m6A去甲基化酶ALKBH5對(duì)小鼠精原細(xì)胞功能的影響

夏維 胡玲 劉東 胡紅兵

N6-甲基腺嘌呤(m6A)是發(fā)生于哺乳動(dòng)物mRNA上最為常見(jiàn)的修飾[1]。m6A高通量測(cè)序結(jié)果證實(shí)超過(guò)7 000個(gè)人類(lèi)基因含有m6A，且每2 000個(gè)核苷酸中有一個(gè)m6A。m6A修飾主要發(fā)生于mRNA高度保守的共識(shí)序列：RRACH(R = G or A；H = A，C or U)[2]。研究表明，m6A影響mRNA的剪接、運(yùn)輸、翻譯和降解，參與脂肪生成、發(fā)育、致癌、干細(xì)胞再生以及其他生命進(jìn)程[2]。

AlkB同源蛋白5(AlkB homologue 5，ALKBH5)是目前發(fā)現(xiàn)的m6A去甲基化酶之一，在m6A動(dòng)態(tài)調(diào)控過(guò)程中起到重要作用[3]。ALKBH5屬于AlkB家族蛋白成員，具有保守的鐵連接區(qū)域和α-酮戊二酸作用區(qū)域[4]。研究證實(shí)ALKBH5與小鼠的生殖密切相關(guān)，ALKBH5敲除小鼠mRNA的m6A水平顯著上調(diào)，并且小鼠睪丸萎縮，精子數(shù)目和活動(dòng)力的下降[5]，但具體發(fā)生機(jī)制尚不明確。

富含半胱氨酸分泌蛋白2(CRISP2，Cysteine-rich secretory proteins 2)主要存在于哺乳動(dòng)物雄性生殖系統(tǒng)，且與生殖的不同階段相關(guān)[6]。CRISP2敲除的小鼠精子功能缺陷，導(dǎo)致生殖障礙[7]。β-防御素1(DEFB1，β-defensin 1)廣泛分布于機(jī)體內(nèi)，具有抗微生物的活性，抑制DEFB1功能會(huì)降低正常精子的活力和殺菌活性[8]。為了探究m6A升高引起的男性弱精癥的發(fā)病機(jī)制，本研究通過(guò)敲除和過(guò)表達(dá)精原細(xì)胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，檢測(cè)m6A和精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的表達(dá)，從而明確m6A去甲基化酶ALKBH5對(duì)小鼠精原細(xì)胞(GC-1)功能的影響。

材料與方法

1.材料:研究所需的主要試劑和儀器包括DMEM高糖培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、0.25% 胰蛋白酶(美國(guó)Thermo公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、1%雙抗(青霉素、鏈霉素)(美國(guó)Gibco公司)、Lipofectamine 3000 (美國(guó)Invitrogen公司)、iTaqTMUniversal Supermixes (美國(guó)BioRad公司)、ALKBH5抗體(中國(guó)Proteintech公司)、GAPDH抗體(中國(guó)Proteintech公司)、TRIzol (美國(guó)Invitrogen公司)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TOYOBO公司)、核酸酶S1(中國(guó)Takara公司)、堿性磷酸酶(中國(guó)Takara公司)、磷酸二酯酶(中國(guó)Sigma-Aldrich公司)、標(biāo)準(zhǔn)品(rA，rU，rC，rG，dA，T，dC，dG，m6A)(中國(guó)Sigma-Aldrich公司)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、低溫離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司)、LC-20AD高效液相色譜儀(日本島津公司)、Hisep C18-T色譜柱 (150 mm×2.1 mm 5 μm，中國(guó)韋泰公司)、AB 3200 QTRAP 質(zhì)譜儀(美國(guó)Life Technologie公司)。

2.細(xì)胞培養(yǎng):由本實(shí)驗(yàn)室凍存復(fù)蘇而得的人胚腎細(xì)胞HEK293T和小鼠精原細(xì)胞(GC-1)于含有10% 胎牛血清和1%雙抗DMEM的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好并且融合度達(dá)到約80% 時(shí)，進(jìn)行細(xì)胞傳代或繼續(xù)下列實(shí)驗(yàn)。

3.ALKBH5敲除與過(guò)表達(dá)：利用Lipofectamine 3000將ALKBH5敲除質(zhì)粒和空載質(zhì)粒分別與病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞，48 h后收集含病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，濃縮病毒液，用病毒液感染小鼠精原細(xì)胞(GC-1)，72 h 后加入2 μg/mL 的嘌呤霉素篩選，將篩選出的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并收樣，設(shè)置敲除組sh-ALKBH5和對(duì)照組sh-CTL；利用Lipofectamine 3000 將質(zhì)粒pcDNA3.1-ALKBH5與空載pcDNA3.1分別轉(zhuǎn)染至小鼠精原細(xì)胞(GC-1)，48 h后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，設(shè)置過(guò)表達(dá)組oe-ALKBH5和對(duì)照組oe-CTL。

4.RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄：TRIzol法提取ALKBH5敲除和過(guò)表達(dá)細(xì)胞RNA，方法參照試劑說(shuō)明書(shū)，40 μL RNase-Free ddH2O溶解沉淀，用NanoDrop檢測(cè)RNA的濃度與純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將細(xì)胞RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)。

5.LC-MS/MS檢測(cè)細(xì)胞m6A水平：利用核酸酶S1、堿性磷酸酶、磷酸二酯酶酶解精子RNA，采用液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞m6A水平。檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple reaction monitoring，MRM)模式，監(jiān)測(cè)離子對(duì)(母離子→子離子)分別為：m6A(282.2 →150.1)，rA(268.4 → 136.2),rU(245.4 → 113.1),rC(244.4 → 112.2)，rG(284.5 → 152.2)，dA(252.4 → 136.2)，T(243.3 → 127.2)，dC(228.4 → 112.2)，dG(268.4 → 152.4)。

6.qPCR檢測(cè)精子功能相關(guān)基因的表達(dá)水平：qPCR儀檢測(cè)精子功能相關(guān)基因(CRISP2和DEFB1)表達(dá)水平，利用β-肌動(dòng)蛋白(β-ACTIN)基因和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase，GAPDH)基因作為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)化，引物如下(5′→3′)：CRISP2上游引物5′-CGGACATTACACTCAG-3′，下游引物5′-TTGTTACCCATAGGAC-3′，DEFB1上游引物5′-CTTTCTCCTGGTGATG-3′，下游引物5′-GTTCCCTGTAGTTTGG-3′，GAPDH上游引物5′-CAGCAACTCCCACTCTTCCAC-3′，下游引物5′-TGGTCCAGGGTTTCTTACTC-3′，β-ACTIN上游引物5′-GTACGACCAGAGGCATACA-3′，下游引物5′-AGCACCCTGTGCTGCTCA-3′。

7.蛋白提取與Western 印跡：收集ALKBH5敲除和過(guò)表達(dá)細(xì)胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)，加入RIPA裂解液于冰上裂解30 min。離心收集上清液，加入上樣緩沖液煮沸，得到細(xì)胞總蛋白樣品。采用10% SDS-PAGE 分離膠電泳分離細(xì)胞總蛋白，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉1 h后，于4 ℃一抗孵育過(guò)夜，TBST 洗脫15 min三次，加入二抗室溫孵育2 h，TBST 洗脫15 min三次，顯影。以GAPDH 作為內(nèi)參蛋白。

結(jié)果

1.GC-1細(xì)胞的ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)：通過(guò)Western 印跡檢測(cè)ALKBH5敲除和過(guò)表達(dá)細(xì)胞(sh-ALKBH5、sh-CTL、oe-ALKBH5、oe-CTL)的ALKBH5蛋白表達(dá)(見(jiàn)圖1)，sh-ALKBH5組細(xì)胞ALKBH5表達(dá)顯著低于對(duì)照組(sh-CTL)，oe-ALKBH5組細(xì)胞ALKBH5表達(dá)顯著高于對(duì)照組(oe-CTL)，表明在GC-1細(xì)胞中成功敲除和過(guò)表達(dá)ALKBH5。

2.ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞m6A含量：LC-MS/MS檢測(cè)精子RNA的m6A水平，結(jié)果表明敲除組sh-ALKBH5的 m6A含量(0.337%±0.011%)明顯高于對(duì)照組sh-CTL的m6A 含量(0.293%±0.006%)，P=0.004(見(jiàn)圖2)；過(guò)表達(dá)組oe-ALKBH5細(xì)胞m6A含量(0.214%±0.011%)明顯低于對(duì)照組oe-CTL的m6A 含量(0.256%±0.012%)，P=0.028。

圖2 ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞m6A含量

3.ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞中精子功能相關(guān)基因表達(dá)：熒光定量PCR檢測(cè)ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞中精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的表達(dá)水平，結(jié)果表明敲除ALKBH5，精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1表達(dá)水平下降；過(guò)表達(dá)ALKBH5，CRISP2和DEFB1表達(dá)升高(圖3)。

圖3 ALKBH5敲除及過(guò)表達(dá)細(xì)胞中精子功能相關(guān)基因表達(dá)

討論

m6A是近年來(lái)研究比較熱門(mén)的RNA甲基化修飾，m6A影響mRNA的穩(wěn)定性和功能，可通過(guò)參與mRNA的剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、加工等過(guò)程來(lái)影響基因的表達(dá)[9]。ALKBH5是具有RNA去甲基化活性的AlkB家族蛋白，在人類(lèi)細(xì)胞系中敲除ALKBH5，不僅會(huì)導(dǎo)致總RNA的m6A含量升高，還會(huì)促進(jìn)這些RNA從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)的運(yùn)輸。此外，ALKBH5還影響RNA的初期合成和剪接效率[9]。本研究敲除和過(guò)表達(dá)精原細(xì)胞(GC-1)的m6A去甲基化酶ALKBH5，敲除ALKBH5導(dǎo)致m6A水平升高，過(guò)表達(dá)ALKBH5導(dǎo)致m6A水平降低。由此可見(jiàn)，ALKBH5作為m6A去甲基化酶，在調(diào)控GC-1細(xì)胞m6A過(guò)程中起到重要作用。隨后本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了敲減和過(guò)表達(dá)ALKBH5的精原細(xì)胞精子功能相關(guān)基因CRISP2和DEFB1的mRNA表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)ALKBH5抑制CRISP2和DEFB1基因的表達(dá)，其可能的機(jī)制是ALKBH5促進(jìn)m6A的去甲基化，從而影響CRISP2和DEFB1基因的穩(wěn)定表達(dá)。

CRISP2是不育相關(guān)基因中的潛在候選基因，在弱精子癥病人精子中，CRISP2蛋白水平降低，且CRISP2表達(dá)的降低與低精子活動(dòng)度和不正常的精子形態(tài)具有相關(guān)性[7]。CRISP2敲除小鼠的精子受精能力和Ca2+調(diào)控缺陷導(dǎo)致了小鼠的生殖缺陷[7]。DEFB1是首個(gè)被證實(shí)的β-defensin 家族成員，在不育男性精子中，DEFB1的含量是明顯低于正常精子的，且與精子活動(dòng)度和抗菌活性降低密切相關(guān)。DEFB1與趨化因子受體6(chemokine receptor type 6，CCR6)相互作用，促發(fā)對(duì)精子運(yùn)動(dòng)具有重要作用的Ca2+動(dòng)員，因此在活力異常的男性不育患者中，DEFB1可能具有診斷和治療潛能[8]。本研究在細(xì)胞水平驗(yàn)證了ALKBH5調(diào)控的m6A改變會(huì)引起CRISP2和DEFB1表達(dá)改變，而CRISP2和DEFB1對(duì)精子的功能具有重要影響，由此可以推斷，m6A去甲基化酶ALKBH5通過(guò)影響CRISP2和DEFB1的表達(dá)，而影響精子的功能，這可能也是弱精癥精子活動(dòng)度降低的原因之一。

綜上所述，本研究通過(guò)在小鼠精原細(xì)胞GC-1中干擾和過(guò)表達(dá)ALKBH5，探究ALKBH5調(diào)控的m6A修飾對(duì)精子功能相關(guān)基因的影響，為弱精子癥發(fā)病機(jī)制的研究提供依據(jù)，對(duì)男性不育的研究具有一定的意義。