基于圖像的擬南芥抗性檢測自動化工作臺的構建

Goldi Mkhij , Dinesh S. Pujr , In-Hyouk Song , Byoung Hee You , Hong-Gu Kng

a Department of Engineering Technology, Texas State University, San Marcos, TX 78666, USA

b Department of Biology, Texas State University, San Marcos, TX 78666, USA

c Caresoft Global Inc., Burr Ridge, IL 60527, USA

1. 引言

由于氣候不斷變化和人口不斷增加，作物改良對糧食安全變得至關重要[1]。植物病害的防治是影響糧食安全的重要因素之一。例如，小麥作為一種主要農作物，在過去一直受到周期性的破壞。在最近一個事件中，當一種新的小麥莖銹病從東非蔓延到中東時，小麥價格大幅上漲，并威脅到發(fā)展中國家的生計[2]。這個例子強調了學習植物如何抵御潛在的病原體和害蟲以確保糧食資源的重要性。

抗性性狀的鑒定一直是植物病害防治的主要手段之一[3]。例如，一長串有效對抗植物疾病的R（抗性）基因已經被定性并用于作物保護[4]。這些R基因會引發(fā)強烈的防御反應，以應對來自各種病原體和害蟲的感染，底層信令網絡雖然高度復雜，但似乎涉及許多常見的參與者。例如，擬南芥（Arabidopsis）的病程相關基因非表達子1（NPR1）被證明是水楊酸（SA）的受體，水楊酸是一種眾所周知的防御激素[5]，并且是大多數R基因介導的抗性機制所必需的[6]。因此，缺乏NPR1會導致不同植物物種對病原體的易感性[7]。擬南芥中的許多防御信號成分在作物植物中也起著重要的作用，這強調了詳細描述擬南芥抗性信號通路的重要性[8]。遺憾的是，隨著這些防御成分數量的增加，由于缺乏價格合理的植物抗性分析的物候學工具，描述所有必要的遺傳學背景變得越來越難。

越來越多的遺傳學資源，包括自然和人工變異，為識別重要的農業(yè)性狀提供了寶貴的機會[9]。盡管由于測序技術的進步，大規(guī)?；蚍中同F在成為了常規(guī)應用，但高通量基因分型檢測還不是常規(guī)應用，因為沒有固定的程序和方法，并且很少有價格合理的物候學工具[10]。在高通量設置中，植物中的抗性檢測更具挑戰(zhàn)性，因為抗性性狀大多是通過勞動密集型步驟定量感染病原體和害蟲來評估。為了克服這些障礙，我們設計了一株攜帶發(fā)光報告基因的丁香假單胞菌（P.syringae），并將其用于感染葉片的無創(chuàng)成像，以定量植物的抗性[11]。該報告菌株對100多個擬南芥生態(tài)型進行評估，從而鑒定出兩個與擬南芥基本細菌抗性變異相關的數量性狀位點[11]。

自動化是高通量表型的一個關鍵要素，通常由自動化工作臺完成。Phenoscope和PHENOPSIS [12,13]是兩個被用于大規(guī)模表型的商業(yè)自動化工作臺。然而，由于成本較高，這種類型的自動化工具無法被用于傳統(tǒng)實驗室，從而使大規(guī)模研究面臨重大挑戰(zhàn)。為了克服這一障礙，我們建立了與攝像機同步的、價格合理的自動化工作臺，用于大規(guī)?；趫D像的電阻分析，這表明自動化在植物物候學領域中的優(yōu)勢。

2. 研究方法

2.1. 自動化工作臺的部件

自動化工作臺是使用表1和表2中列出的部件組裝的。在研究成果部分描述了一個逐步組裝的過程。

2.2. 電子倍增電荷耦合設備相機同步自動化工作臺的編程代碼

附錄A中的Supplementary data提供了一種用C++編寫的編程代碼，用于將自動化工作臺與電子倍增電荷耦合設備（EMCCD）相機同步。

2.3. 植物生長、細菌感染和細菌生長定量

擬南芥植物在22 ℃以及相對濕度60%的土壤中生長，光照時間為16 h。通過使用無針注射器在指示接種物（在10 mmol·L-1MgCl2中）上注射丁香假單胞菌，4周齡的植物被浸潤，所述接種物在28 ℃下在具有適當抗生素的金氏B培養(yǎng)基中生長2 d。在給定的時間點采集接種的葉片，然后用于細菌效價測定，如前文所述[14]。

2.4. In planta NanoLuc 報告分析

使用由HCImageLive軟件（Hamamatsu, Japan）運行的EMCCD相機（C9100-23B, Hamamatsu, Japan） 捕獲受感染植物的化學發(fā)光。外部邊緣觸發(fā)模式功能被用于同步自動化工作臺。在成像之前，植物被放置在黑暗中30 min，以減少背景發(fā)光。用NanoGlo試劑（Promega,USA）對感染的葉片進行噴涂，并拍攝圖像；將相機設置為4倍binning，靈敏度增益為297，光子成像模式（PIM）在1 處激活，曝光時間為1 min。

3. 自動化工作臺的組裝和運行示例

我們的自動化工作臺是為了移動傳統(tǒng)的擬南芥平面，也被稱為1020溫室托盤，它能容納18盆擬南芥植物。我們將自動化工作臺的組裝分為兩個部分：① 機械部分；② 電子部分。

3.1. 自動化工作臺的組裝——機械部分

為了支撐和移動18盆植物的重量，高剛度和高推力是自動化工作臺的必要方面。為了持續(xù)地捕捉圖像，精度也至關重要。為了達到這些要求，一個預先設計好的套件——V-Slot?NEMA 23線性執(zhí)行器束（絲杠），其SKU編號為1170批和UPC編號為819368022902——被用于提供沿x軸的自動化工作臺的平移。如圖1（a）所示，該套件有一個步進電機、一個絲杠、螺母、墊片、軸承和一個V-Slot?龍門板。運動由絲杠驅動，其動作由步進電機控制。

表1 用于制造x軸組件的機械部件

表2 用于控制自動化工作臺的電子部件

平面上的每個植物都位于相機的正下方，以捕捉其圖像。這種定位需要工作臺沿x方向和y方向平移運動。先前描述的線性執(zhí)行器束的副本被反向放置在x軸的頂部。用每個軸的V-Slot?龍門板組裝x軸和y軸，如圖1（b）所示。不能將擬南芥托盤直接放置在圖1（b）中所示的設計組件上，因為它本身的重量會導致相機和植物之間的偏移。因此，如圖1（c）所示，兩個V-Slot?線性軌道被安裝在組件的頂部，從而保持擬南芥托盤在運動過程中的穩(wěn)定和平衡。

圖1（d）展示了支撐18個擬南芥盆栽的自動化工作臺的三維實體模型。盡管土壤和水的重量相當大（見附錄A中的Supplementary video），這個工作臺仍能夠順利地驅動植物。使用一個通用的照相臺來固定相機，其高度可以手動調整[圖1（e）]。自動化工作臺被放置在相機下面。

3.2. 自動化工作臺的組裝——電子部分

采用兩臺NEMA 23步進電機驅動自動化工作臺的x軸和y軸。一種微控制器——SainSmart計算機數控（CNC）路由器單軸3.5 A TB6560步進電機驅動板——被用于向電機提供電脈沖，且脈沖利用直流（DC）電源進行放大。液晶顯示器（LCD）被用于指示植物在平面上的實時位置。所有組件都是電氣連接的，如圖2所示。Arduino控制器存儲操作的整個邏輯過程，用于圖像捕獲，并相應地向步進電機提供必要的電脈沖序列。它還在必要的時候觸發(fā)相機并控制LCD顯示工作臺的位置。

3.3. 由自動化工作臺推進的基于圖像的抗藥性分析

我們最近開發(fā)了一種丁香假單胞菌菌株（手稿正在準備中），其攜帶一種最亮的發(fā)光標記NanoLuc螢光素酶[15]，用于植物中基于圖像的抗性檢測。為了測試自動化工作臺是否能促進這種基于圖像的檢測，我們用發(fā)光的丁香假單胞菌對擬南芥植株進行感染，并在它們被自動化工作臺調動時對它們進行成像。一臺EMCCD相機連續(xù)9次不間斷地對這些受感染的植物進行成像。值得注意的是，對已經感染發(fā)光的丁香假單胞菌1 d、2 d和3 d的擬南芥植株進行成像（圖3）。圖3（b）中展示了每個不同時間的具有代表性的圖片。為了確保這種基于圖像的抗性分析與常規(guī)方法一樣定量，我們繪制了兩種方法的值，如圖3（b）所示，這些值顯示出很強的線性相關性。這些結果表明，由自動化工作臺輔助的基于圖像的分析可以以最小的手動輸入產生高度定量的數據。

圖1. 帶有相機及其支架的自動化工作臺組件。放置由兩個電機控制的鋼軌來控制二維運動。組裝第一根鋼軌（a）后，第二根鋼軌被放置在頂部（b）。安裝軌道用于支撐（c）植物生長平面（d）。（e）組裝好的工作臺被放置在EMCCD相機下。

4. 結論和觀點

圖2. 移動組件所涉及的各個電子元件的物理連接。

我們開發(fā)了一個可定制的自動化工作臺，能夠促進高通量的耐藥性分析。該工作臺有兩個電機控制的T型槽金屬棒。運動與EMCCD相機同步，允許不間斷地對植物進行成像。結合最近開發(fā)的發(fā)光丁香假單胞菌菌株，這種自動化工具能夠在不到10 min內對30多個受感染的擬南芥植株進行抗性分析。如果手動進行，同樣的抗性分析通常需要幾個小時，因為它涉及幾個勞動密集型步驟。

我們基于圖像的植物電阻分析使用了一個EMCCD相機，它能在昏暗的亮度下捕捉圖像。當與自動化工作臺結合時，這種高通量友好的方法是目前為止能在最短時間（不到幾分鐘，而不是幾小時）內進行植物抗性分析的一種方法。除了增強高通量，這種較高的速度還為配備高靈敏度成像傳感器的EMCCD相機提供了額外的優(yōu)勢，即用于放大非常微弱的光信號。在被稱為增益老化的過程中，EMCCD相機的靈敏度隨著時間的推移而降低，從而導致傳感器靈敏度差[16]。嚴重的增益老化會使EMCCD相機無法被用于基于圖像的電阻測試，且根據我們的經驗，修復這個老化問題是非常昂貴的。使用自動化工作臺進行無中斷成像，除了減少由于偶爾的用戶錯誤而造成的不必要曝光之外，還提供了最短的運行時間，因而有助于保持相機更長時間的高靈敏度。

植物免疫信號已得到深入研究，從而確定了許多明確的信號通路[17]。隨著越來越多的免疫成分被表征，分析更大一組植物的需求在持續(xù)生長。然而，傳統(tǒng)的耐藥檢測依賴于對病原體的手動計數，通常不利于高通量的實驗設置。因此，個別研究的重點是少數遺傳背景下抗性的變化。出于同樣的原因，在基因同質系內的抗性性狀分布很少被測量。越來越明顯的是，真核生物基因組是高度動態(tài)的，尤其是在壓力下[18,19]。這種動態(tài)性的促成因素之一是轉座因子活性的增加，其可以改變基因組[20]。因此，我們設想，一旦大規(guī)模的抗性研究成為植物病理學領域的規(guī)范，免疫信號因子之間的相互作用，甚至在同源遺傳背景下的抗性變異都會被發(fā)現。

圖3. 基于圖像的電阻分析與自動化工作臺相結合，產生了與傳統(tǒng)分析相媲美的定量數據。（a）基于圖像（x軸）檢測和傳統(tǒng)（y軸）檢測之間的相關性。對3.5周齡的擬南芥植株進行注射器滲透，滲透105 CFU·mL-1發(fā)光的丁香假單胞菌。在指定的感染后的一天（dpi），用NanoGlo底物對被感染的植物進行噴射，并使用EMCCD相機成像，如x軸所示。同樣被感染的葉片接受常規(guī)的葉片研磨試驗，并測量其細菌滴度，如y軸所示。（b）有光和無光的代表性圖片。受感染植物的發(fā)光是在沒有光的情況下拍攝的，并以偽彩色顯示，以便于更好地分化。CFU：菌落形成單位；RLU：相對光單位。

本研究提出的自動化工作臺容納了一個傳統(tǒng)的擬南芥托盤。該工作臺可以被很容易地通過替換具有足夠容量的棒和電機來擴展。當涉及大規(guī)模植物成像時，大多數實驗室對自動化的選擇是有限的。雖然先進的自動化工具在提高表型能力方面有很大潛力，但低成本和（或）自制（DIY）表型的解決方案，如本研究提出的自動化工作臺將減少進入壁壘[21]，并將進一步推廣高通量方法。因此，我們希望價格合理的自動化工作臺將鼓勵更多的實驗室致力于大規(guī)模的抗性檢測，以便更好地描述日益復雜的植物防御信號。

Acknowledgments

We thank Angela Kang for critical comments on this manuscript and John Word for feedback/help on designing the automation table. This work is supported by the National Science Foundation (IOS-1553613 to Hong-Gu Kong).

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data to this article can be found online at https://doi.org/10.1016/j.eng.2019.09.009.