吉林市部分地區(qū)綠殼蛋雞新城疫和禽流感抗體檢測(cè)與分析※

●左 麗 韓國(guó)瑞 張莉莉 趙 桐 朱宏雪 姜 成

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院吉林吉林132109）

新城疫（Newcastle disease，簡(jiǎn)稱(chēng)ND）是由新城疫病毒（副黏病毒）引起的禽類(lèi)的一種急性、熱性、敗血性和高度接觸性傳染病，以高熱、呼吸困難下痢、神經(jīng)紊亂、黏膜和漿膜出血為特征。禽流感（Avian Influenza，簡(jiǎn)稱(chēng)AI），全名鳥(niǎo)禽類(lèi)流行性感冒，是由A型流感病毒引起的禽類(lèi)的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。

新城疫和禽流感是在養(yǎng)殖禽類(lèi)的過(guò)程中較為常見(jiàn)的兩種病毒性傳染病，嚴(yán)重影響產(chǎn)蛋率，會(huì)造成雞只的大量死亡，給養(yǎng)殖場(chǎng)造成很大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，吉林市綠殼蛋雞的養(yǎng)殖量在不斷增加，這兩種病毒病的發(fā)病率也有所提高。為提高養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)綠殼蛋雞新城疫和禽流感免疫的重視程度，減少這兩種病毒病的發(fā)生，我們于2019年4~12月對(duì)吉林市25個(gè)綠殼蛋雞養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行了雞蛋樣本的采集及抗體的檢測(cè)，旨在了解吉林市部分地區(qū)綠殼蛋雞場(chǎng)的新城疫和禽流感的免疫情況，為該地區(qū)制定科學(xué)的免疫程序提供參考依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 樣本的來(lái)源與采集

試驗(yàn)材料來(lái)源于吉林市25個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)產(chǎn)蛋高峰期的綠殼蛋雞，將25個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)按1~25的順序命名。從每個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)各隨機(jī)抽取24枚雞蛋，送到實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行新城疫和禽流感抗體效價(jià)的檢測(cè)。

1.2 主要器材

電子天平儀、LD4-2低速離心機(jī)、DH6000A型電熱恒溫培養(yǎng)箱、微量振蕩器、微量移液器（規(guī)格為50uL）、離心管、一次性槍頭（規(guī)格分別為50uL、10uL、5uL）、96孔微量反應(yīng)板、一次性采血針、小燒杯、彩色多道可調(diào)移液器。

1.3 主要試劑

新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、禽流感H9、H7、H5亞型血凝試驗(yàn)抗原及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清、1%的雞紅細(xì)胞懸液、三氯甲烷、生理鹽水、5%枸櫞酸鈉。

1.4 試驗(yàn)地點(diǎn)

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物微生物實(shí)驗(yàn)室。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣本的處理方法

打開(kāi)雞蛋樣本，放在已消毒待用的培養(yǎng)皿中，用注射器抽取出1mL卵黃，放入10mL離心管中，作4倍稀釋?zhuān)?mL卵黃+3mL生理鹽水，制成卵黃稀釋液，然后向另一個(gè)2mL離心管中加入750uL三氯甲烷，再加入750uL卵黃稀釋液混合離心，離心之后取上清液，即為抗體。48h內(nèi)檢測(cè)的抗體可置于4℃冰箱中保存，否則置于20℃冰箱中待檢[1]。

2.2 血凝試驗(yàn)（HA）

首先加稀釋液：用微量移液器分別向反應(yīng)板的第1~12孔，加生理鹽水50uL，然后用微量移液器吸取5倍稀釋的抗原50uL于第1孔中，并反復(fù)吹打4~5次，混勻后吸出50uL至第2孔，依次倍比稀釋到11孔，從第11孔吸出50uL棄去，第12孔不加抗原作為紅細(xì)胞對(duì)照。用微量移液器分別向1~12孔加1%的紅細(xì)胞懸液50uL，置于微量振蕩器上，振蕩1min，放置于37℃恒溫箱靜止10~15min后觀察結(jié)果。

將反應(yīng)板傾斜45°，若沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者，表明紅細(xì)胞未被病毒凝集或不完全被病毒凝集；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒所凝集[2]。

2.3 血凝抑制試驗(yàn)（HI）

加稀釋液：用微量移液器分別向反應(yīng)板的第1~12孔加生理鹽水50uL。倍比稀釋被檢血清（或卵黃抗體）：用微量移液器吸取待測(cè)血清（或卵黃抗體）50uL至第1孔中并反復(fù)吹打4~5次，混勻后吸出50uL至第2孔，依次倍比稀釋到第11孔，棄去50uL，第12孔不加血清作抗原對(duì)照。加4單位抗原，1~12孔每孔各加50uL。將96孔反應(yīng)板置于振蕩器上，振蕩1min，放置于37℃恒溫箱靜置5min，用微量移液器向1~12孔各加1%的紅細(xì)胞懸液50uL，置于振蕩器上，振蕩1min，放置于37℃恒溫箱靜置10~15min后觀察結(jié)果。

將反應(yīng)板傾斜45°，若沉于孔底的紅細(xì)胞沿著傾斜面向下呈線狀流動(dòng)者，表明紅細(xì)胞未被病毒凝集，即凝集現(xiàn)象被抑制；如果孔底的紅細(xì)胞鋪平孔底，凝成均勻薄層，傾斜后紅細(xì)胞不流動(dòng)，說(shuō)明紅細(xì)胞被病毒所凝集，即凝集現(xiàn)象未被抑制[3]。

2.4 新城疫和禽流感的平均效價(jià)值和離散度的標(biāo)準(zhǔn)范圍

見(jiàn)表1。

表1新城疫和禽流感抗體的平均效價(jià)值和離散度的標(biāo)準(zhǔn)范圍

3 結(jié)果與分析

3.1 25個(gè)雞場(chǎng)新城疫和禽流感抗體的平均效價(jià)值及離散度

25 個(gè)雞場(chǎng)新城疫和禽流感抗體的檢測(cè)結(jié)果，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，免疫效果最理想的是新城疫，有20個(gè)雞場(chǎng)抗體效價(jià)平均值達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)，有18個(gè)雞場(chǎng)的離散度達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)。禽流感H9抗體效價(jià)平均值達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有17個(gè)雞場(chǎng)，離散度達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有15個(gè)雞場(chǎng)；禽流感H7抗體效價(jià)平均值達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有13個(gè)雞場(chǎng)，離散度達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有11個(gè)雞場(chǎng)；禽流感H5Re-11抗體效價(jià)平均值達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有12個(gè)雞場(chǎng)，離散度達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有8個(gè)雞場(chǎng)；禽流感H5Re-12抗體效價(jià)平均值達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有13個(gè)雞場(chǎng)，離散度達(dá)到合格標(biāo)準(zhǔn)的有9個(gè)雞場(chǎng)；有3個(gè)雞場(chǎng)（6、9、10）沒(méi)有檢出禽流感H7、H5Re-11和H5Re-12抗體；還有1個(gè)雞場(chǎng)（22）沒(méi)有檢測(cè)出禽流感H5Re-11和H5Re-12抗體。

表2 25個(gè)雞場(chǎng)新城疫和禽流感抗體的平均效價(jià)值及離散度

續(xù)表2

3.2 25個(gè)雞場(chǎng)新城疫和禽流感抗體效價(jià)平均值及離散度的合格率

統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3所列，參照表1和表2計(jì)算出25個(gè)雞場(chǎng)新城疫的抗體效價(jià)平均值合格率為80%，離散度的合格率為72%，禽流感H9抗體效價(jià)平均值合格率為68%，離散度的合格率為60%；而H7、H5Re-11、H5Re-12抗體效價(jià)平均值合格率及離散度的合格率都偏低。

表3 25個(gè)雞場(chǎng)新城疫和禽流感抗體效價(jià)平均值及離散度的合格率

4 討論

從25個(gè)雞場(chǎng)抗體樣本檢測(cè)的結(jié)果來(lái)看，吉林市部分養(yǎng)殖場(chǎng)的綠殼蛋雞新城疫的免疫情況還是比較理想的，禽流感H9抗體的免疫情況相對(duì)可以，但是還是偏低，而H7、H5Re-11、H5Re-12抗體效價(jià)平均值合格率及離散度的合格率則不理想。

雞群抗體效價(jià)的影響因素有如下幾點(diǎn)：

4.1雞群的基礎(chǔ)免疫次數(shù)不夠。新城疫在開(kāi)產(chǎn)前一般至少免疫5次，而開(kāi)產(chǎn)后每隔4~5d要進(jìn)行1次飲水免疫，3~4個(gè)月要進(jìn)行1次滅活苗的注射。其他疫苗也應(yīng)該按照雞體本身抗體的變化情況進(jìn)行免疫。

4.2養(yǎng)殖場(chǎng)對(duì)免疫工作不重視。特別是對(duì)禽流感H5抗體的免疫重視程度不夠，有的養(yǎng)殖戶和養(yǎng)殖場(chǎng)根本就不進(jìn)行免疫，造成很大的疫病感染風(fēng)險(xiǎn)。

4.3其他原因。疫苗原因、母源抗體的干擾、免疫程序的不合理、亂用抗生素、免疫抑制性疾病、病毒毒力增強(qiáng)、機(jī)體本身因素和環(huán)境因素等。