凍藏時間對非發(fā)酵面團(tuán)流變特性及蛋白結(jié)構(gòu)的影響

楊靜潔 張 波 張影全 郭波莉 顧熟琴

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院1,北京 102206)(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所2,北京 100193)

冷凍非發(fā)酵面團(tuán)一般用于中國傳統(tǒng)面制品如速凍湯包、蒸餃、燒麥的生產(chǎn)，受到廣大消費者的青睞[1]。凍藏過程中面團(tuán)品質(zhì)會逐漸發(fā)生劣變，進(jìn)而降低產(chǎn)品食用品質(zhì)，縮短了產(chǎn)品的貨架期[2]。Bhattacharya等[3]將面團(tuán)進(jìn)行84 d凍藏、Phimolsiropol等[4]將面團(tuán)進(jìn)行118 d凍藏后，均發(fā)現(xiàn)凍藏過程中，面團(tuán)質(zhì)量降低，醒發(fā)時間延長，面團(tuán)持氣性下降；Rashidi等[5]研究凍藏對法棍面包質(zhì)構(gòu)影響發(fā)現(xiàn)，在45 d的凍藏期內(nèi)，面包的硬度、咀嚼性逐漸增加。Gaikwad等[6]研究冷凍雜糧面包面團(tuán)發(fā)現(xiàn)，在凍藏的45 d內(nèi)，面團(tuán)黏性不斷上升，內(nèi)聚性降低。Yi等[7]認(rèn)為凍藏時間顯著影響面包面團(tuán)的拉伸性；Sharadanant等[8]將面團(tuán)凍藏112 d后發(fā)現(xiàn)，凍藏時間越長，面團(tuán)的最大抗拉阻力越小，延伸性越大。

目前，國內(nèi)外對于發(fā)酵面團(tuán)及其加工制品在凍藏期間品質(zhì)的變化已經(jīng)有了較為全面的研究, 但是對傳統(tǒng)中式非發(fā)酵面團(tuán)凍藏期間品質(zhì)的變化鮮有報道。面團(tuán)中游離巰基含量(-SH)可以反映面筋形成程度[9, 10]，面團(tuán)中谷蛋白大聚體(GMP)含量決定面團(tuán)面筋強(qiáng)度和面團(tuán)特性[11]，蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)的變化與蛋白質(zhì)的聚集行為有關(guān)[12]；流變學(xué)特性是面團(tuán)最重要的特性之一，蠕變與恢復(fù)性可以反映面團(tuán)加工過程中宏觀結(jié)構(gòu)的變化[13]。本研究將非發(fā)酵面團(tuán)在-18 ℃下進(jìn)行凍藏，研究不同凍藏時間對非發(fā)酵面團(tuán)質(zhì)構(gòu)的影響，并從動態(tài)流變特性、蠕變與恢復(fù)性、游離巰基含量、谷蛋白大聚體含量、蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)方面探究其品質(zhì)變化，為傳統(tǒng)中式非發(fā)酵冷凍面團(tuán)產(chǎn)品的冷凍工藝提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選用市售小偃22號小麥籽粒，采用Buhler MLU 202 實驗?zāi)ブ品?，出粉率約為70%。

實驗用小麥粉質(zhì)量性狀見表1。

表1 實驗用小麥粉質(zhì)量性狀

1.2 方法

1.2.1 面團(tuán)制作

為保證面團(tuán)的均一性，采用827504型粉質(zhì)儀和面，當(dāng)面團(tuán)稠度達(dá)到500BU時取出面團(tuán)，將面團(tuán)分割成60 g的小面團(tuán)，整形后用保鮮膜包裹，置于-30 ℃超低溫冰箱中進(jìn)行冷凍。當(dāng)面團(tuán)中心溫度降至-18 ℃時，將面團(tuán)轉(zhuǎn)移至-18 ℃冰箱中進(jìn)行凍藏備用。取樣時間分別為1、30、60 d。以不進(jìn)行冷凍處理的面團(tuán)為對照組。

1.2.2 面團(tuán)處理方法

冷凍面團(tuán)于25 ℃、相對濕度85%的恒溫恒濕箱中解凍，至面團(tuán)中心溫度達(dá)25 ℃后，取部分樣品用于質(zhì)構(gòu)實驗、動態(tài)流變、蠕變及恢復(fù)性。另取部分解凍面團(tuán)樣品于液氮中快速冷凍后，用ALPHA 1-2LD PLUS 真空冷凍干燥機(jī)進(jìn)行真空冷凍干燥72 h，絕對真空度為3.7×10-5MPa，冷凍阱溫度-50 ℃，凍干后樣品采用MM400研磨儀粉碎，過60目篩，樣品粉末于4 ℃冷藏，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析。

1.2.3 面團(tuán)質(zhì)構(gòu)測定

將解凍后面團(tuán)用TA-XT2i型質(zhì)構(gòu)儀測定面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)特性。實驗采用探頭：P/50鋁制圓柱形探頭；測定參數(shù)設(shè)置為：測前速度3 mm/s，測試速度1 mm/s，測后速度3 mm/s，壓縮比例70%，2次壓縮時間間隔10 s，觸發(fā)力10 g。每個樣品做6次重復(fù)，取平均值。本實驗中選擇硬度、彈性、黏附性、內(nèi)聚性、咀嚼度作為質(zhì)構(gòu)評價指標(biāo)。

1.2.4 面團(tuán)動態(tài)流變學(xué)測定

參考Zhang等[14]的方法采用Physica MCR301型應(yīng)變控制流變儀進(jìn)行面團(tuán)動態(tài)流變測定。測定模式為頻率掃描。具體操作為：選擇25 mm平行幾何平板，上下平板之間間隙2 mm。取待測面團(tuán)約2 g置于底部平板，降下頂部平板后，刮去平板以外多余面團(tuán)并在邊緣覆蓋一層硅油水分揮發(fā)，靜置10 min以避免其他外力干擾后開始測試。參數(shù)設(shè)定：應(yīng)變恒定為0.05%(在LVR內(nèi))，頻率由0.1增大至100 rad/s，測定溫度恒定在25 ℃。所得頻率的掃描結(jié)果以頻率(rad/s)為橫坐標(biāo)，G′或者G″為縱坐標(biāo)作圖。

1.2.5 面團(tuán)蠕變及恢復(fù)性測定

為測定面團(tuán)受到外力后的形變抵抗力與恢復(fù)性，采用Physica MCR301型應(yīng)變控制流變儀進(jìn)行面團(tuán)的蠕變及恢復(fù)性測定。具體操作與動態(tài)流變掃描操作相同。測試過程分為兩個階段：蠕變階段向面團(tuán)施加50 Pa外力，作用300 s；恢復(fù)階段撤去外力，保持300s以使面團(tuán)形變恢復(fù)。測試結(jié)束后可得到面團(tuán)蠕變及恢復(fù)性曲線，利用儀器自帶RHEOPLUS/32軟件分析可得到一系列的參數(shù)：最大蠕變?nèi)崃縅max，零切變黏度η0；瞬時蠕變?nèi)崃縅0；遲滯蠕變?nèi)崃縅1。

1.2.6 面團(tuán)中游離巰基含量測定

參照Anderson等[15]的方法進(jìn)行測定。

1.2.7 面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量測定

取250 mg凍干面團(tuán)粉末加入23 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%的SDS-0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.9)，漩渦振蕩至粉末完全分散于液體后，在30 ℃下以1 000 r/min振蕩振蕩5min后，25 ℃ 11 600 g離心30 min，棄上清液，采用杜馬斯燃燒定氮儀測定沉淀中蛋白質(zhì)含量，即為GMP近似含量。每個樣品做3次重復(fù)，取平均值。

1.2.8 面團(tuán)中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)測定

采用傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)中對面團(tuán)中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行測定。稱取凍干面團(tuán)粉末樣品2 mg，按照1∶100比例加入優(yōu)級純溴化鉀作為稀釋劑，與樣品一起在瑪瑙研缽中充分研磨后壓片，10 kg壓力保持30 s，然后將制得的均勻透明薄片放入傅里葉變換紅外光譜儀中。圖譜掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，信號掃描累加64次。每種處理的樣品重復(fù)測定3次。

圖譜處理：采用儀器自帶POUS 8.1 和Peak Fit 4.12 對圖譜進(jìn)行分析處理。首先對所得原始吸收圖譜進(jìn)行背景扣除水分、CO2氣體補(bǔ)償，然后對位于酰胺I帶(1 600～1 700 cm-1)的吸收峰進(jìn)行基線校正、傅里葉自退去卷積、二階求導(dǎo)分析，使得疊加的各子峰得到分辨。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)對應(yīng)峰面積占總峰面積的比例定量計算出二級結(jié)構(gòu)含量。根據(jù)宋國勝[16]的方法，各個波長區(qū)間所對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)歸屬見表2。

表2 酰胺I帶經(jīng)處理后各個條帶對應(yīng)的二級結(jié)構(gòu)歸屬

1.3 統(tǒng)計分析

采用Excel 2010 、Origin 8.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表繪制。采用SPSS 19.0 中One-way ANOVA 程序進(jìn)行方差分析。采用Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍藏時間對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性影響

凍藏時間對面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性具有顯著性影響(表3)。隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)的硬度呈上升趨勢，彈性、內(nèi)聚性和咀嚼度呈降低趨勢，而黏附性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。凍藏1～30 d時，面團(tuán)硬度、彈性、內(nèi)聚性變化幅度較大，30～60 d時，面團(tuán)質(zhì)構(gòu)特性繼續(xù)發(fā)生變化，但變化幅度減小，因此凍藏前30 d內(nèi)面團(tuán)質(zhì)構(gòu)變化最為明顯。凍藏1 d后面團(tuán)黏附性略有增加，但隨著凍藏時間繼續(xù)延長，面團(tuán)的黏附性呈現(xiàn)降低趨勢。這可能是因為長時間的凍藏使面團(tuán)中的自由水含量減少，并且凍藏過程中水分不斷重結(jié)晶導(dǎo)致了面團(tuán)中水分的重新分布，最終導(dǎo)致了面團(tuán)黏附性的變化[7]。

表3 不同凍藏時間下解凍面團(tuán)TPA指標(biāo)值

2.2 凍藏時間對面團(tuán)動態(tài)流變學(xué)特性的影響

凍藏時間對非發(fā)酵面團(tuán)流變特性的影響如圖1所示。凍藏過程中，非發(fā)酵面團(tuán)的彈性模量G′和黏性模量G″都隨著凍藏時間的延長而降低。這可能與面團(tuán)中面筋蛋白結(jié)構(gòu)以及與其他大分子物質(zhì)之間作用力的改變有關(guān)。與凍藏1 d面團(tuán)相比，面團(tuán)凍藏至30 d時，彈性模量G′出現(xiàn)顯著降低；繼續(xù)凍藏至60 d時，彈性模量G′繼續(xù)下降，但下降幅度明顯減小。該結(jié)果與面團(tuán)質(zhì)構(gòu)結(jié)果中彈性、內(nèi)聚性變化規(guī)律相似。

圖1 不同凍藏時間對非發(fā)酵面團(tuán)流變特性的影響

2.3 凍藏時間對面團(tuán)蠕變和回復(fù)性的影響

蠕變及恢復(fù)性可以反映面團(tuán)在實際加工過程中的宏觀性質(zhì)，特別是面團(tuán)在受到外力作用后的形變抵抗力和回復(fù)性。在蠕變階段，Jmax值越大，代表面團(tuán)越柔軟；η0值越大，面團(tuán)在外力撤去時的流動性越高，越難以保持形狀。在恢復(fù)階段，J0和Jm分別代表面團(tuán)在恢復(fù)階段的彈性、黏性性能。由表4可知，隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)的最大蠕變?nèi)崃拷档?，零切變黏度不斷增加。與凍藏1 d面團(tuán)相比，凍藏30 d面團(tuán)的Jmax顯著降低，η0顯著增加，而凍藏30 d與凍藏60 d面團(tuán)的Jmax、η0無顯著性差異。在恢復(fù)階段，J0與J1均發(fā)生下降，說明隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)受到外力后的恢復(fù)力下降，面團(tuán)結(jié)構(gòu)受到破壞。

表4 不同凍藏時間下面團(tuán)蠕變恢復(fù)性曲線擬合后參數(shù)

2.4 凍藏時間對蛋白結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 凍藏時間對游離巰基含量的影響

面團(tuán)中的游離巰基可以用來表征面筋形成程度[17, 18]。凍藏時間對面團(tuán)中游離巰基含量影響顯著(圖2)。與對照組面團(tuán)相比，凍藏1、30、60 d面團(tuán)中游離巰基分別上升了1.18、2.99、4.85 μmol/L。不同凍藏時間面團(tuán)中游離巰基含量差異顯著。

圖2 不同凍藏時間面團(tuán)中游離巰基含量

2.4.2 凍藏時間對谷蛋白大聚體含量變化

谷蛋白大聚體(GMP)與面團(tuán)物理特性、面制品加工特性密切相關(guān)[19, 20]。面團(tuán)品質(zhì)的劣變與GMP的解聚有關(guān)[21]。凍藏過程中，面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量變化如圖3所示。隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量不斷降低。與對照組面團(tuán)相比，凍藏1、30、60 d面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量分別降低了0.41%、0.93%、1.35%。Graveland等[9]發(fā)現(xiàn)谷蛋白大聚體主要是通過二硫鍵交聯(lián)而成，面團(tuán)中GMP含量的變化趨勢與游離巰基含量變化趨勢相吻合(圖2)，說明在凍藏過程中GMP是以二硫鍵斷裂的方式發(fā)生解聚，并且凍藏時間越長，GMP解聚程度越大，面團(tuán)品質(zhì)下降越明顯。Zhao等[22]認(rèn)為谷蛋白大聚體的解聚可能是因為凍藏過程中冰晶不斷生長對面筋網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)造成破壞，而Bhatnager等[23]認(rèn)為除了冰重結(jié)晶帶來的機(jī)械損傷外，長時間凍藏會導(dǎo)致濃縮和低溫效應(yīng)，這也可能是導(dǎo)致GMP解聚的原因。

圖3 凍藏過程中面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量變化

2.4.3 凍藏時間對蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響

凍藏過程中面團(tuán)中蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化如表5所示。Georget等[12]認(rèn)為，蛋白二級結(jié)構(gòu)的變化可以反映蛋白質(zhì)聚集行為。面團(tuán)由1 d凍至60 d的過程中，α-螺旋結(jié)構(gòu)、β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別降低了3.69%、4.16%，β-折疊百分含量上升6.61%，而無規(guī)則卷曲變化無明顯規(guī)律。凍藏30 d時，β-折疊結(jié)構(gòu)含量顯著上升，繼續(xù)凍藏后，盡管β-折疊結(jié)構(gòu)含量繼續(xù)上升，但是上升幅度不顯著。這說明凍藏過程中，部分α-螺旋與β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變成了β-折疊結(jié)構(gòu)?？赡苁且驗殚L時間的凍藏改變了面團(tuán)內(nèi)部的水合環(huán)境，冰晶生長產(chǎn)生的機(jī)械力作用破壞了維持α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)的氫鍵，使二者形成小分子物質(zhì)，隨著面團(tuán)中自由水的不斷減少，這些小分子物質(zhì)為達(dá)到能量最低的狀態(tài)來維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定發(fā)生重排形成了β-折疊結(jié)構(gòu)[12, 24]。

表5 凍藏時間對面團(tuán)中蛋白二級結(jié)構(gòu)相對含量的影響

3 討論

凍藏過程中，面團(tuán)硬度上升，彈性、內(nèi)聚性下降，面團(tuán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性變差，受到外力后恢復(fù)性降低；通過分析面團(tuán)中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，面團(tuán)中游離巰基含量顯著增加，谷蛋白大聚體含量增加，二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)降低。根據(jù)前人研究[20]，面團(tuán)物理特性的降低可能與面團(tuán)中蛋白質(zhì)聚合程度、二級結(jié)構(gòu)α-螺旋降低有關(guān)，面團(tuán)質(zhì)地的變化與谷蛋白大聚體以及二硫鍵交聯(lián)程度相關(guān)。除此以外，面團(tuán)形成過程中，小麥淀粉與蛋白質(zhì)相互作用，促進(jìn)了面筋網(wǎng)絡(luò)的形成，其中淀粉顆粒通過吸水膨脹支持與強(qiáng)化面團(tuán)結(jié)構(gòu)，凍藏過程中，淀粉發(fā)生重結(jié)晶，加快了淀粉的老化速率，淀粉顆粒出現(xiàn)凍裂現(xiàn)象[25, 26]，這也可能是面團(tuán)特性發(fā)生改變的原因之一，還需要進(jìn)一步研究證實。

隨著凍藏時間的延長，面團(tuán)的硬度不斷增加，彈性、內(nèi)聚性不斷降低，該結(jié)果與Bhattacharya[3]、Rashidi[5]、Gailkwad等[6]研究結(jié)果一致。葉曉楓[27]發(fā)現(xiàn)，面團(tuán)彈性在凍藏至20 d時出現(xiàn)顯著降低(由0.92降至0.55)；Angioloni等[28]研究發(fā)現(xiàn)，對于面包面團(tuán)來說，面團(tuán)彈性在凍藏至30 d時出現(xiàn)明顯下降，但黏附性沒有明顯變化；而對于餅干面團(tuán)來說，面團(tuán)彈性在凍藏至45 d時出現(xiàn)明顯降低，但黏附性呈現(xiàn)持續(xù)增加的趨勢；但是Akbarian等[29]研究結(jié)果也得出，在56 d的凍藏期間，甜面團(tuán)黏附性不斷降低。這說明，在凍藏期間，不同用途冷凍面團(tuán)的質(zhì)構(gòu)特性變化上具有一定的差異，這可能與原料面粉中蛋白質(zhì)、淀粉等大分子物質(zhì)質(zhì)量特性有關(guān)，也可能與面團(tuán)制作過程中添加的配料不同有關(guān)。

對于面團(tuán)的流變學(xué)特性，本研究中隨著凍藏時間的增加，面團(tuán)彈性模量、黏性模量均不斷下降，并且在凍藏至30 d時彈性模量G′出現(xiàn)顯著降低。李杰平等[30]研究湯包皮面團(tuán)流變特性則發(fā)現(xiàn)，在-18 ℃凍藏至21 d時，湯包皮的G′與G″均出現(xiàn)顯著降低，而在-30 ℃凍藏時，二者在凍藏至7 d時就已經(jīng)出現(xiàn)了明顯的下降。葉曉楓等[27]也發(fā)現(xiàn)，凍藏至15 d，面團(tuán)G″明顯降低，但凍藏至20 d時，面團(tuán)G′才出現(xiàn)顯著降低。以上結(jié)果中，面團(tuán)的流變特性都在凍藏30天內(nèi)出現(xiàn)較為明顯的變化，因此該時間點可能是凍藏時間的關(guān)鍵控制點。

隨著凍藏時間的增加，面團(tuán)中GMP含量不斷降低，游離巰基含量不斷增加。該結(jié)果與Wang等[31]研究結(jié)果一致。前人認(rèn)為，冰晶的形成以及水分的遷移是GMP解聚的主要原因，但目前還沒有直接證據(jù)可以證明這一觀點。因此，凍藏過程中谷蛋白大聚體分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的具體機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。凍藏過程中，面團(tuán)中蛋白質(zhì)分子構(gòu)象發(fā)生改變，主要由α-折疊、β-轉(zhuǎn)角向β-折疊轉(zhuǎn)化，姬成宇等[32]有類似的結(jié)論。李學(xué)紅等[33]研究了凍藏時間對麥谷蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，雖然與本研究結(jié)論相似，但是麥谷蛋白凍藏至28 d時β-折疊增加了22%，而α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角分別降低了12.5%、9.5%；王沛[34]則研究了凍藏時間對面筋蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果顯示凍藏至30 d時β轉(zhuǎn)角與β-折疊分別上升了3.24%、6.74%，α-螺旋下降了10.47%。由此可見，凍藏對于蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響隨著面團(tuán)體系的不同而存在明顯差異，但是在蛋白單體中變化程度更為明顯。這可能是因為面團(tuán)是一個復(fù)雜的混合體系，其內(nèi)部各種物質(zhì)之間可能形成了更多的非共價鍵，從而使蛋白二級結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，但這還需要進(jìn)一步的研究驗證。

4 結(jié)論

凍藏時間對非發(fā)酵面團(tuán)具有顯著影響；在凍藏過程中，面團(tuán)硬度增加，彈性、內(nèi)聚性、黏附性、咀嚼度降低；彈性模量G′與黏性模量G″均呈下降趨勢；面團(tuán)在蠕變階段最大蠕變?nèi)崃縅max降低，零切變黏度η0增加，恢復(fù)階段，瞬間蠕變?nèi)崃縅0與遲滯蠕變?nèi)崃縅m均有所下降；面團(tuán)中谷蛋白大聚體含量顯著下降，游離巰基含量顯著上升，蛋白二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋、β-轉(zhuǎn)角向β-折疊進(jìn)行了轉(zhuǎn)變?？傊?，凍藏過程中非發(fā)酵面團(tuán)品質(zhì)不斷下降，并且在30 d內(nèi)品質(zhì)下降最為顯著。