內(nèi)蒙古地區(qū)93例非綜合征型耳聾患者的基因突變結(jié)果分析

黃艷 王曉華 王桂香 沙晶 齊穎 冀小平 冀云鵬

耳聾是一類常見的、難治性的、嚴(yán)重危害人類健康和生活質(zhì)量的疾病，是我國最常見的出生缺陷之一，新生兒中的發(fā)病率達(dá)1‰[1,2]，據(jù)報(bào)道約有60～80%的耳聾與遺傳因素有關(guān)。其中，GJB2、GJB3、SLC26A4和MT-RNR1是導(dǎo)致遺傳性非綜合征型耳聾患者最主要的4個(gè)致病基因[3]。本文通過直接測序方法對內(nèi)蒙古地區(qū)93例耳聾患者進(jìn)行耳聾基因(22個(gè)基因，159個(gè)位點(diǎn))檢測，了解該地區(qū)耳聾基因的突變情況。

對象與方法

1.對象

收集2017年11月—2018年5月來自內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院耳鼻喉科及遺傳科，呼和浩特市小百靈康復(fù)中心和內(nèi)蒙古自治區(qū)殘疾人康復(fù)服務(wù)中心的93例耳聾患者臨床資料，有漢族78例，蒙族12例，回族3例?；颊呔堰M(jìn)行純音測聽，聲阻抗和聽覺腦干誘發(fā)電位等檢查，患者純音電測聽結(jié)果顯示為感音神經(jīng)性耳聾，同時(shí)聲阻抗檢查結(jié)果與純音電測聽檢查結(jié)果相符；患者均經(jīng)臨床耳軸位CT骨掃描放大及冠狀面重建檢查。以ABR V波反應(yīng)閾值>30dBnHL為2～4kHZ范圍聽力損失的指標(biāo)，聽力損失程度分級標(biāo)準(zhǔn)如下：輕度聾波V反應(yīng)閾值為31～50dBnHL；中度聾51～70dBnHL；重度聾71～90dBnHL；極重度聾>90dBnHL。本研究經(jīng)內(nèi)蒙古自治區(qū)婦幼保健院倫理委員會審查批準(zhǔn)，所有患者及家庭成員均簽署書面知情同意書，未成年人由其監(jiān)護(hù)人代為簽署。

排除標(biāo)準(zhǔn)為：除聽力下降外，經(jīng)系統(tǒng)身體檢查發(fā)現(xiàn)耳、眼等部位先天性畸形者，或伴有其他臨床表現(xiàn)的綜合征型遺傳性耳聾者，以及智力、身體發(fā)育異常者。

2.方法

EDTA管采集93例患者及其雙親的外周靜脈血3ml，采用聯(lián)合探針錨定聚合測序法。方法具體為：根據(jù)遺傳性耳聾基因突變位點(diǎn)序列信息，設(shè)計(jì)特異性擴(kuò)增引物，利用多重PCR技術(shù)擴(kuò)增人基因組DNA中靶序列并同時(shí)引入用于樣本識別的樣本標(biāo)簽序列。將多個(gè)(≤96個(gè))樣本的PCR產(chǎn)物按比例混合成為一個(gè)文庫樣本，經(jīng)過一系列文庫制備過程，每個(gè)文庫樣本中的DNA序列都加上了用于測序及文庫識別的接頭序列。將適量文庫樣本按等物質(zhì)的量比例混合為一個(gè)測序樣本。BGISEQ-500基因測序儀對測序樣本DNA進(jìn)行序列信息讀取，每一條DNA的測序結(jié)果經(jīng)過文庫接頭序列及樣本標(biāo)簽序列比對拆分后將被精確定位到每一個(gè)樣本中，將每個(gè)樣本的測序結(jié)果與人類基因組比對并對22個(gè)耳聾基因的159個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，從而確定159個(gè)位點(diǎn)的檢測結(jié)果。測序數(shù)據(jù)用遺傳性耳聾基因分析軟件讀取，并將所測序列與NCBI中的基因標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對比分析，記錄序列對比結(jié)果。BGISEQ-500基因測序儀由深圳華大基因生物醫(yī)學(xué)工程有限公司生產(chǎn)。

結(jié)果

1.檢測結(jié)果

運(yùn)用聯(lián)合探針錨定聚合測序法對93位耳聾患者進(jìn)行GJB2、GJB3、SLC26A4、線粒體MT-RNR1等22個(gè)耳聾致病基因，共159個(gè)位點(diǎn)的檢測，同時(shí)對其雙親采用同樣方法進(jìn)行檢測以驗(yàn)證?；蛟\斷結(jié)果顯示：52例患者檢測發(fā)現(xiàn)基因突變。其中37例檢測到GJB2、SLC26A4基因純合突變或復(fù)合雜合突變；2例MT-RNR1基因突變自先證者的母親，還有1例MT-RNR1基因突變患者的母親未采血故無法驗(yàn)證；另有12例GJB2、GJB3、SLC26A4基因單雜合突變患者,突變位點(diǎn)遺傳自先證者的父親或母親。本次研究未檢測到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突變。

2.基因突變熱點(diǎn)

GJB2基因的突變熱點(diǎn)為c.299-300delAT、c.235delC和c.176-191delGCTGC- AAGAACGTGTG,SLC26A4基因的突變熱點(diǎn)為c.919-2A和c.2168A>G，MT-RNR1的基因突變熱點(diǎn)為m.1555A>G(見表1)。

表1 93例患者的耳聾基因分型及突變位點(diǎn)

3.突變檢出相對頻率

GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3基因的突變檢出率分別為26.9% 、23.7% 、3.2% 和2.2%(見表2)。

表2 93例患者的不同耳聾基因的突變率

4.突變頻率在民族中差異

GJB2基因突變與其它基因的突變在漢族和其他少數(shù)民族(包括回族和蒙族)之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見表3)。

表3 93例患者GJB2基因突變位點(diǎn)與其它基因突變位點(diǎn)的臨床比較

5.突變遺傳規(guī)律

表4提示，1例耳聾患者GJB2基因的突變位點(diǎn)為c.35G>T，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，該位點(diǎn)遺傳自患者的母親，但其母親聽力正常；1例患者的母親(耳聾患者)檢出與患者相同的GJB2基因純合突變；檢出2例GJB3基因突變，位點(diǎn)為c.538C>T,該位點(diǎn)突變符合常染色體隱性遺傳規(guī)律；2例患者檢出MT-RNR1基因異質(zhì)突變，均遺自耳聾的母親，1例患者存在的MT-RNR1基因同質(zhì)突變，因其母親無法采血故不能得到驗(yàn)證；還有4例耳聾患者未檢測出MT-RNR1基因異質(zhì)突變，而其父親均攜帶該突變。

表4 非綜合征型耳聾者部分直系親屬的耳聾基因測序結(jié)果

6.SLC26A4基因突變與前庭導(dǎo)水管的對應(yīng)關(guān)系

本次研究提示15例患者檢測到SLC26A4基因突變，包括純合突變和復(fù)合雜合突變，9例患者同時(shí)具備大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的影像學(xué)特征，但其中2例患者無大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大；7例存在SLC26A4基因單雜合突變的患者中，1例患者有大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大；另有3例患者大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，但沒有SLC26A4基因突變(見表5)。

表5 SLC26A4基因突變與前庭導(dǎo)水管的對應(yīng)關(guān)系

討論

1.GJB2基因突變相對頻率最高

本次研究通過對93個(gè)患者進(jìn)行耳聾致病基因檢測，發(fā)現(xiàn)22例患者存在GJB2基因突變(包括純合突變和復(fù)合雜合突變)，15例患者存在SLC26A4基因突變(包括純合突變和復(fù)合雜合突變)，3例患者存在線粒體MT-RNR1基因突變(包括同質(zhì)突變和異質(zhì)突變)；另有3例患者存在GJB2基因單雜合突變，7例患者有SLC26A4基因單雜合突變，2例患者有GJB3基因單雜合突變(均符合常染色體隱性遺傳方式)。耳聾基因陽性檢出率為55.9%。

2.GJB2、SLC26A4、MT-RNR1 和GJB3是本地區(qū)的高發(fā)耳聾基因

本次研究提供了22個(gè)基因、159個(gè)位點(diǎn)的檢測，患者未檢測到GJB2、SLC26A4、MT-RNR1及GJB3以外的基因突變，且檢出率排序依次為GJB2>SLC26A4>MT-RNR1>GJB3，可見這四大基因突變在內(nèi)蒙古地區(qū)發(fā)生頻率較高。

3.發(fā)現(xiàn)1例GJB2突變遺傳自健康母親的先證者

耳聾患者中，GJB2基因突變常表現(xiàn)為常染色體隱性遺傳，此次研究中GJB2基因突變的患者為25例，包括純合突變、復(fù)合雜合突變及單雜合突變，聽力學(xué)表現(xiàn)為重度至極重度耳聾。本研究檢測到1例患者GJB2基因的突變位點(diǎn)為c.35G>T，遺傳方式為常染色體顯性遺傳，該位點(diǎn)遺傳自患者的母親，但其母親聽力正常，關(guān)于同樣攜帶，但是致病性不同，可能有三種解釋：(1)患者GJB2其他位點(diǎn)或其他基因存在突變；(2)外顯不全，或者母親有其他基因減弱了這個(gè)突變的傷害；(3)普遍耳聾基因病變中女性的癥狀會弱于男性。關(guān)于第一種解釋，也有可能c.35G>T在這個(gè)家系中表現(xiàn)為隱性遺傳，患者是復(fù)合雜合或雙基因致病，如果沒有發(fā)現(xiàn)其他突變，只有這個(gè)突變，那么可能就是這個(gè)突變導(dǎo)致的耳聾。這幾種是列出的可能性，也可能還有其他原因。此次研究中還檢出2例GJB3基因突變，位點(diǎn)為c.538C>T,該位點(diǎn)突變符合常染色體隱性遺傳規(guī)律，與同期檢出的3例GJB2基因單雜合突變患者一樣，有待進(jìn)一步做GJB2或GJB3基因的全序列檢測，因?yàn)殡m然耳聾基因檢測為單雜合突變，仍提示可能為遺傳性耳聾，不排除患兒有其它未知或罕見的致聾突變基因存在，需進(jìn)一步明確耳聾原因。

4.多數(shù)SLC26A4基因突變先證者存在大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的影像學(xué)特征

本次研究提示15例患者檢測到SLC26A4基因突變，包括純合突變、復(fù)合雜合突變，9例患者同時(shí)具備大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的影像學(xué)特征，但其中2例患者無大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大；7例存在SLC26A4基因單雜合突變的患者中，1例患者有大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，該患者需做SLC26A4基因全測序以明確是否有罕見基因突變；另有3例患者存在大前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大，沒有基因突變，與上述具有SLC26A4基因純合突變或復(fù)合雜合突變但沒有前庭導(dǎo)水管擴(kuò)大的2例患者一樣，患者需動(dòng)態(tài)監(jiān)測顳骨CT或核磁的變化以及時(shí)了解發(fā)病情況，需注意避免劇烈運(yùn)動(dòng)、噪音及發(fā)熱等情況。

5.發(fā)現(xiàn)3例先證者及4例聽力正常的先證者父親存在MT-RNR1基因突變

本研究提示：2例患者檢出MT-RNR1基因異質(zhì)突變，均遺傳自耳聾的母親；1例患者存在的MT-RNR1基因同質(zhì)突變，因其母親無法采血故不能得到驗(yàn)證；還有4例聽力正常者檢測出MT-RNR1基因異質(zhì)突變，均為耳聾患者的父親，可以通過禁用氨基因糖甙類藥物來避免發(fā)生耳聾。同質(zhì)性是指同一細(xì)胞或同一組織中所有的mtDNA分子都是一致的，異質(zhì)性是指同一細(xì)胞或同一組織中有兩種或兩種以上mtDNA共存，一種為野生型，另一種為突變型。

綜上所述，遺傳因素在非綜合征型耳聾的致聾病因中所占比例較高，在呼和浩特及周邊地區(qū)耳聾基因的研究發(fā)現(xiàn)GJB2 235delC 和 SLC26A4 c.919-2A>G 是耳聾基因的高發(fā)位點(diǎn)，線粒體 DNA 檢出率極低。國內(nèi)耳聾基因的突變譜與地域分布有一定關(guān)系，北方與南方表現(xiàn)出不同的突變位點(diǎn)發(fā)生頻率不同[4,5]。本次研究未發(fā)現(xiàn)不同的耳聾基因突變在民族之間的差異，可能與樣本量少有關(guān)，也不排除與取樣患者地域分布的差異有關(guān)，可通過擴(kuò)大樣本分布的范圍和數(shù)量來觀察不同基因突變與民族之間的關(guān)系。對于雙側(cè)感音神經(jīng)性聾的患兒家庭及耳聾基因陽性患兒定期進(jìn)行聽力學(xué)隨訪意義重大[6-8]，為防止再生育耳聾子女，對父母雙方實(shí)施耳聾基因測序是非常必要的。耳聾基因檢測可為降低出生缺陷的三級預(yù)防提供理論和實(shí)踐依據(jù)[9,10]。