氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片的質量標準研究

顏國慶，徐楊峰，彭健波，鄧銳涵，吳莉芩，陳海蘭,2，黃宏業(yè)，何家康,2

(1.廣西大學動物科學技術學院，廣西 南寧 530005 ； 2.廣西獸藥制劑工程技術研究中心，廣西 南寧 530003 ； 3.廣西北斗星動物保健品有限公司，廣西 南寧 530003)

氟尼辛葡甲胺(Flunixin meglumine，F(xiàn)M)是一種動物專用的非甾體抗炎藥(Nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs)，具有良好的抗炎、解熱和鎮(zhèn)痛效果，在國內外已被廣泛應用于牛、馬、豬、犬、貓等動物的解熱、肌肉疼痛、關節(jié)炎等病癥[1]。

氟尼辛葡甲胺廣泛應用于獸醫(yī)臨床[2-4]，但其劑型較為單一，主要以顆粒劑、注射劑為主。氟尼辛葡甲胺具有較強的刺激性氣味和苦味，動物口服適口性差，因此研制掩味口服制劑有重要意義。氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片是本課題組利用熱熔擠出技術制備FM掩味固體分散體，經(jīng)制粒后加以輔料通過直接壓片法制備而成的片劑，解決了普通口服制劑動物的順應性差、傳統(tǒng)的注射劑對注射部位刺激性大等問題[5]。為科學有效的控制產(chǎn)品質量，保證臨床療效，本試驗參照《中華人民共和國獸藥典》、《獸藥研究技術指導原則匯編》(2006-2011年)等[6-7]，對氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片建立了薄層鑒別、崩解時限、重量差異、脆碎度、溶出度、含量測定等考察項目的檢查方法，為氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片質量標準的制定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設備 高效液相色譜儀：Waters e2695，美國Waters公司；紫外分光光度計：UV-1750，日本島津公司；智能溶出試驗儀：ZRS-8LD、脆碎度儀：FT-2000SE、智能崩解儀：ZBS-6E，天津天大天發(fā)科技有限公司；全自動薄層板器：939，重慶南岸貝爾德儀器技術廠；電子天平：EL204，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；色譜柱：Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，美國Waters公司。

1.1.2 主要試劑 氟尼辛葡甲胺對照品(98%，批號：H0611604)，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；磷酸二氫鉀、甲苯、乙酸乙酯、醋酸鈉、冰醋酸、鹽酸、硝酸、氯化鈣 (CaCl2·2H2O)、氯化鎂(MgCl2·6H2O)、氯化鈉(NaCl)、碳酸鉀(K2CO3·1.5H2O)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4·7H2O)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4·H2O)、異丙醇，均為分析純，均購自成都科龍化工試劑公司；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)，均購自美國ThermoFisher Scientific公司。

1.1.3 試驗藥物 3批FM掩味口腔崩解片樣品(批號：20170308、20170315和20170322)，400 mg/片(約相當于氟尼辛20 mg)，經(jīng)熱熔擠出掩味技術-直接壓片法制備而得，為本實驗室自制。

1.2 方法

1.2.1 鑒別方法

1.2.1.1 氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片的鑒別 稱量本品適量(約相當于氟尼辛25 mg)，研磨成粉末，置于50 mL離心管中，加磷酸鹽緩沖液(取無水醋酸鈉4.1 g，加水500 mL使溶解，加冰醋酸2.9 mL，用水稀釋至1 000 mL，搖勻，即得)10 mL，振搖，再加入乙酸乙酯25 mL，振搖，靜置分層，取上層清液作為供試品提取液。此外，取氟尼辛葡甲胺對照品，加甲醇制成每1 mL含1.5 mg氟尼辛葡甲胺的對照品溶液。按照薄層色譜法試驗，吸取10 μL上述溶液，分別點于同一硅膠GF254薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸-水(65∶30∶10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈(254 nm)下檢視。

1.2.1.2 專屬性考察 配制缺氟尼辛葡甲胺的陰性樣品，按照標準規(guī)定的薄層鑒別檢測，考察該方法的專屬性。

1.2.1.3 重復性考察 取3批氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片樣品，進行薄層鑒別檢測，考察該方法的重復性。

1.2.2 崩解時限檢查 按照相關規(guī)定，采用改良崩解儀法測定：取本品1片，置崩解儀中進行檢查，應在60 s內全部崩解并通過篩網(wǎng)，但無硬心者，可作符合規(guī)定論。重復測定6片，均應符合規(guī)定。如有1片不符合規(guī)定，應另取6片復試，均應符合規(guī)定。

1.2.3 重量差異檢查[6]精密稱定樣品20片，計算重量差異限度。每片重量與平均片重比較，平均片重或表示片重在0.30 g以下，重量差異限度應在±7.5%以內；0.30 g及0.30 g以上，重量差異限度應在±5%以內。超出重量差異限度的不得多于2片，并不得有1片超出限度1倍。

1.2.4 脆碎度檢查[6]稱取樣品片約為6.5 g，吹風機吹去粉末，精密稱重，置圓筒中，轉動100次。取出，吹去粉末，精密稱重，減失重量不得過1%，且不得檢出斷裂、龜裂及粉碎的片，計算樣品脆碎度。

1.2.5 溶出度檢查

1.2.5.1 溶出介質的制備 人工唾液：取氯化鈣 0.228 g，氯化鎂 0.061 g，氯化鈉 1.017 g，碳酸鉀 0.603 g，磷酸氫二鈉 0.204 g，磷酸二氫鈉 0.273 g，加水800 mL溶解后，用鹽酸調節(jié)pH值至6.8，用水稀釋至1 000 mL，即得；pH值4.5的醋酸緩沖液：取醋酸鈉2.99 g，加水500 mL溶解后，加入2 mol/L醋酸溶液14.0 mL，用水稀釋至1 000 mL，即得。

1.2.5.2 溶出度標準曲線的制備 精密稱取FM對照品52.12 mg，用適量超純水溶解后，轉移至50 mL容量瓶中，并以超純水稀釋至刻度，即得1 mg/mL的對照品貯備液，備用。用介質將氟尼辛葡甲胺對照品貯備液稀釋成一系列標準工作液。然后以介質為空白對照，以紫外-可見光分分光度法在282 nm處測定吸光度，每個濃度設3個重復，以吸光度為橫坐標，濃度為縱坐標，進行線性回歸。

1.2.5.3 溶出度條件的設定 緩沖液中溶出度：pH值4.5的醋酸緩沖液900 mL，注入溶出杯中，溫度保持(37±0.5)℃，轉速100 r/min。稱取本品適量(約相當于氟尼辛12.5 mg)，投入轉籃中，于5 min、10 min、20 min、30 min、50 min、60 min、90 min、120 min取樣，取樣經(jīng)0.8 μm微孔水相濾膜過濾，平行3次。以pH值4.5的醋酸緩沖液為空白對照，于紫外282 nm波長處測定樣品吸光度。

人工唾液中溶出度：人工唾液300 mL，注入溶出杯中，溫度保持(37±0.5)℃，轉速100 r/min。稱取本品適量(約相當于氟尼辛12.5 mg)，每隔10 s取樣至1 min，經(jīng)0.8 μm微孔水相濾膜過濾，平行3次。以人工唾液為空白對照，于紫外282 nm波長處測定樣品吸光度。

1.2.5.4 溶出度計算 將各個樣品的吸光度帶入標準曲線，吸光度超出標準曲線的范圍，則用相應介質將樣品稀釋后再測定吸光度，計算FM的累積溶出百分比。

1.2.6 含量測定

1.2.6.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex luna C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；紫外檢測器，檢測波長：282 nm；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇∶0.1%磷酸二氫鉀溶液=80∶20(V∶V)；流速:1.0 mL /min；進樣量：20 μL。

1.2.6.2 對照品藥液的制備 稱取氟尼辛葡甲胺52.12 mg，置于50 mL容量瓶中，用超純水溶解并稀釋至刻度，制成1 mg/mL對照品貯備液。

1.2.6.3 供試品溶液的配制 稱取本品適量(約相當于氟尼辛葡甲胺10 mg)，并研磨成粉，置于100 mL容量瓶中，加入適量流動相，超聲溶解15 min，取出，放冷，用流動相稀釋至刻度，即得。

1.2.6.4 陰性樣品液的制備 按處方10倍量稱取空白輔料，按照供試品溶液配制方法，制備陰性樣品液。

1.2.6.5 方法的專屬性 取對照品藥液、供試品溶液、陰性樣品液按色譜條件測定，考察方法專屬性。

1.2.6.6 標準曲線的制作和線性關系的考察 精密吸取適量對照品藥液，用流動相稀釋制成一系列濃度的工作液，按照色譜條件進行高效液相色譜測定，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，進行線性回歸，繪制氟尼辛葡甲胺標準曲線，考察氟尼辛葡甲胺在規(guī)定范圍內的線性關系。

1.2.6.7 精密度試驗 重復性試驗：取同一批樣品6份，照供試品溶液配制方法制備，按照色譜條件測定，記錄峰面積，計算相對標準偏差RSD(%)。中間精密度試驗：于同一實驗室由不同人員用不同設備完成樣品測定。

1.2.6.8 加樣回收率試驗 稱取已知含量的片劑適量，充分研碎，置于100 mL容量瓶中，加入已知濃度對照品溶液適量，按供試品制備方法處理，按照色譜條件測定，計算加樣回收率和相對標準偏差(%)。

1.2.6.9 穩(wěn)定性試驗 取同一批號的氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片樣品，按1.2.6.3下方法制備供試品溶液，分別在0、4、8、12、16、20 h和24 h進樣20 μL，考察其穩(wěn)定性。

1.2.6.10 樣品測定 取3批氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片樣品，按色譜條件測定，計算氟尼辛葡甲胺含量。

2 結果

2.1 氟尼辛葡甲胺的薄層鑒別 3批氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片，按標準規(guī)定的薄層鑒別方法檢測，結果顯示，3批供試品色譜與FM對照品色譜相應位置上，顯相同顏色的熒光斑點，而配制的缺FM的陰性樣品無干擾，薄層色譜圖見圖1。

圖1 氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片中氟尼辛葡甲胺薄層色譜圖Fig. 1 The thin layer chromatogram of FM identification on FM ODT1：FM對照品； 2：陰性樣品； 3：供試樣品(批號：20170308)；4：供試樣品(批號：20170315)； 5：供試樣品(批號：20170322)1：The standard of FM; 2：Negative sample; 3：Test sample (Batch number:20170308); 4：Test sample (Batch number:20170315); 5：Test sample (Batch number:20170322)

2.2 崩解時間檢查 取3批樣品，進行崩解時間檢查。3批樣品的崩解時間分別為(17.52±1.44)s、(16.58±1.73)s、(18.13±1.02)s，均小于30 s，結果符合規(guī)定。

2.3 重量差異檢查 取3批樣品，進行重量差異檢查。3批樣品重量差異結果分別為(2.72±1.02)%、(3.13±1.12)%、(3.13±1.14)%，均小于重量差異限度±5%，結果符合規(guī)定。

2.4 脆碎度檢查 取3批樣品，進行脆碎度檢查。3批樣品的脆碎度分別為(0.88±0.08)%、(0.87±0.06)%、(0.82±0.02)%，均小于1%，結果符合規(guī)定。

2.5 溶出度檢查 取3批樣品，進行溶出度檢查?？诒榔谌斯ね僖褐?0 s內溶出低于10%(圖2)，在pH值4.5緩沖液中10 min內溶出超過80%(圖3)，表明氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片具有掩味效果及速釋特性。

圖2 制劑在人工唾液中的溶出度Fig. 2 Dissolution of the FM taste-masked ODTs in artificial saliva

圖3 制劑在pH值4.5緩沖液中的溶出度Fig. 3 Dissolution of the FM taste-masked ODTs in pH 4.5 buffer solution

2.6 含量測定

2.6.1 專屬性試驗 結果表明，供試品溶液中FM與相鄰峰的分離度良好，氟尼辛葡甲胺的測定無干擾(圖4)。

2.6.2 標準曲線的制作 氟尼辛葡甲胺回歸方程(圖5)為y=48 647x-56 582，R2=0.999 8，在24.5～245 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.6.3 精密度試驗

2.6.3.1 重復性試驗 樣品中藥物的平均含量為4.97%，RSD為0.04%，儀器精密度良好。

2.6.3.2 中間精密度試驗 樣品中藥物的平均含量為4.90%，RSD為2.44%，儀器精密度良好。

圖4 系統(tǒng)適應性試驗及方法專屬性考察色譜圖Fig. 4 The chromatogram of system suitability test and method specificityA：FM對照品； B：陰性樣品； C：氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片供試品溶液A:The standard of FM； B:Negative sample； C:Test sample

圖5 氟尼辛葡甲胺標準曲線Fig. 5 The standard curve of FM

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 24 h內氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片供試品中藥物的平均含量為4.90%，RSD為1.29%。結果表明，供試品溶液在室溫下24 h內穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗 結果如表1。氟尼辛葡甲胺平均回收率為99.45%，RSD為0.58%(n=6)。結果表明方法準確度良好。

2.6.6 樣品測定 3批氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片樣品含量測定見表2。201703008、20170315、20170322三個批次樣品的含量分別為(4.876±0.102)%、(4.959±0.066)%和(4.960±0.053)%。

表1 加樣回收率試驗結果Table 1 The results of sample recovery rate test (%,n=6)

表2 3批氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片的含量Table 2 The content of three batches sample of FM taste-masking ODT (%,Mean±SD，n=6)

3 討論

3.1 高效液相色譜條件的確定 對氟尼辛葡甲胺對照品的紫外吸收光譜(200～400 nm)測定結果表明，F(xiàn)M在281.5 nm處有最大吸收，為了保證靈敏性，色譜波長選擇282 nm。其他色譜條件參照《中華人民共和國獸藥典》(2015年版一部)[6]收載的氟尼辛葡甲胺的含量測定方法，進行多次的篩選、驗證，最終確定上述色譜條件。結果顯示，在該色譜條件下，氟尼辛葡甲胺色譜峰分離度良好，且陰性樣品色譜圖相同保留時間中未出現(xiàn)干擾峰。

3.2 氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片的重點考察項目 口腔崩解片主要的質控標準為崩解時限和溶出度[8]，因此，根據(jù)本試驗片劑的掩味、速釋效果和口腔崩解等特性，擬定了薄層鑒別、崩解時限、重量差異、脆碎度、溶出度、含量測定考察項目并建立了相應的檢查方法。其中溶出度和崩解時限項目同普通片劑檢查方法略有不同。

本制劑為掩味口腔崩解片，目的是使藥物在口腔中盡量少溶解達到掩味效果，而在胃腸道中盡量快溶解以快速發(fā)揮效果，但是主藥氟尼辛葡甲胺在酸性環(huán)境中屬于微溶狀態(tài)，且輔料Eudragit?E PO在小于pH值為5的溶液中會形成鹽而迅速溶解，因此參考相關文獻[7,9-11]對氟尼辛葡甲胺掩味口腔崩解片在人工唾液和pH值4.5緩沖液的溶出度進行考察，體外溶出度結果表明本制劑具有掩味特性，但要最終確定該片劑的掩味效果，仍需進行電子舌、志愿者和動物試驗等方面的評價。

對于崩解時限，目前口腔崩解片的崩解時間的測定尚沒有法定的標準方法。本試驗參閱相關文獻[12-14]，對不同測定方法進行比較，其中改良崩解儀法有標準儀器，重現(xiàn)性好且易于操作，因此最終選擇改良崩解儀法作為崩解時間的測定方法。結果表明，本制劑崩解迅速，崩解時限滿足口腔崩解片的要求。