美洲大蠊提取物Ento-A對大鼠急性胃黏膜損傷的保護(hù)作用

羅榮耀，張晶娜，偰 棲，馬旋壘，劉勝帥，李 玥，何 苗

(1.大理大學(xué)藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院 云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心 中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671000 ； 2.大理白族自治州人民醫(yī)院藥劑科，云南 大理 671000)

美洲大蠊(PeriplanetaamericanaL.)俗稱蟑螂，具有增強(qiáng)免疫、促進(jìn)血管增生、組織修復(fù)、抗炎消腫等作用[1-2]。以美洲大蠊為原料制成的康復(fù)新液，臨床應(yīng)用顯示，能促進(jìn)新生肉芽組織增長，加速病損組織修復(fù)，同時促進(jìn)創(chuàng)面血液循環(huán)，增強(qiáng)創(chuàng)面免疫力，對酒精性胃黏膜損傷具有明顯的保護(hù)作用[3]。急性胃炎是消化內(nèi)科常見的消化道疾病，生活中過度飲酒及阿司匹林等非甾體類藥物的不合理應(yīng)用是其常見的外源性引發(fā)因素，其病理改變在胃黏膜處常表現(xiàn)為水腫、充血、出血及糜爛甚至潰瘍等[4]。本試驗(yàn)采用80%乙醇與20 mg/mL水楊酸鈉溶液等體積的混合液灌胃建立大鼠急性胃炎模型，考察新工藝制備的美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃炎胃黏膜的保護(hù)作用及其機(jī)制，為其應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量250～300 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)：清潔級，室溫16～22 ℃，相對濕度60%，自由飲食。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊提取物Ento-A(大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院制備，批號：20160901)；西咪替丁(昆藥集團(tuán)股份有限公司，批號：171003-6)；康復(fù)新液(四川好醫(yī)生攀西藥業(yè)股份有限責(zé)任公司，批號：13170705)；無水乙醇(天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號：20160312)；水楊酸鈉(廣東汕頭市西隴化工廠，批號：0210151)；ELISA試劑盒(前列腺素：PGE2，批號：20180201；環(huán)氧合酶：COX-2，批號：20180201C；反應(yīng)蛋白：CRP，批號：20180201；轉(zhuǎn)化生長因子：TGF-β1，批號：20180205)，均購自南京建成生物工程研究所；氯化鈉注射液(貴州天地藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：A15022001)。

1.3 試驗(yàn)儀器 臺式冷凍離心機(jī)(上海離心機(jī)機(jī)械研究所，型號：TL-16R)；紫外可見光分光光度計(北京普析通用有限公司，型號：T-6新世紀(jì))；電子天平(梅特勒-托利多儀器有限公司，型號：ML204/02)；酶標(biāo)儀(奧地利安圖斯公司，型號：201型)；渦旋儀(海門市其林貝爾制造有限公司，型號：VORTFX-5)。

2 方法

2.1 美洲大蠊提取物Ento-A的制備 美洲大蠊藥材5 kg，粉碎，加水50 L，室溫浸泡過夜，在95 ℃下回流提取3次，每次3 h；收集提取液，過濾，濃縮至相對濃度為1.10～1.20 g/mL；加入95%乙醇，調(diào)節(jié)含醇量至50%～70%，攪拌30 min，靜置48 h，過濾，回收乙醇，濃縮至相對濃度為1.05～1.10 g/mL，冷藏庫放置24 h，棄去上層油脂，下層溶液過濾，濾液減壓濃縮至稠膏。

2.2 分組給藥及造模 將48只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、西咪替丁組[100 mg/(kg·bw)]、康復(fù)新液組[3 mL/(kg·bw)]、美洲大蠊提取物Ento-A低劑量組[150 mg/(kg·bw)]、高劑量組[300 mg/(kg·bw)]，共6組，每組8只。各組大鼠分別灌胃給予相應(yīng)藥物，正常對照組與模型對照組給予生理水[3 mL/(kg·bw)]，每天1次，連續(xù)給藥8 d。末次給藥前24 h，禁食不禁水，給藥90 min后，各組灌胃給予80%乙醇與20 mg/mL水楊酸鈉溶液等體積混合液(1 mL/100 g)，正常對照組以生理鹽水代替造模劑平行操作。

2.3 動物處理 造模1 h后，10%水合氯醛麻醉大鼠，剖檢，腹主動脈采血，4 ℃下靜置4 h，3 500 r/min離心10 min，取上層血清檢測COX-2、PGE2、CRP的含量。取出胃，沿胃大彎剪開胃壁，用生理鹽水清洗胃內(nèi)容物，觀察胃炎發(fā)生情況，將胃組織橫向剪取一半稱重，制成10%組織勻漿液，3 500 r/min離心10 min，取上清液檢測TGF-β1含量，另一半胃組織用10%福爾馬林固定，制作病理切片，參照國家食品藥品監(jiān)督管理局(CFDA)頒布的保健食品“對胃黏膜損傷有輔助保護(hù)功能評價方法”項(xiàng)下的鏡下評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行病理組織學(xué)評分[5]。評分方法：以充血、出血、黏膜細(xì)胞變性壞死在整個黏膜上皮層的累積程度分為五級。充血權(quán)重為1，出血權(quán)重為2，上皮細(xì)胞變性壞死權(quán)重為3，評分標(biāo)準(zhǔn)如表1所示，按照公式“病變總積分=充血積分+出血積分×2+上皮細(xì)胞變性壞死積分×3”計算胃黏膜病變總積分。

3 結(jié)果

表1 急性胃黏膜損傷鏡下評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Scorig standard on acute gastric mucosal injury in rats under microscope

3.1 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃炎肉眼觀察的影響 正常對照組大鼠胃黏膜呈粉紅色，有光澤；模型對照組大鼠胃黏膜色澤暗紅，充血明顯，胃竇部黏膜可見程度不同的點(diǎn)狀或灶狀糜爛；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復(fù)新液組、美洲大蠊提取物Ento-A各劑量組胃黏膜呈粉紅色，水腫和充血現(xiàn)象不同程度改善。結(jié)果如中插彩版圖1所示。

3.2 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠血清生化指標(biāo)的影響 與正常對照組比較，模型對照組血清PGE2、COX-2、CRP的含量顯著升高(P<0. 01)；與模型對照組比較，康復(fù)新液組、西咪替丁組及Ento-A各劑量組血清COX-2、PGE2、CRP的含量顯著降低(P<0. 01)。結(jié)果如圖2所示。

圖2 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠血清PGE2、COX-2、CRP的含量的影響Fig 2 Influence of Ento-A on levels of PGE2,COX-2,CRP in rats serum of acute gastric mucosal injuryA：正常對照組； B：模型對照組； C：西咪替丁組； D：康復(fù)新組； E：Ento-A低劑量組; F：Ento-A高劑量組；下圖同A:Normal control group; B:Model control group; C:Cimetidine group; D:Kang Fu-xin group; E:Ento-A low dose group; F:Ento-A high dose group. The same as below與正常對照組比較，*：P<0. 05，**：P<0. 01；與模型對照組比較，#：P<0. 05，##：P<0. 01；下圖同Compared with normal control group,*:P<0. 05,**:P<0. 01; Compared with model control group,#:P<0. 05,##:P<0. 01. The same as below

3.3 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠胃組織TGF-β1的影響 與正常對照組比較，模型對照組TGF-β1顯著降低(P<0. 01)；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復(fù)新液組、Ento-A各劑量組TGF-β1含量升高(P<0. 01或P<0. 05)，且Ento-A 高劑量對TGF-β的影響與西咪替丁相當(dāng)。結(jié)果如圖3所示。

圖3 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠胃組織TGF-β1的含量的影響Fig.3 Influence of Ento-A on TGF-β1 level in tissue in rats of acute gastric mucosal injury

3.4 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠的胃組織病理學(xué)評分 正常對照組大鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)層次清楚，腺體排列整齊，無充血及出血現(xiàn)象；模型對照組大鼠胃組織表皮上層有明顯損傷，黏膜層充血，可見大量紅細(xì)胞于血管外聚集，出血嚴(yán)重；黏膜上層腺體結(jié)構(gòu)紊亂或壞死；各給藥組大鼠胃組織損傷情況不同程度改善。與正常對照組比較，模型對照組充血、出血、上皮細(xì)胞變性壞死評分及病變總積分顯著升高(P<0.01)；與模型對照組比較，西咪替丁組、康復(fù)新液組、Ento-A各劑量組充血、出血、上皮細(xì)胞變性壞死評分及病變總積分顯著降低(P<0. 01)。Ento-A各劑量組對大鼠胃組織病變的作用與西咪替丁相當(dāng)。評分結(jié)果如圖4所示，各組大鼠胃病理切片圖如中插彩版圖5所示。

圖4 美洲大蠊提取物Ento-A對急性胃黏膜損傷大鼠的胃組織病理學(xué)評分的影響Fig.4 Influence of Ento-A on pathological score on gastric tissue in rats of acute gastric mucosal injury

4 討論

水楊酸等非甾體類抗炎藥可抑制環(huán)氧化酶，削弱胃黏膜屏障，抑制胃上皮碳酸鹽分泌，減弱胃黏膜的修復(fù)和更新，可進(jìn)一步減少肉芽組織的生長，使?jié)冇涎舆t；另外還可抑制氧化磷酸化過程，使ATP產(chǎn)生減少，引起黏膜通透性增加，促進(jìn)對酒精的吸收。高濃度的酒精被胃黏膜吸收后，破壞胃黏膜屏障，引起黏膜急性損傷，包括出血、水腫、上皮損傷和炎性細(xì)胞浸潤等，進(jìn)一步引起大鼠胃黏膜上皮各類細(xì)胞不同程度地變性、壞死，間質(zhì)血管瘀血等[6]。本試驗(yàn)中模型對照組胃黏膜色澤暗紅，充血明顯，胃竇部黏膜呈程度不同的點(diǎn)狀或灶狀糜爛情況，由此驗(yàn)證急性胃炎模型制備成功。

COX-2為誘導(dǎo)型環(huán)氧合酶，在正常組織中多不表達(dá)，當(dāng)身體組織受到某種刺激如外傷、感染等時，會被激活并由炎癥部位組織細(xì)胞迅速合成，其也是前列腺素合成過程中重要的限速酶[7]；PGE2為后炎癥因子，在組織正常生理狀態(tài)下含量很低，急性炎癥時COX-2增高可促進(jìn)PGE2的表達(dá)，兩者均為引發(fā)急性炎癥的重要因子，共同參與炎癥的病理過程[8-9]。CRP可靈敏地反應(yīng)機(jī)體炎癥活動，其升高可以提示炎癥組織的大小或活動性，當(dāng)機(jī)體受到炎癥反應(yīng)刺激時，肝細(xì)胞便迅速合成分泌大量的CRP，從而引起血清CRP濃度急劇上升[10]。本試驗(yàn)中，Ento-A各劑量組COX-2、PGE2及CRP的表達(dá)均顯著降低，提示美洲大蠊提取物可通過抑制炎性因子分泌，減輕炎癥反應(yīng)，從而降低了急性炎癥對胃黏膜組織的損傷程度。TGF-β1是一種重要的具有較強(qiáng)抗炎作用的多效細(xì)胞因子，機(jī)體炎癥時可趨化成纖維細(xì)胞和炎癥細(xì)胞向傷口聚集，促進(jìn)成纖維細(xì)胞大量合成膠原蛋白，誘導(dǎo)創(chuàng)面底部小血管的內(nèi)皮細(xì)胞的增生、分裂，誘導(dǎo)肉芽組織生長和表皮形成[11]。本試驗(yàn)中，Ento-A各劑量組TGF-β1組織水平均顯著升高，提示美洲大蠊提取物能通過增強(qiáng)胃黏膜再生和修復(fù)的潛力，從而增加胃黏膜對外來刺激因子的抵抗力，一定程度上減輕急性炎癥時胃壁黏膜的損傷程度。

綜上所述，美洲大蠊提取物Ento-A可能是通過調(diào)控炎癥反應(yīng)因子PGE2、COX-2、CRP及TGF-β1的表達(dá)水平，來提高胃黏膜上皮對外來刺激的免疫力，最終在急性胃炎發(fā)生時表現(xiàn)出對胃黏膜的保護(hù)作用。