1例副雞禽桿菌和鼻氣管鳥桿菌混合感染的診斷

梅 晨，王琪琎，先 宏，張 雪，胡 偉，王宏俊

(北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 海淀 100097)

2019年3月，北京某蛋雞養(yǎng)殖場出現(xiàn)大量以流鼻涕、打噴嚏、面部腫脹和食欲下降等為主要癥狀的雞只，并且在雞群中呈現(xiàn)蔓延趨勢，初步懷疑為雞傳染性鼻炎。為確診病因，本試驗進行了病原菌的分離鑒定。在此過程中，我們同時分離到副雞禽桿菌(Avibacteriumparagallinarum，Apg)和禽鼻氣管鳥桿菌(Omithobacteriumrhinotracheale，ORT)。報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株和陽性血清 副雞禽桿菌、禽鼻氣管鳥桿菌標準菌株及副雞禽桿菌陽性雞血清，均由本研究室保存；禽鼻氣管鳥桿菌陽性分型血清由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)何誠教授惠贈。

1.1.2 病料 具有呼吸道癥狀病雞的雞頭，130日齡，來自北京某蛋雞養(yǎng)殖場。

1.1.3 主要試劑 TSA、TSB培養(yǎng)，均基購自BD公司；2×TaqPCR Mix，購自Genestar公司；16S rRNA引物，由深圳華大基因科技服務(wù)有限公司合成；藥敏紙片，購自O(shè)XOID公司。

1.1.4 主要儀器 168-1000XC酶標儀，為美國 BIO-RAD公司產(chǎn)品；DYY-6D電泳儀，為北京六一儀器廠產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 副雞禽桿菌與鼻氣管鳥桿菌的分離 75%酒精對送檢雞頭表面皮膚進行消毒處理?？粝赂]部位烙鐵燒燙后，用滅菌處理的手術(shù)刀片劃開，用無菌長棉簽沾取眶下竇中干酪樣物質(zhì)，均勻劃線涂在含有5%雞血清的TSA平板中，將平板置于燭缸，37 ℃厭氧培養(yǎng)24 h。次日，挑取單個代表性菌落進行傳代，連續(xù)傳代3次，直至長出大小形態(tài)均一的菌落。將分離到的菌落形態(tài)完全不同的2種細菌分別以適當(dāng)濃度涂于載玻片上，進行固定與革蘭染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察細菌的染色和形態(tài)特征。

1.2.2 2種分離菌的DNA提取及16S rRNA測序與比對 將純化后的副雞禽桿菌與鼻氣管鳥桿菌分別加入含10%血清及50 μg/mL NAD的TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，參照天根生化科技(北京)有限公司DNA細菌提取試劑盒操作步驟，提取細菌DNA并測定濃度。參考陳小玲等[1]設(shè)計的細菌16S rRNA上下游引物序列，對2株分離菌進行PCR，反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 50 s，56 ℃ 50 s,72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶大小，并送華大基因科技服務(wù)有限公司進行16S rRNA測序，將測序后的基因序列與NCBI上傳序列進行比對。

1.2.3 2種分離菌的藥敏試驗 參考文獻[2]中的操作步驟，應(yīng)用藥敏紙片擴散法對分離的副雞禽桿菌和鼻氣管鳥桿菌菌株進行藥物敏感性試驗。

1.2.4 血凝抑制試驗檢測副雞禽桿菌血清型 參照Page等[3-4]建立的HA-HI試驗步驟，將副雞禽桿菌分離株在96孔微量凝集板中用滅菌PBS進行倍比稀釋，并設(shè)陰性對照。然后每孔加入等體積的1%雞紅細胞懸液，輕微震蕩混勻后放37 ℃恒溫箱20 min，觀察并計算血凝效價HA。將實驗室制備的抗副雞禽桿菌高價血清,按照不同血清型用滅菌PBS進行倍比稀釋，每孔25 μL，設(shè)置陰性對照孔及陽性對照孔。除陰性對照孔外，每孔加入25 μL的4 HA抗原，作用30 min后，每孔加入25 μL的1%雞紅細胞懸液，輕微震蕩混勻后放37 ℃恒溫箱20 min，觀察試驗結(jié)果。

1.2.5 禽鼻氣管鳥桿菌抗原制備與瓊脂糖擴散試驗 將禽鼻氣管鳥桿菌分離株和標準株接種于5%雞血清TSA平板中，37 ℃溫箱培養(yǎng)48 h，用1 mL含有8.5%氯化鈉，0.3%福爾馬林的PBS將菌落洗下，放入2 mL EP管中，將菌液調(diào)整至OD600值為0.5～0.6，沸水浴煮60 min，菌液冷卻后15 000 g離心30 min，取上清，即為試驗所用抗原。梅花樁打孔1.5%瓊脂糖平板，將陽性分型血清25 μL加入中央孔，外周孔分別加入25 μL不同陽性抗原及待測抗原，同時設(shè)立陰性血清對照，倒置放入37 ℃溫箱中培養(yǎng)，每24 h觀察1次沉淀線，連續(xù)觀察至第3天，并記錄結(jié)果。

1.2.6 分離菌攻毒試驗 試驗分為4組，每組10只雞。第1組為副雞禽桿菌攻毒組，挑取單菌落劃線TSA培養(yǎng)板，37 ℃培養(yǎng)15 h，次日用滅菌PBS洗下菌落，調(diào)至濃度為106CFU/mL，每只雞眶下竇接種0.2 mL；第2組為禽鼻氣管鳥桿菌攻毒組，細菌培養(yǎng)方法同上，調(diào)整菌液濃度為109CFU/mL，每只雞眶下竇接種0.2 mL；第3組為副雞禽桿菌攻毒與禽鼻氣管鳥桿菌共感染組，將副雞禽桿菌按106CFU/mL濃度每只接種0.2 mL后，再將禽鼻氣管鳥桿菌按109CFU/mL濃度每只接種0.2 mL；第4組為陰性對照組，每只雞眶下竇接種0.2 mL滅菌PBS。

2 結(jié)果

2.1 2種分離株16S rRNA測序與比對 對分離到的副雞禽桿菌與禽鼻氣管鳥桿菌進行革蘭染色，油鏡下觀察均為革蘭陰性多形性短桿菌(見中插彩版圖1，圖2)。2個分離株進行16S rRNA的PCR，產(chǎn)物進行1%瓊脂糖電泳，目的條帶大小在1 540 bp左右，與預(yù)期相符。將2個分離株測序后與GenBank中已上傳序列進行比對，結(jié)果顯示，2株菌分別為副雞禽桿菌(DW-1)與禽鼻氣管鳥桿菌(ORT-18)。16S rRNA基因測序結(jié)果已經(jīng)分別上傳到GenBank中，登錄號分別為DW-1：MK855504.1，ORT-18：MN023014.1。

2.2 2種分離株藥敏試驗 取分離的培養(yǎng)菌按常規(guī)紙片法進行藥敏試驗，結(jié)果顯示，2株分離菌對強力霉素、青霉素G等敏感，對鏈霉素及卡那霉素均不敏感，見表1。

2.3 血凝抑制檢測副雞禽桿菌血清型 血凝抑制試驗鑒定副雞禽桿菌分離株的血清型，結(jié)果顯示，分離株與1 600倍稀釋后的A 型標準陽性血清發(fā)生陽性反應(yīng)(表2)，而與B型和C型副雞禽桿菌的特異性陽性血清沒有結(jié)合反應(yīng)，說明此分離株為A型副雞禽桿菌。

表1 2種細菌分離株的藥敏試驗結(jié)果

表2 副雞禽桿菌的分型結(jié)果

2.4 瓊擴試驗檢測禽鼻氣管鳥桿菌血清型 經(jīng)過72 h濕盒孵育，觀察抗原孔與抗體孔中間有無沉淀線產(chǎn)生。結(jié)果顯示，此次的分離株只與A型陽性血清產(chǎn)生沉淀線，因此判定分離的禽鼻氣管鳥桿菌血清型為A型。

2.5 動物回歸試驗 副雞禽桿菌攻毒組的10只試驗雞，在攻毒后24 h均出現(xiàn)呼吸道癥狀，表現(xiàn)出流鼻涕、打噴嚏、甩頭，頭面部出現(xiàn)一側(cè)或雙側(cè)腫脹。禽鼻氣管鳥桿菌攻毒組中，3只試驗雞表現(xiàn)為流鼻液、呼吸有濕啰音等呼吸道癥狀。病雞剖檢可見氣囊炎、單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎。共感染組中，10只試驗雞都出現(xiàn)嚴重的面部腫脹及大量鼻涕，并有眼瞼及結(jié)膜炎癥狀，雙眼因腫脹而閉合，病雞均出現(xiàn)精神委靡，羽毛松亂。痊愈時間滯后2～3 d。 試驗雞病原菌重分離并進行16S rRNA測序鑒定，結(jié)果顯示，共感染組的試驗雞能夠分離到副雞禽桿菌和禽鼻氣管鳥桿菌。

3 討論

引起雞只眼瞼腫脹的病原有多種，最常見的是副雞禽桿菌引起的雞傳染性鼻炎。該病可引起嚴重的雞上呼吸道疾病[5-6]。臨床表現(xiàn)為打噴嚏、流鼻涕、鼻竇炎、結(jié)膜炎以及面部腫脹等，造成產(chǎn)蛋雞產(chǎn)蛋率下降，肉雞淘汰率明顯升高，給養(yǎng)禽業(yè)造成很大經(jīng)濟損失[7-8]。如果控制不及時，易與其他疾病繼發(fā)感染[9-11]。目前，許多雞場仍傾向于用抗生素控制雞傳染性鼻炎等細菌性傳染病。在生物安全條件較差的養(yǎng)雞場，雞舍通風(fēng)不良導(dǎo)致舍內(nèi)氨氣、硫化氫等刺激性氣體超標，呼吸道黏膜受損，使得呼吸道傳染性疾病發(fā)生率大幅提高。

禽鼻氣管鳥桿菌病呈全球范圍內(nèi)流行，易感動物種類繁多，尤以禽類最為易感。主要臨床癥狀為流鼻涕，呼吸紊亂等呼吸道癥狀，病雞生長遲緩，采食量及肉增重減少，蛋雞產(chǎn)蛋量降低等。臨床剖檢中，病雞多見氣囊炎、單側(cè)或雙側(cè)纖維素性化膿性肺炎、胸膜炎等。該菌常與其他細菌或病毒混合感染家禽[12-14]，有文獻報道，在秘魯發(fā)生了副雞禽桿菌與禽鼻氣管鳥桿菌的混合感染[15]，本試驗首次從國內(nèi)病例中同時分離到A型副雞禽桿菌與A型禽鼻氣管鳥桿菌。目前，禽鼻氣管鳥桿菌病原學(xué)、防控技術(shù)等研究還不夠深入，由于其血清型眾多，各分離株對抗生素的敏感性差異顯著，并且抗生素大量使用導(dǎo)致該菌耐藥性不斷增強。有必要深入研究該病原菌的致病機理，進一步探究其防治策略。

藥敏試驗結(jié)果顯示，DW-1和ORT-18分離株之間存在差異。實踐生產(chǎn)中，可以通過病原菌分離培養(yǎng)、藥敏試驗篩選共同有效的抗菌藥治療不同病原菌混合感染的病例。隨著抗生素禁用和限用等法律法規(guī)的不斷出臺，單純應(yīng)用抗生素治療細菌感染已經(jīng)越來越不可取，有效預(yù)防才是關(guān)鍵。因此，開發(fā)具有更高免疫保護效力的針對性疫苗是選項之一，應(yīng)考慮針對感染癥狀相似但病原菌不同的細菌病開發(fā)聯(lián)合疫苗。