3株豬源多動(dòng)物鏈球菌的分離與鑒定

王麗揚(yáng)，王鉉皓，許倩倩，高 尚，王鵬勇，王彥紅

(1. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009 ； 2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

多動(dòng)物鏈球菌(Streptococcuspluranimalium,SP)最早由Devriese(1999年)從患有隱性乳房炎的奶牛,及奶牛的生殖道、扁桃體, 金絲雀的嗉囊、呼吸道,以及綿羊和貓的扁桃體中分離[1]，經(jīng)過(guò)分離鑒定確認(rèn)其為鏈球菌中的新種。這種新的鏈球菌還被發(fā)現(xiàn)與小牛腦膜炎相關(guān)，可能是敗血癥的后遺癥[2]。也有相關(guān)研究指出，多動(dòng)物鏈球菌可以引起肉雞的心內(nèi)膜炎和敗血癥[3]。眾多臨床病例表明，這種新的鏈球菌主要感染動(dòng)物為牛和家禽，尚未出現(xiàn)有關(guān)豬感染該鏈球菌的報(bào)道，2018年不同時(shí)間，從揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物醫(yī)院就診的病例中分離出3株細(xì)菌，因此，對(duì)豬源多動(dòng)物鏈球菌的生化、生物學(xué)特性進(jìn)行相關(guān)研究，為進(jìn)一步對(duì)其流行病學(xué)、免疫與防治的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病例背景 2018年3月，江蘇省揚(yáng)州儀征某豬場(chǎng)共飼養(yǎng)了200頭60日齡的豬，出現(xiàn)幾頭死亡，送檢1頭病死豬來(lái)剖檢，該豬生前出現(xiàn)呼吸道癥狀，10多天后即死亡，死前皮膚發(fā)紫，口中流有鼻涕。剖檢可見(jiàn)肺臟實(shí)變，有結(jié)節(jié)，鼻腔、氣管內(nèi)含有大量濃稠分泌物。

2018年5月，揚(yáng)州江都某豬場(chǎng)送檢仔豬1頭，該豬場(chǎng)共飼養(yǎng)了600頭母豬，所產(chǎn)仔豬為3～5日齡，幾乎每窩均有發(fā)病，病豬主要表現(xiàn)為水樣腹瀉、消瘦、脫水死亡，病程3～5 d。剖檢可見(jiàn)腎臟呈點(diǎn)狀出血。

2018年9月，淮安洪澤送檢病死仔豬1頭，該豬場(chǎng)共飼養(yǎng)了80頭母豬，產(chǎn)仔前后母豬仔豬均表現(xiàn)正常，斷奶后至3月齡之間出現(xiàn)死亡，7～9月份陸續(xù)死亡200頭。剖檢可見(jiàn)心肌外膜有較多纖維素附著，肝臟稍腫、腎出血與貧血相交替，脾小端梗死，腸系膜淋巴結(jié)水腫，肺淤血、水腫。

1.2 培養(yǎng)基 瓊脂粉與氯化鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；綿羊血，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。綿羊血平板按照通用組方自行配制。

1.3 主要試劑 本試驗(yàn)所用生化鑒定管和藥敏試紙片，均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司。16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)6周齡BALB/c小鼠8只，雌雄各半，健康狀態(tài)良好,購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心。

1.5 主要儀器 超凈工作臺(tái)(型號(hào)為SW-CJ-IL)，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；恒溫培養(yǎng)箱(型號(hào)為GNP9080)，購(gòu)自上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；DNA擴(kuò)增儀(型號(hào)為4484073)，購(gòu)自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司；奧林巴斯CX系列生物顯微鏡(型號(hào)為CX21FS1C)，購(gòu)自?shī)W林巴斯(廣州)工業(yè)有限公司；凝膠電泳儀(型號(hào)為DYCP-31DN)，購(gòu)自北京六一生物科技有限公司。

1.6 細(xì)菌分離 分別取3例病豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、皮下水腫液無(wú)菌接種于血瓊脂平板(含5%綿羊血)，于37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。24 h后無(wú)菌挑取血瓊脂平板上的單個(gè)菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，再挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢。

1.7 生化試驗(yàn) 無(wú)菌挑取分離菌的純培養(yǎng)物分別接種于乳糖、蔗糖、麥芽糖、甘露醇等一系列生化反應(yīng)管中并置于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察結(jié)果。

1.8 16S rDNA鑒定 通過(guò)煮沸裂解法制備3株分離菌的DNA模版，按照寶生物工程(大連)有限公司16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，將剩余的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技公司測(cè)序。

1.9 小鼠攻毒試驗(yàn) 將8只小鼠分為2組，每組4只，雌雄各半，第1組用于攻毒，第2組作為對(duì)照。取1株細(xì)菌搖菌過(guò)夜，菌液濃度約為7×108CFU/mL，小鼠腹腔注射0.4 mL。對(duì)照組每只腹腔注射0.4 mL生理鹽水。置于溫暖舒適的室內(nèi)，給予相同鼠糧及飲水，觀察小鼠狀態(tài)。

1.10 藥敏試驗(yàn) 采用常規(guī)藥敏紙片擴(kuò)散法，無(wú)菌操作將3株分離菌的純培養(yǎng)物均勻涂抹于血平板上并置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。藥敏紙片有：美洛西林(75 μg/片)、復(fù)方新諾明(23.75 μg/片)、氟苯尼考(30 μg/片)、環(huán)丙沙星(5 μg/片)、慶大霉素(10 μg/片)、丁胺卡那霉素(30 μg/片)、諾氟沙星(10 μg/片)、阿莫西林(20 μg/片)、多西環(huán)素(30 μg/片)、頭孢曲松(30 μg/片)、多黏菌素B(300 U/片)、頭孢哌酮/舒巴坦普生(75/75 μg/片)、左氧氟沙星(5 μg/片)、頭孢噻肟(30 μg/片)、新霉素(30 μg/片)、妥布霉素(10 μg/片)、鏈霉素(10 μg/片)、卡那霉素(30 μg/片)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離 3例病死豬的肝臟、肺臟、脾臟、腎臟及皮下水腫液無(wú)菌接種于血瓊脂平板，24 h后從第1例病死豬肺臟中分離出細(xì)菌，第2例從腎臟中分離到細(xì)菌，第3例從皮下水腫液中分離到細(xì)菌，均長(zhǎng)出邊緣整齊、濕潤(rùn)、不透明、乳白色的完全溶血小菌落(見(jiàn)中插彩版圖1)。將分離到的3株細(xì)菌分別編號(hào)為SP1、SP2、SP3。對(duì)純化后的菌落進(jìn)行革蘭染色后，在油境下觀察，分離菌株為革蘭陽(yáng)性球菌，呈鏈狀或團(tuán)塊狀排列(見(jiàn)中插彩版圖2)。

2.2 生化試驗(yàn) 分離菌株能夠發(fā)酵蔗糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇、七葉苷、纖維二糖，不能發(fā)酵阿拉伯糖、山梨醇、蜜二糖(表1)，與多動(dòng)物鏈球菌的生化特性基本一致。

表1 3株分離菌株的生化試驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of 3 isolates biochemical test

2.3 16S rDNA鑒定結(jié)果 將3株分離菌的DNA模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，均得到500 bp左右的目的條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物送至金斯瑞生物科技公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的多動(dòng)物鏈球菌CP022601.1具有99%的同源性，可確定分離菌株為多動(dòng)物鏈球菌。

2.4 小鼠攻毒試驗(yàn) 攻毒24 h后試驗(yàn)組中4只小鼠死亡，對(duì)照組正常。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢可發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)明顯，肝臟、脾臟、腎臟腫大，腹腔器官粘連，胸腔有滲出液(見(jiàn)中插彩版圖3)。采集肝臟制作觸片并進(jìn)行美藍(lán)染色，于顯微鏡下觀察可見(jiàn)大量鏈狀或團(tuán)塊狀的球菌，與分離菌鏡檢形態(tài)一致(見(jiàn)中插彩版圖4)。

2.5 藥敏試驗(yàn) 結(jié)果(見(jiàn)表2)顯示，該分離株對(duì)頭孢噻肟、鏈霉素、卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、多西環(huán)素8種藥物具有較強(qiáng)的耐藥性，對(duì)美洛西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉3種藥物敏感。

表2 3株分離菌藥敏結(jié)果Table 2 The results of 3 isolates drug susceptibility (mm)

3 討論

分別從送檢豬的肺、腎、皮下水腫液分離到了3株細(xì)菌，通過(guò)生化試驗(yàn)、16S rDNA鑒定得出3株分離菌為多動(dòng)物鏈球菌(SP)。多動(dòng)物鏈球菌作為一種新型致病菌，可以感染牛、綿羊、羊駝和野雞等多種動(dòng)物[4]。自首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，世界多地均有分離到該菌的報(bào)道，國(guó)內(nèi)也有從山羊鼻腔分泌物中分離到該菌報(bào)道[5]。而從豬的體內(nèi)分離到尚屬首次，從病例背景分析，這種細(xì)菌感染多見(jiàn)于幼齡豬。根據(jù)分離到菌株的部位也能發(fā)現(xiàn)這是一種能夠全身多臟器感染的致病菌。此外，多動(dòng)物鏈球菌也被發(fā)現(xiàn)與人類疾病相關(guān)，曾從人類硬膜下膿腫液中分離到該細(xì)菌[6]。類似鏈球菌感染人的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮，由此可以看出，多動(dòng)物鏈球菌具有潛在的跨物種傳播能力。目前有關(guān)多動(dòng)物鏈球菌的研究并不充分，也缺乏相應(yīng)的快速診斷技術(shù)[7]。因此，有必要進(jìn)一步研究多動(dòng)物鏈球菌的發(fā)病機(jī)理將有助于開(kāi)發(fā)預(yù)防和治療該細(xì)菌感染的策略。

經(jīng)過(guò)一系列藥敏試驗(yàn)分析，3株細(xì)菌均對(duì)鏈霉素、妥布霉素、卡那霉素、慶大霉素耐藥，這與氨基糖苷類抗生素自身特點(diǎn)有關(guān)，對(duì)革蘭陽(yáng)性菌的作用較弱相關(guān)，此外，也可能臨床大量使用此類藥物有關(guān)。另外發(fā)現(xiàn)該菌株對(duì)其他抗生素具有耐藥性，這就導(dǎo)致臨床上很多藥物治療無(wú)效，為了減少藥物的濫用以及避免耐藥性的產(chǎn)生，用藥時(shí)應(yīng)在藥敏試驗(yàn)的科學(xué)指導(dǎo)下正確的應(yīng)用，以免造成不必要的損失，對(duì)于本病的治療可根據(jù)藥敏結(jié)果作為參考，使用美洛西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉等藥物。