白酒和黃酒中生物胺的高效液相色譜分析法

劉慧琳 趙 源 張 瑛 唐佳琪 王 靜

（北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心北京工商大學(xué) 北京100048）

黃酒屬于釀造酒，酒度一般為15°左右，在世界三大釀造酒（黃酒、葡萄酒和啤酒）中占有重要的一席。 它是以稻米、黍米、黑米、玉米、小麥等為原料，經(jīng)過蒸料，拌以麥曲、米曲或酒藥，進(jìn)行糖化和發(fā)酵釀制而成。 黃酒含有豐富的營養(yǎng)，有“液體蛋糕”之稱，它含有眾多生物活性成分，如酚類物質(zhì)和谷胱甘肽等，能夠?qū)θ梭w起到清除自由基，延緩衰老，抑制腫瘤等的生理作用。白酒是中國的國酒， 有著2 000 多年的歷史， 是一種酒精含量在38%～65%之間的澄清、 透明的發(fā)酵酒精飲料，通常由高粱或玉米、大米、小麥、豌豆、小米和高粱混合制成。白酒是一種著名的蒸餾酒，其生產(chǎn)工藝不同于其它蒸餾酒， 它結(jié)合了兩種獨(dú)特的發(fā)酵和蒸餾過程，即在發(fā)酵過程中，淀粉轉(zhuǎn)化為糖與糖轉(zhuǎn)化為酒精兩個過程是同時進(jìn)行的。 白酒中含有豐富的風(fēng)味成分，包括有機(jī)酸、酯、內(nèi)酯、酚類、雜環(huán)、萜類和芳香族化合物。此外，白酒還含有氨基酸和多肽等對人體有益的潛在功能成分[1]。

酒中富含氨基酸， 而氨基酸是生物胺的前體物[2]。 發(fā)酵過程復(fù)雜且難以控制，易產(chǎn)生潛在有害物質(zhì)——生物胺[3]。生物胺（Biogenic amine，BA）是在酒和發(fā)酵食品中經(jīng)常檢測到的一類具有生物活性、低分子質(zhì)量的含氮化合物，對人體有不利影響[4-6]。 氨基酸含量被認(rèn)為是葡萄酒釀造過程中生物胺形成的主要原因[7]。食品中常見的生物胺主要有：組胺、色胺等雜環(huán)胺，酪胺、苯乙胺等芳香族胺，腐胺、尸胺、精胺、亞精胺等脂肪族胺。其中，組胺和酪胺是食品中對人體影響最大的兩種生物胺，分別由組氨酸和酪氨酸脫羧形成[8-9]。 適度攝入生物胺對人體健康起到促進(jìn)作用， 而攝入過量生物胺在人體蓄積會引起許多不適癥狀，如頭疼、嘔吐等[10]。 過量攝入酪胺還會引起邊緣血管收縮，導(dǎo)致機(jī)體心律變快、呼吸增強(qiáng)，同時降低體內(nèi)去甲腎上腺素水平含量[11]。超過100 mg 會引起偏頭痛，超過1 080 mg 會引起嚴(yán)重中毒[12]。 組胺的過量攝入會增加腎上腺素和去甲腎上腺素的釋放， 并刺激運(yùn)動神經(jīng)和感覺神經(jīng)，引起過敏和高血壓[13]。 組胺是葡萄酒中常見的一種生物胺， 不同國家對其限定標(biāo)準(zhǔn)各不相同，其中以德國標(biāo)準(zhǔn)最為嚴(yán)格，規(guī)定不得高于2 mg/L[14]。 歐盟規(guī)定食品中組胺含量不得超過100 mg/kg[11]， 酪胺含量不得超過100～800 mg/kg[15]。

目前，酒中生物胺含量的檢測方法有多種，如毛細(xì)管電泳法（Capillary electrophoresis，CE）[16]、高效液相色譜法 （High performance liquid chromatography，HPLC）[17]、生物傳感器法（Biosensor method）[18]、薄層色譜法（Thin layer chromatography，TLC）[19]等。 其中HPLC 法實(shí)際應(yīng)用最為廣泛。HPLC 儀能夠同時分析多個目標(biāo)物，分析速度快且準(zhǔn)確性高，因而在生物胺的檢測中應(yīng)用最多。由于生物胺沒有共軛特征結(jié)構(gòu)， 在紫外檢測器上響應(yīng)較弱，所以對其進(jìn)行柱前衍生，使其產(chǎn)生紫外和熒光吸收。 常用的衍生試劑主要有鄰苯二醛（OPA）、丹磺酰氯（Dns-Cl）、二硝基苯甲酰氯（DABS-Cl）、苯甲酰氯（Benzoyl chloride）。 丹磺酰氯是最為常用的衍生試劑，其衍生物相對穩(wěn)定，在避光條件下可穩(wěn)定存放12～14 h[20-21]。 試驗(yàn)中通過丹磺酰氯-柱前衍生-HPLC 法對黃酒與白酒中生物胺進(jìn)行檢測與比較。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山西代縣黃酒與內(nèi)蒙草原王白酒系列均來自于當(dāng)?shù)仄髽I(yè)；9 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品（純度均＞98%）：色胺（CAS 號：61-54-1）、β-苯乙胺（CAS 號：64-04-0）、腐胺（CAS 號：110-60-1）、尸胺（CAS 號：462-94-2）、 鹽酸吡哆胺 （CAS 號：524-36-7）、 組胺（CAS 號：51-45-6）、酪胺（CAS 號：51-67-2）、亞精胺（CAS 號：124-20-9）、精胺（CAS 號：71-44-3），上海源葉生物科技有限公司；丹磺酰氯（CAS號：605-65-2），上海麥克林生化科技有限公司；飽和碳酸氫鈉、氯化鈉、甲酸、正丁醇，西隴化工股份有限公司；乙酸銨，北京邁瑞達(dá)科技有限公司；乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司；丙酮（分析純）、三氯甲烷（分析純），北京化工廠；乙醚（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器、設(shè)備

LC-20AT HPLC 儀，日本島津公司；MX-F 渦旋振蕩器， 大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；UGC-24M 氮吹儀， 北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司；VELOCITY 18R 大容量冷凍離心機(jī)， 澳大利亞Dynamica 公司；實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)，奧豪斯儀器（上海）有限公司；恒溫水浴鍋，山東甄城華魯電熱儀器有限公司；Water Pro 超純水系統(tǒng)， 美國Labconco 公司；ME104/02 電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；0.22 μm 濾膜針頭濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品，以0.1 mol/L 稀鹽酸為溶劑，配制質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的生物胺單體標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。 準(zhǔn)確量取不同體積的儲備液，稀釋，配制成終質(zhì)量濃度分別為50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05 mg/L 的梯度標(biāo)準(zhǔn)溶液。 以上所配溶液于4 ℃冰箱避光存放，保存期為2 周。

1.3.2 樣品的萃取與衍生 量取酒樣10.00 mL，向其中加入適量氯化鈉至飽和。 準(zhǔn)確量取上層試樣5.00 mL，置于15 mL 離心管中，逐滴加入4～7滴5 mol/L 氫氧化鈉溶液，將溶液pH 值調(diào)至11.5～12.0 范圍。 加入正丁醇-三氯甲烷（體積比1 ∶1）混合溶液5.0 mL， 充分均勻混合后4 000 r/min 離心10 min。 吸取并保留上層有機(jī)相，重復(fù)操作兩次，合并提取液。 取3.0 mL 提取液， 加入0.2 mL 1 mol/L 鹽酸， 充分混合后吸取2 mL 溶液， 在40℃條件下氮?dú)獯蹈?，然后加?.0 mL 0.1 mol/L 鹽酸，充分溶解提取物，待衍生。

將上述提取液（1 mL）置于15 mL 塑料離心管中，依次加入1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 氫氧化鈉溶液 （1 mol/L）、1 mL 丹磺酰氯衍生試劑（10 mg/mL 丙酮為溶劑），渦旋振蕩60 s 后置于60℃水浴環(huán)境中衍生，15 min 后取出， 加入100 μL谷氨酸鈉溶液（50 mg/mL 飽和碳酸氫鈉為溶劑）終止衍生。 將上述混合物振蕩混勻后，在60 ℃條件下繼續(xù)反應(yīng)15 min，取出冷卻至室溫，向其中加入1 mL 超純水，旋渦振蕩1 min 后混勻，置于40℃低溫水浴環(huán)境下氮吹除去有機(jī)溶劑（約1 mL），加入0.5 g 氯化鈉， 待溶解后繼續(xù)加入5 mL 有機(jī)溶劑乙醚，振蕩2 min 后靜置分層。 將上層有機(jī)層轉(zhuǎn)移至15 mL 玻璃試管中，水相（下層）再次萃取。將兩次萃取液合并后氮?dú)獯蹈桑?加入復(fù)溶液乙腈1 mL，完全溶解后經(jīng)0.22 μm 針頭濾器過濾，冷藏待測。

1.3.3 色譜條件 采用賽默飛Hypersil GOLD C18色譜柱（250 mm×4.6 mm， 5 μm）分離，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣體積20 μL，柱溫35 ℃，流動相A 為0.01 mol/L 乙酸銨溶液（含0.1%乙酸）-乙腈（9 ∶1，V/V），流動相B 為乙腈-0.01 mol/L 乙酸銨溶液（9∶1，V/V），流速0.8 mL/min。 見表1 梯度洗脫程序1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)化的衍生試劑含量

選擇丹磺酰氯作為衍生劑， 其添加量優(yōu)化結(jié)果見圖1。 在丹磺酰氯添加量5～10 mg/mL 范圍，隨著添加量的增加，各生物胺的峰面積增加；當(dāng)?shù)せ酋Ｂ忍砑恿看笥诘扔?0 mg/mL 時，各生物胺峰面積不再隨其添加量的增加而增加， 基本保持不變，表明所衍生的生物胺達(dá)到飽和狀態(tài)。 選取10 mg/mL 的丹磺酰氯溶液作為本試驗(yàn)的衍生試劑。

圖1 Dns-Cl 添加量的優(yōu)化Fig.1 Optimization of the content of Dns-Cl

2.2 優(yōu)化的色譜條件

比較Thermo Hypersil GOLD C18 柱 （柱長250 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）與島津Inertsil ODS-4 C18 柱（柱長150 mm，柱內(nèi)徑4.6 mm，柱填料粒徑5 μm）對各生物胺的分離效果。 經(jīng)250 mm 色譜柱分離后，9 種生物胺在37 min 內(nèi)彼此分離且峰形對稱。 經(jīng)150 mm 色譜柱分離后，37 min 內(nèi)色譜圖中只有8 種生物胺的流出峰，無法在37 min 內(nèi)分離9 種生物胺。

2.3 優(yōu)化的洗脫條件

流動相A 與B 的比例見表1。 通過不斷調(diào)整流動相A 與B 的含量，得到最優(yōu)洗脫程序方案2。采用方案2 對9 種生物胺混標(biāo)溶液進(jìn)行洗脫分離，各生物胺流出峰彼此分離效果較好。

2.4 優(yōu)化的試驗(yàn)方案

比較萃取處理對生物胺含量檢測的影響。 方案1 直接對生物胺衍生， 而方案2 在對生物胺衍生之前進(jìn)行萃取富集處理。選取尸胺、鹽酸吡哆胺與β-苯乙胺3 種生物胺，比較萃取處理對生物胺檢測效果的影響，結(jié)果見表2。 分析可知，對生物胺萃取處理后再衍生，生物胺損失程度減小，在樣品復(fù)雜的基質(zhì)中對生物胺的檢測效果更佳， 這說明對樣品進(jìn)行萃取、凈化的重要性。

表2 試驗(yàn)方案的優(yōu)化（mg/L）Table 2 Optimization of the test plan （mg/L）

2.5 線性關(guān)系與檢出限

按照所建立的方法， 將配制好的梯度系列標(biāo)準(zhǔn)溶液（50.00，25.00，5.00，1.00，0.50，0.25，0.20，0.10，0.05 mg/L）進(jìn)行線性試驗(yàn)。 對標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（X）對其峰面積（Y）進(jìn)行回歸方程線性擬合，通過R2進(jìn)行相關(guān)性評價(jià)。 9 種生物胺的檢出限（LOD）與定量限（LOQ）通過3 倍信噪比（S/N=3）與10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算，結(jié)果見表3。 優(yōu)化的色譜條件程序洗脫后， 混標(biāo)中各生物胺色譜峰圖如圖1所示， 各生物胺加標(biāo)黃酒樣品中的色譜峰圖如圖2 所示。

由表3 可知，9 種生物胺在0.5～50 mg/L 質(zhì)量濃度范圍，該方法具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.998。 檢出限范圍0.07～0.22 mg/L，定量限范圍0.07～0.73 mg/L。分析圖1 與圖2 后發(fā)現(xiàn)37 min 洗脫與分離后，9 種混合生物胺色譜峰先后流出，被成功分離。

表3 9 種生物胺的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 3 The linear range， regression equations， and correlation coefficient， LOD and LOQ of 9 biogenic amines

圖2 9 種生物胺標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖（10.0 mg/L）Fig.2 HPLC chromatogram of 9 kinds of biogenic amine standards（10.0 mg/L）

圖3 黃酒樣品中生物胺的色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of biogenic amines in Chinese yellow wine sample

2.6 加標(biāo)回收

選取3 種生物胺做加標(biāo)回收試驗(yàn)， 向黃酒樣品中加入3 種濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液， 加標(biāo)量分別為1.0，5.0，10.0 mg/L，其濃度均在線性范圍。用所建立的方法進(jìn)行前處理與測定， 各加標(biāo)水平樣品平行測定3 份，結(jié)果見表4。 3 種生物胺加標(biāo)回收率在83.30%～114.70%之間， 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均低于4.56%，說明該方法對生物胺的檢測結(jié)果較為準(zhǔn)確，重復(fù)性好。

表4 中國黃酒中3 種生物胺的加標(biāo)回收率Table 4 Recoveries of three kinds of biogenic amines spiked in Chinese yellow wine sample

2.7 實(shí)際樣品分析

用所建立的方法分析黃酒與白酒中生物胺含量，結(jié)果見表5 和表6。由表5 可知，黃酒中含有8種生物胺，總含量為29.39 mg/L，各生物胺含量均有差異。 色胺與尸胺為該黃酒樣品中的主要生物胺，含量分別為（18.06 ± 0.012）mg/L 與（4.28 ±0.059）mg/L，β-苯乙胺含量為（1.21±0.021）mg/L，腐胺含量為（2.15±0.002）mg/L，鹽酸吡哆胺含量為（2.45±0.028）mg/L，組胺含量為（0.40±0.049）mg/L，酪胺含量為（0.75 ± 0.003）mg/L，亞精胺含量為（0.09±0.003）mg/L，精胺未檢出。 白酒檢測結(jié)果見表6。 白酒中生物胺總含量在3.83～7.94 mg/L 之間，其中組胺在4 種白酒中被檢出，精胺只在一種白酒中檢出， 其余7 種生物胺在5 種白酒中均被檢出。 比較黃酒與白酒中各生物胺含量可以發(fā)現(xiàn)，黃酒中的生物胺總含量高于白酒。這與之前研究報(bào)道[20-21]一致。 雖然二者均采用釀造工藝，但是后期工藝不同，黃酒無需蒸餾處理，而白酒需蒸餾處理， 蒸餾后酒體中生物胺含量大大減少。 另外， 催化氨基酸脫羧轉(zhuǎn)變成生物胺的脫羧酶， 在pH 4.04～4.33 的黃酒釀造過程中被誘導(dǎo)合成，導(dǎo)致黃酒中生物胺含量相對較多。

表6 白酒中生物胺含量Table 6 Biogenic amine contents in Baijiu

3 結(jié)論

采用HPLC-紫外檢測法，丹磺酰氯柱前衍生梯度分離洗脫黃酒與白酒中的生物胺， 在37 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了兩種酒體中9 種生物胺的分離。 比較分析黃酒與白酒中生物胺含量， 結(jié)果該方法準(zhǔn)確性好，可快速檢測9 種生物胺含量。