影響凍融胚胎移植結(jié)局的年齡節(jié)點(diǎn)及相關(guān)因素分析

馬榮花 簡生燕 祁淑英 王莉云 熊正方 沈源春

既往諸多文獻(xiàn)報(bào)道，30～35歲以后隨著年齡的增加?jì)D女的生育力逐漸下降，在使用輔助生殖技術(shù)助孕治療中，年齡更是影響臨床妊娠率的重要因素之一[1]。關(guān)于高齡患者年齡的界值，國內(nèi)大多數(shù)研究是以38歲為界[2]，國外有的文獻(xiàn)認(rèn)為女性37歲是臨界年齡。不同地區(qū)，因環(huán)境因素、飲食差異或人們生活水平等因素的不同，高齡界限也因地而異。本文以青海省人民醫(yī)院就診的不孕癥患者為研究對(duì)象，界定了凍融胚胎移植(frozen-thawed embryo transfer，F(xiàn)ET)妊娠結(jié)局下降的年齡界限，并分析了年齡對(duì)FET患者妊娠結(jié)局的影響。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

1.選擇2014年2月—2017年12月就診于青海省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的不孕癥患者810例，共825個(gè)周期，記錄患者年齡及妊娠結(jié)局(臨床妊娠為陽性)?；颊吣挲g范圍21～45歲，平均(33.5±5.0)歲，妊娠404例，妊娠率37.8%。以年齡為橫坐標(biāo)，不同年齡階層移植人數(shù)(左)和妊娠率為縱坐標(biāo)(右)，繪制年齡-妊娠率曲線圖，描述本中心行FET患者的年齡與妊娠率的關(guān)系，并通過繪制ROC曲線確定影響妊娠率的年齡節(jié)點(diǎn)。

2.選擇其中2017年1月—12月的就診于青海省人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心行FET的不孕癥患者282例，共282個(gè)周期。根據(jù)年齡分為<36.5歲組和≥36.5歲組。<36.5歲組患者210例，年齡范圍21～36歲，平均(30.0±2.2)歲，≥36.5歲組72例，年齡范圍36～45歲，平均(37.0±3.4)歲，比較兩組患者的妊娠率、早期流產(chǎn)率及活產(chǎn)率，并進(jìn)一步采用多元回歸分析尋找兩組患者FET妊娠結(jié)局的影響因素。

3.納入標(biāo)準(zhǔn)：2014年2月—2017年12月,在本中心行體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET )助孕，并保存有卵裂期凍胚的所有患者。

4.排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)存在子宮解剖異常、宮腔息肉、子宮內(nèi)膜結(jié)核、子宮內(nèi)膜炎、輸卵管積水等可導(dǎo)致移植失敗的患者；(2)排除患有乳腺疾病、激素依賴性腫瘤、不明原因的陰道出血、血栓栓塞疾病等禁用雌激素的患者；(3)排除子宮內(nèi)膜異位癥的患者。

5.卵泡輸出率(Follicular output rate，F(xiàn)ORT)定義：為B超監(jiān)測(cè)下人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)日16～22 mm卵泡數(shù)與自然月經(jīng)周期第3天3～8 mm竇卵泡數(shù)比值[3]。

二、方法

1.子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案：(1)自然周期。對(duì)月經(jīng)規(guī)律、既往有排卵、子宮內(nèi)膜無損傷的患者應(yīng)用自然周期方案，于月經(jīng)第8～9天開始陰道彩超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育和內(nèi)膜生長情況，當(dāng)卵泡直徑>16 mm時(shí)每天測(cè)尿黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)值，當(dāng)尿LH陽性時(shí)注射HCG 5000 u誘導(dǎo)排卵，排卵后第1天內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，給予地屈孕酮片(達(dá)芙通，10毫克/片，荷蘭蘇威制藥公司生產(chǎn))，每日兩次，每次10 mg，聯(lián)合微?；S體酮軟膠囊(安琪坦，法杏大藥廠，法國，100毫克/粒)，每次200 mg，每日兩次，排卵后第3天上午進(jìn)行FET。當(dāng)天上午空腹抽取肘靜脈血測(cè)定雌二醇(estradiol,E2)和孕酮值(progesterone,P)。(2)激素替代周期。對(duì)月經(jīng)不規(guī)律、既往無排卵、子宮內(nèi)膜偏薄(<7 mm)的患者應(yīng)用激素替代方案(除外說明書中使用激素有禁忌癥的患者)，于月經(jīng)第3天給予口服雌二醇片(2/10 mg,荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司)，2 mg/d，根據(jù)陰道超聲下內(nèi)膜厚度調(diào)整激素用量，每3天逐漸加量，最大可增加至4～6 mg/d，若內(nèi)膜仍<7 mm則聯(lián)合給予雌二醇片 [1/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司] 0.5/mg，每晚睡前陰道放置，最大可增加至2 mg/d，月經(jīng)第14～16天陰超監(jiān)測(cè)內(nèi)膜厚度及形態(tài)，若內(nèi)膜厚度≥8 mm，誘導(dǎo)內(nèi)膜向分泌期轉(zhuǎn)化，給予雌二醇地屈孕酮片口服 [2/10 mg，荷蘭蘇威(上海雅培)制藥有限公司]，總劑量與內(nèi)膜轉(zhuǎn)化前服用雌二醇片相同，聯(lián)合微粒化黃體酮軟膠囊陰道給藥，每次200 mg，每日兩次。若月經(jīng)第21天內(nèi)膜仍未達(dá)標(biāo)，則放棄本周期。內(nèi)膜轉(zhuǎn)化第5天上午行FET，當(dāng)天上午空腹抽取肘靜脈血測(cè)定E2和P值。解凍和移植均由副主任醫(yī)師以上職稱大夫操作(移植管型號(hào)：T-1821011-S，太平洋康泰科學(xué)儀器有限公司)。

2.胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)：本實(shí)驗(yàn)納入的胚胎均為D3卵裂期胚胎，胚胎質(zhì)量評(píng)級(jí)參考 Brourn Hall Clinic胚胎評(píng)分系統(tǒng)[4]。Ⅰ級(jí)：卵裂球大小均勻，形態(tài)規(guī)則，具有完整的透明帶，胞質(zhì)均勻清晰，胞質(zhì)沒有顆粒現(xiàn)象，碎片0～5%之間；Ⅱ級(jí)：卵裂球大小略不均勻，形態(tài)欠規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片占6%～20%；Ⅲ級(jí)：卵裂球大小明顯不均勻，形態(tài)明顯不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆?，F(xiàn)象，碎片21%～50%；Ⅳ級(jí)：卵裂球大小嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)可有嚴(yán)重顆粒現(xiàn)象，碎片大于50%。將D3天卵裂球數(shù)目≥6個(gè)的Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)胚胎定義為優(yōu)質(zhì)胚胎。復(fù)蘇方法按本中心胚胎培養(yǎng)室玻璃化冷凍復(fù)蘇的操作常規(guī)進(jìn)行。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較用χ2檢驗(yàn)，年齡與妊娠率的相關(guān)性采用Spearman秩相關(guān)分析,并繪制ROC曲線，計(jì)算曲線下面積(AUC)。部分研究對(duì)象以妊娠結(jié)局為因變量，以年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平為自變量進(jìn)行一般性多元線性回歸分析，模型的參數(shù)估計(jì)采用最小二乘法，衡量每一個(gè)自變量對(duì)因變量的作用大小，采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、FET妊娠率隨年齡增長呈下降趨勢(shì)：隨著年齡增長，F(xiàn)ET妊娠率逐漸降低，且36歲后下降明顯(見圖1)，年齡與妊娠率的相關(guān)系數(shù)為-0.204，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由ROC曲線可知，F(xiàn)ET患者年齡與妊娠率的Cut-off值為36.5歲，若≥36.5歲，則妊娠率呈下降趨勢(shì)(AUC為0.825，靈敏度73.7%，特異度6.4%)(見圖2)。

圖1 年齡-妊娠率趨勢(shì)圖Figure 1 Age-pregnancy rate trend chart

圖2 年齡與妊娠率的關(guān)系Figure 2 The relationship between age and pregnancy rate

二、不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)兩組患者妊娠率的影響：對(duì)于不同年齡組的患者，自然周期及人工周期2種子宮內(nèi)膜準(zhǔn)備方案的妊娠率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 比較不同內(nèi)膜準(zhǔn)備方案對(duì)兩組患者妊娠率的影響Table 1 Comparison of pregnancy outcomes of different endometrial preparation schemes(%)

三、年齡對(duì)FET妊娠結(jié)局的影響：<36.5歲組臨床妊娠率為51%，≥36.5歲組(33.3%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。兩組早期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 比較不同年齡組患者FET妊娠結(jié)局Table 2 Comparison of FET pregnancy outcomes between different age groups (%)

四、影響患者不同年齡組FET妊娠結(jié)局的因素分析：進(jìn)一步分析2組患者妊娠結(jié)局的影響因素，一般多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)<36.5歲組患者的年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度是影響其成功率的主要因素，且移植日子宮內(nèi)膜厚度是最重要的影響因素，其余依次排序?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎率、年齡及FORT。移植日雌二醇及孕酮對(duì)妊娠結(jié)局無影響。而≥36.5歲組患者的年齡、FORT、優(yōu)質(zhì)胚胎率、子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素及孕激素水平是影響其成功率的主要因素，年齡為最重要因素，其余依次排序?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度、移植日雌激素水平及孕酮水平、FORT。見表3。

表3 兩組患者FET妊娠結(jié)局的影響因素Table 3 Influencing factors of FET pregnancy outcomesbetween the two groups

討 論

由于FET可以通過減少卵巢過度刺激綜合征的發(fā)生來提高累積妊娠率[5]，并且還能最大限度地減少移植胚胎的個(gè)數(shù)而成為輔助生殖技術(shù)的重要方法。眾多研究表明，年齡、優(yōu)質(zhì)胚胎率、移植日子宮內(nèi)膜厚度、卵泡輸出率、移植日雌激素和孕激素水平可影響FET妊娠結(jié)局。

年齡對(duì)FET妊娠結(jié)局有較大影響。WANG等[6]研究表明冷凍胚胎的妊娠率隨著年齡的增高而下降，特別是>40歲的患者。本研究通過年齡-妊娠趨勢(shì)圖發(fā)現(xiàn)，在21～45歲間行FET的患者中，21～30歲妊娠率上升，可達(dá)60%～80%。30～36歲雖有波動(dòng)，但也有較高的妊娠率，達(dá)50%～65%。而36歲以后的患者，妊娠率下降。由ROC曲線分析得出，年齡對(duì)FET患者妊娠率有預(yù)測(cè)價(jià)值，由軟件計(jì)算得出，患者妊娠率下降年齡的臨界值為36.5歲，曲線下面積為0.825，其95%的近似參考置信區(qū)間為(0.720，0.929)，敏感性73.7%，特異性80.4%。因此，本研究將36.5歲作為FET妊娠率下降的高齡界值。進(jìn)一步行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，隨著年齡增長，臨床妊娠率逐漸下降，早期流產(chǎn)率逐漸增高，活產(chǎn)率逐漸下降(見表1)。年齡<36.5歲組臨床妊娠率達(dá)51%，年齡≥36.5組臨床妊娠率僅為33.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與王偉周[7]、馬曉娟[8]等研究結(jié)果大致相似，但年齡節(jié)點(diǎn)略有差異。王偉周等發(fā)現(xiàn)40～42歲婦女妊娠率降低。馬曉娟等研究發(fā)現(xiàn)年齡<35歲組臨床妊娠率高于年齡>35歲組。分析可能原因：(1)不同氣候的不同地理位置的地區(qū)，因新鮮促排周期受精率、卵裂率和胚胎質(zhì)量等不同，導(dǎo)致FET妊娠率不同。(2)本研究樣本量小，僅以2017年度的數(shù)據(jù)不足以代表整體，需收集更大的數(shù)據(jù)進(jìn)行研究證實(shí)。本研究回歸分析發(fā)現(xiàn)，<36.5歲組患者年齡與FET妊娠結(jié)局呈負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)為0.119。≥36.5組患者年齡與FET妊娠結(jié)局也呈負(fù)相關(guān)，回歸系數(shù)為0.868。相對(duì)而言，年齡對(duì)于≥36.5歲組患者妊娠率的影響程度高于<36.5歲組，說明年齡對(duì)于高齡和非高齡婦女均有影響，而且對(duì)高齡婦女妊娠率的影響程度更大。年齡是無法改變的影響女性生殖能力的重要因素。Gianaroli[9]發(fā)現(xiàn)高齡是非整倍體發(fā)生的確定因素，非整倍體的異常會(huì)造成胚胎著床失敗，并致胚停、流產(chǎn)等。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組早期流產(chǎn)率和活產(chǎn)率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，考慮與兩組樣本量小，且樣本量懸殊有關(guān)系。

卵泡輸出率已廣泛應(yīng)用于IVF-ET中卵巢對(duì)外源性Gn的反應(yīng)性及妊娠結(jié)局。張寧等[10]研究發(fā)現(xiàn)，IVF/ICSI周期中，優(yōu)質(zhì)胚胎率、胚胎種植率以及臨床妊娠率隨著FORT值的升高而逐漸升高，相關(guān)分析顯示FORT與可移植胚胎數(shù)、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)呈正相關(guān)。從表2可知，F(xiàn)ORT與兩組患者妊娠率均呈正相關(guān)，<36.5歲組回歸系數(shù)為0.002，≥36.5歲組為0.015，兩者相關(guān)性相近，考慮FORT對(duì)FET患者妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)，仍受年齡影響，由于相關(guān)性均很低，說明FORT對(duì)不同年齡段FET妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)性差，該指標(biāo)對(duì)ART妊娠結(jié)局的預(yù)測(cè)意義重在新鮮促排卵周期中。

胚胎質(zhì)量和子宮內(nèi)膜是影響FET妊娠結(jié)局的兩大重要因素。子宮內(nèi)膜容受性是指內(nèi)膜允許囊胚黏附、穿透并植入從而著床的狀態(tài)，是胚胎著床的必要條件[11]，是影響FET妊娠結(jié)局的重要因素。子宮內(nèi)膜厚度因其經(jīng)陰道超聲檢查簡單無創(chuàng)的特點(diǎn)，已成為評(píng)價(jià)子宮內(nèi)膜容受性的間接指標(biāo)之一，為廣大學(xué)者認(rèn)可[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，兩組患者優(yōu)質(zhì)胚胎率與子宮內(nèi)膜厚度均與FET妊娠結(jié)果呈負(fù)相關(guān)，<36.5歲組回歸系數(shù)為0.245，≥36.5歲組為0.758，由此可知，對(duì)于36.5歲以上的患者，優(yōu)質(zhì)胚胎率和移植日子宮內(nèi)膜厚度對(duì)其成功率的影響更大，與周林燕[13]等研究結(jié)果一致。故對(duì)于高齡患者，可通過提高優(yōu)質(zhì)胚胎的植入率，提高移植日子宮內(nèi)膜的厚度，從而提高其妊娠結(jié)局。

研究發(fā)現(xiàn)在胚胎植入過程中適宜雌孕激素水平的協(xié)同作用可影響子宮內(nèi)膜容受性，與種植窗的開閉有關(guān)[14]，故是否移植日雌激素及孕激素越高，其妊娠率越高呢？項(xiàng)云改等[15]研究發(fā)現(xiàn)，自然周期和激素替代周期妊娠組和未妊娠組移植日雌激素水平均無明顯差異，妊娠組的血清P值水平均高于未妊娠組，另觀察人工周期FET妊娠率不隨E2水平的增高而增加。本研究發(fā)現(xiàn)，<36.5歲組患者移植日E2及P水平均與妊娠率無相關(guān)性，≥36.5歲組患者移植日E2及P值與妊娠率呈正相關(guān)，回歸系數(shù)分別為0.327、0.283，相關(guān)程度較高。由以上結(jié)果可推測(cè)，E2與P值對(duì)FET患者妊娠率的影響與年齡存在相關(guān)性，對(duì)于高齡女性，E2及P值增加，可增加子宮內(nèi)膜的厚度及其向分泌期的轉(zhuǎn)化，使子宮內(nèi)膜的種植窗與胚胎發(fā)育同步，有利于胚胎著床。因此，對(duì)于高齡女性，應(yīng)選擇激素替代周期，提高體內(nèi)雌激素及孕激素水平，增加胚胎著床率，提高FET妊娠率。

綜上所述，影響FET妊娠結(jié)局的因素諸多，且影響程度與年齡呈相關(guān)性。對(duì)于高齡婦女，年齡是影響其妊娠結(jié)局的最重要因素，故在行FET時(shí)應(yīng)根據(jù)患者年齡，選擇個(gè)體化治療方案，以獲得更好的結(jié)局。