成傷害，如被儲存在植物液泡中的具有植物毒性的芥子油苷[43]?；形镔|(zhì)高粱酮（allelochemical sorgoleone）的對苯二酚前體被高粱（Sorghum）的根毛分泌到土壤中，在土壤中被氧化為對植物有毒的醌高粱酮（quinone sorgoleone）[44]。這些次級化合物通常位于生物合成途徑的末端，因此它們不是通過抑制酶而積累的底物。另一個問題是，能產(chǎn)生最具植物毒性的次生代謝產(chǎn)物的植物物種非常有限，其中大多數(shù)不太可能成為目標(biāo)雜草。一個極端的例子是青蒿素，它僅由一種非常少量的雜草黃花蒿（Artemisia annua）產(chǎn)生[42]。次級化合物幾乎可以被認(rèn)為是初級代謝產(chǎn)物，因為它們在高等植物中幾乎無處不在。例如，高等植物中的叔查耳酮（t-chalcone）是一種苯丙烯類化合物的前體。它是一種中度有效的植物毒素[45]，因此抑制將其用作前體的酶（查爾酮異構(gòu)酶）可能會導(dǎo)致其毒性水平上升。

另一個可能促進植物毒性中間體產(chǎn)生的因素是，當(dāng)SOA被抑制時，代謝途徑失調(diào)。我們對這一現(xiàn)象知之甚少。有證據(jù)表明，抑制EPSPS合酶會導(dǎo)致一種或多種莽草酸途徑的產(chǎn)物濃度降低，這些產(chǎn)物負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)莽草酸途徑中碳的流入[32]。抑制ALS、CS、GS和PPO也可能會發(fā)生類似的情況。如果是這樣，有毒中間體是否達到致命水平與途徑失調(diào)的程度息息相關(guān)。

另一個要考慮的因素是有毒中間體的體內(nèi)半衰期。該化合物可能是不穩(wěn)定的，或者可能被代謝轉(zhuǎn)化為毒性更低或更高的化合物。后者的一個例子是莽草酸酯轉(zhuǎn)化為羥基苯甲酸，如原兒茶酸和沒食子酸[46]。沒食子酸是一種植物毒素[47]。

這些通過抑制酶引起有毒代謝產(chǎn)物積累的案例，只代表了該方向的小部分思路。據(jù)我們所知，目前還沒有研究對所有初級代謝產(chǎn)物的植物毒性進行過檢驗，更不用說次級代謝產(chǎn)物的植物毒性了。另一種方法是檢查代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，以發(fā)現(xiàn)那些在健康植物組織中的濃度非常低的化合物，因為進化已使植物體內(nèi)的有毒的初級代謝中間體的積累最小化。然后通過測定這些化合物的植物毒性，以確定潛在的除草劑靶標(biāo)酶。

3. 靶標(biāo)的低濃度

另一種可行的除草劑靶標(biāo)識別方法是檢測植物中以相對較低濃度存在的靶標(biāo)（圖1）。相反，研究人員早就認(rèn)識到，大量存在的潛在靶位點不是好的靶位點，因為為了殺死植物，需要高劑量除草劑才能抑制足夠的靶標(biāo)。例如，Rubisco是負(fù)責(zé)C3光合碳固定的酶。Rubisco是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，在C3和C4植物綠葉中分別占總蛋白質(zhì)含量的50%和30% [48]。由于其含量豐富，甚至有人提出將其作為綠葉中膳食蛋白質(zhì)的來源[49]。目前既有Rubisco的天然抑制劑也有合成抑制劑，如2-羧基阿拉伯糖醇-1-磷酸（Rubisco中間體的天然過渡態(tài)中間體）[50]和碘乙酰醇（一種合成化合物[51]），但是要抑制足夠的Rubisco并殺死雜草，需要大量施用除草劑。因此，這不是參與除草劑發(fā)現(xiàn)工作的研究人員所感興趣的靶位點。

通過基因擴增靶標(biāo)（EPSPS）而造成草甘膦抗性進化的案例證明，除草劑靶位點的數(shù)量對除草劑是否可行至關(guān)重要。草甘膦是一種使用率很高的除草劑，在許多情況下需要約1 kg·hm?2才能有效地殺死大多數(shù)目標(biāo)雜草。草甘膦作為地球上使用最廣泛的除草劑[31]，產(chǎn)生抗藥性的選擇壓力是巨大的。已有47種雜草在剛剛過去的20年中產(chǎn)生了抗藥性，這一現(xiàn)象大約開始于草甘膦商品化的25年后[2]。植物進化出了多種抗藥性機制[52,53]，但是最常見的機制之一是EPSPS基因的擴增，這導(dǎo)致雜草中EPSPS合酶的濃度更高，因此需要更高劑量的草甘膦才能抑制足夠的EPSPS合酶，從而致命性地阻斷莽草酸途徑[54]。在抗草甘膦長芒莧（Amaranthuspalmeri）中，EPSPS基因的拷貝增加了90倍，導(dǎo)致EPSPS蛋白質(zhì)的量增加了12倍[54]，該數(shù)量導(dǎo)致所需草甘膦的量增加了約6～8倍，這種劑量既不經(jīng)濟也不環(huán)保[54]。自第一例基因擴增以來，在闊葉植物和草類植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這種抗草甘膦的機制（如參考文獻[54-59]）。如果雜草中的EPSPS水平通常與那些進化基因擴增的除草劑目標(biāo)基因的一樣高，那么草甘膦永遠(yuǎn)不會被開發(fā)為除草劑，因為每公頃至少需要10 kg除草劑，該劑量在經(jīng)濟和環(huán)境上都是不可行的。如果它是一種低使用率的除草劑，情況可能并非如此。研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，基因擴增也是抗乙酰輔酶A羧化酶抑制劑類除草劑的一種機制[60]。大多數(shù)抗除草劑的抗性機制，以及某些物種對某些除草劑具有天然抗性的抗性機制均尚未被查明，因此我們無法完全了解酶的豐度在許多進化抗性和自然耐受情況下的重要程度。

同樣，對于植物中每一種主要生化途徑的酶的蛋白質(zhì)含量（無論是絕對含量還是相對含量），也幾乎沒有相關(guān)的信息。這個含量代表了潛在的除草劑結(jié)合位點的數(shù)量，與草甘膦一樣，它會影響除草劑的濃度，除草劑必須到達這些酶的亞細(xì)胞位點才能對植物產(chǎn)生致命作用。蛋白質(zhì)組學(xué)在過去的20年中取得了巨大進展，其在比較蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)功能、翻譯后修飾等方面提供了大量信息，但是，即使是擬南芥（Arabidopsis thaliana），我們也尚未確定其初級代謝物所涉及的所有酶中每種蛋白質(zhì)的實際相對濃度。但是，仍有一些方法可以識別植物細(xì)胞中低豐度的蛋白質(zhì)，最低可以測量2.25 fmol·mg?1的葉片鮮重的豐度（如參考文獻[61]）。低豐度酶比高豐度酶更有可能成為更好的潛在除草劑靶位點。

4. 最后的幾個觀點

對于這兩種可能的方法，我們有一些注意事項要說明，這些注意事項與庫的大小或濃度不能反映庫的周轉(zhuǎn)率這一事實有關(guān)。對于利用有毒代謝產(chǎn)物的方法，當(dāng)互補的SOA被抑制時，較高的庫周轉(zhuǎn)率意味著化合物更快的積累，從而促進除草劑生效。對于以酶為SOA的方法，較高的周轉(zhuǎn)率可能會降低除草劑對其作用靶位點的功效，因為隨著單位時間內(nèi)酶的數(shù)量的增加，除草劑與靶標(biāo)相互作用的可能性會增加。如果除草劑是不可逆的結(jié)合劑，并且酶的降解不會釋放未改變的除草劑，這將更為重要。被抑制的酶和（或）與該酶結(jié)合的除草劑的去向會影響酶代謝庫通量速率對除草劑功效的作用。研究人員必須牢記這些注意事項。

為了盡快開發(fā)出新SOA的商業(yè)除草劑，我們有必要使用所有可能的發(fā)現(xiàn)方法以最大程度地提高成功的可能性。本文，我們提出了兩種概念簡單的策略。代謝組學(xué)可被用于識別可能具有毒性前體的靶標(biāo)，或如果在體內(nèi)蓄積可能會轉(zhuǎn)化為毒素的前體。蛋白質(zhì)組學(xué)可被用于鑒定低豐度的酶靶標(biāo)。理想情況下，尋求被抑制時會產(chǎn)生植物毒素的低豐度SOA是最好的，如PPO（表1）。然而，情況并非總是如此，草銨膦的靶標(biāo)GS（葉片中第二大富集酶）即是例子。我們所討論的兩種方法可能已被除草劑開發(fā)公司使用過，但目前我們還沒有發(fā)現(xiàn)這樣的公開記錄。

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