6個Meckel-Gruber綜合征家系臨床和分子遺傳學(xué)分析

張蔓麗 王利群 李曉青 陳寧 潘亭亭 田亞平 盧彥平

Meckel-Gruber綜合征(Meckel-Gruber Syndrome，MKS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳的初級纖毛病，造成的胎兒畸形涉及多種重要器官，屬于致死性畸形。MKS的發(fā)病率各國報道不一，由于近親婚配的原因，以阿拉伯國家最高，約1/1 300活產(chǎn)嬰，攜帶率1/18[1]，歐洲報道為2.6/10萬[2]。中國發(fā)病率不詳，僅見一些散發(fā)病例報道。MKS在胎兒發(fā)育的早中期即可出現(xiàn)典型的臨床表型，包括腦膜腦膨出、軸后性多指趾、雙側(cè)多囊腎等[3]。但不同MKS病例臨床表型并不完全一致，甚至有些表型與其他疾病如嬰兒型多囊腎(autosomal resessive polycystic kidney disease，ARPKD)等有重疊[4]，容易誤診。課題組前期設(shè)計了含有113個基因的初級纖毛病panel，結(jié)合二代測序技術(shù)，對6個MKS家系查找致病基因突變位點，以此為基礎(chǔ)提供遺傳咨詢，并為有生育要求的家庭進(jìn)行了PGD或產(chǎn)前診斷，幫助其獲得了無MKS疾病的下一代。

對象與方法

一、對象

1.6個MKS家系資料：收集2009年4月—2017年11月于中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的臨床診斷為MKS的6個家系。該6個家系夫妻雙方體健，均無遺傳病家族史。最后一次妊娠MKS胎兒時，妻子年齡均未超過35歲。6個家庭均于妊娠中期常規(guī)引產(chǎn)。家系資料見表1。

表1 家系資料Table 1 Pedigree data

夫妻雙方留取外周肘靜脈血，胎兒留取皮膚或肌肉組織。家系資料通過門診及住院病歷信息獲得。上述樣本和信息的收集均通過本院倫理委員會審查批準(zhǔn)，并獲得家屬知情同意。

二、方法

1.MKS胎兒的臨床診斷：MKS胎兒的臨床診斷依賴超聲結(jié)果[3]，通常包括多囊樣腎臟，并至少包括一個其他經(jīng)典特征，如枕骨腦膨出、多指趾畸形或肝臟發(fā)育異常(如肝膽管板畸形)。產(chǎn)前診斷超聲結(jié)果滿足上述條件即可臨床診斷MKS。

2.DNA提?。禾阂a(chǎn)后立即留取直徑約3～5mm組織(皮膚、肌肉)提取gDNA。留取夫妻二人外周肘靜脈血各5ml。采用常規(guī)十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)提取血液樣本gDNA，采用通用柱式法提取組織樣本gDNA。嚴(yán)格按照試劑盒(MyGenostics,Chongqing,China)說明進(jìn)行。多余組織或血液均凍存于-80℃冰箱。

3.目標(biāo)外顯子結(jié)合高通量測序及結(jié)果判讀、驗證：

(1)文庫構(gòu)建。上述提取的gDNA，采用MyGenostics文庫構(gòu)建試劑盒(MyGenostics Inc，Chongqing，China)，嚴(yán)格按照說明書操作。首先核酸片段化，末端修復(fù)，添加A尾。第二步進(jìn)行接頭連接。第三步連接產(chǎn)物純化。采用磁珠法純化產(chǎn)物。第四步PCR擴(kuò)增，隨后PCR產(chǎn)物純化，同樣采用磁珠法純化產(chǎn)物。

(2)目標(biāo)區(qū)域捕獲。此步采用含有113個基因的初級纖毛病panel進(jìn)行檢測。該panel針對纖毛病相關(guān)的113個基因的編碼外顯子區(qū)域及其側(cè)翼區(qū)域開展針對性捕獲富集，純化后的DNA保存在無酶水中。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit對文庫產(chǎn)物進(jìn)行定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000 Kit)測定文庫片段長度。

(3)上機(jī)測序。將上述質(zhì)檢合格的文庫于Illumina Nextseq 500測序儀上進(jìn)行雙端測序。

(4)生物信息學(xué)分析。原始數(shù)據(jù)下機(jī)后保存為FASTQ格式，質(zhì)控后，使用cutadaptor軟件(http://code.google.com/p/cutadapt/)去除測序接頭、低質(zhì)量序列和短序列(<80bp)。使用BWA軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)將質(zhì)控后的序列比對到人類基因組(UCSC hg19)序列上。使用picard工具(http://broadinstitute.github.io/picard/)去除數(shù)據(jù)中的重復(fù)序列。使用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)的HaplotypeCaller功能獲得序列中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)位點和小片段插入缺失(InDels)變異。使用GATK軟件的VariantFiltration功能完成變異位點的過濾。過濾后數(shù)據(jù)以VCF形式存儲并使用ANNOVA(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)軟件對上述變異進(jìn)行注釋，重點參考1000 genome,ESP6500,dbSNP ,EXAC,Inhouse (MyGenostics),HGMD等數(shù)據(jù)庫，以及PolyPhen-2,MutationTaster,SIFT,GERP++等軟件的預(yù)測結(jié)果。

(5)疑似位點的Sanger驗證。對于panel測出的可疑位點，合成特異性引物，Sanger測序法用ABI3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)區(qū)域捕獲測序后的結(jié)果進(jìn)行比對，高通量測序及一代測序驗證均由北京邁基諾基因科技股份有限公司協(xié)助完成。

結(jié) 果

一、6個家系MKS胎兒表型記錄

6個MKS家系，除家系1的第4名MKS胎兒和家系6的兩名MKS胎兒，其余MKS胎兒均表現(xiàn)出經(jīng)典的“三聯(lián)征”-枕部腦膨出、雙側(cè)多囊腎以及軸后性多指趾(見表1)。家系1的第4名MKS胎兒合并有先天性心臟畸形和唇腭裂。圖1為家系5的MKS胎兒大體解剖圖，提示該名MKS胎兒除經(jīng)典三聯(lián)征外尚有低位耳和短頸表現(xiàn)。

表2 6個家系MKS胎兒臨床表型Table 2 Clinical phenotypes of MKS fetuses fromsix families

Arrows in picture A point to different malformations on MKS fetus from family 5,including low-set ear,postaxial polydactylism and enlarged abdomen.Arrows in picture B point to occipital encephalocele.Picture D and E show postaxial polydactyly.Picture C and F show enlarged abdomen was caused by bilateral polycystic kidneys.圖1 家系5 MKS胎兒表型Figure 1 Clinicalphynotypes of MKS fetus from Family 5

二、二代測序及Sanger驗證結(jié)果

對6個MKS胎兒進(jìn)行二代測序，其中為5個家系找到致病基因及其突變(見圖2)。其中家系3發(fā)現(xiàn)的兩個突變位點CC2D2A(c.347delA，p.E116fs；c.4463_4466del，p.S1488fs)、家系4 的CC2D2A(c.1326delC，p.Q443Rfs*15)突變位點以及家系5的TCTN2(c.343G>T,p.E115X；c.1540C>T,p.Q514X)兩個突變位點均未見報道，涉及突變類型為堿基缺失造成的移碼突變和堿基點突變造成的無義突變。上述致病基因的兩個等位基因突變均分別來源于父母，符合常染色體隱性遺傳模式。

三、6個家系妊娠結(jié)局

對上述6個家系進(jìn)行遺傳咨詢后，家系1進(jìn)入PGD流程，于2012年足月剖宮產(chǎn)一健康男嬰。家系2要求于外院行PGD，追訪未有結(jié)果。家系4要求于本院行PGD，待進(jìn)入流程。家系3、5要求自然受孕，家系3自然受孕后于外地建檔產(chǎn)檢，足月順產(chǎn)一健康男嬰。家系5成功受孕后于我院建檔，孕13周行超聲產(chǎn)前診斷提示胎兒發(fā)育正常，孕婦及家屬拒絕有創(chuàng)檢測，向其告知風(fēng)險后定期常規(guī)產(chǎn)檢，均提示正常，于2017年足月順產(chǎn)一健康女嬰。隨訪至今家系1、3、5的三名幼兒發(fā)育正常。家系6失訪。

Picture A represents sequencing results for five families.Picture B,C and D respectively shows gene mutations in Family 2,3 and 4 sequenced by NGS,verified by Sanger sequencing.Due to the insufficient sample DNA from fetus,one of the gene mutations(CC2D2A c.347delA，p.E116fs) failed to be verified on fetus from Family 4 by Sanger sequencing.圖2 5個家系基因測序圖Figure 2 Sequencing results for five MKS families

討 論

MKS經(jīng)典三聯(lián)征包括多囊腎、腦膜腦膨出、多指/趾畸形。MKS的診斷是否需要同時滿足這三個表型，一直存在爭議[1,5]，因為不同病例報道中這三者的外顯率并不一致。來自于卡塔爾的MKS流行病學(xué)調(diào)查指出此三聯(lián)征在其病人中的檢出率分別為84.2%，92%以及52.6%[6]，而來自歐洲的人群調(diào)查報道MKS中多囊腎患病率為97.7%,腦膨出為 83.8%，多指趾87.3%[7]。本研究收集的6個MKS家系，雖然絕大多數(shù)患病胎兒表型出現(xiàn)了三聯(lián)征，仍有一名MKS胎兒沒有多指/趾畸形表型(見家系1)，出現(xiàn)該情況的原因可能與調(diào)控基因變異相關(guān)[8]。此外家系中有些MKS胎兒還出現(xiàn)了小下頜、心臟畸形、腭裂等表型。因此完全依賴臨床表型三聯(lián)征去診斷MKS存在很大風(fēng)險，必須結(jié)合基因檢測進(jìn)一步明確診斷。

本研究利用二代測序技術(shù)為5個家系找到致病基因突變位點。OMIM記錄的MKS致病基因目前有13個，近年來TMEM237、CEP55也被報道與MKS樣的疾病相關(guān)[9,10]。家系3發(fā)現(xiàn)的CC2D2A兩個突變位點CC2D2A(c.347delA，p.E116fs；c.4463_4466del，p.S1488fs)、家系4 的CC2D2A(c.1326delC，p.Q443Rfs*15)突變位點以及家系5的TCTN2(c.343G>T,p.E115X；c.1540C>T,p.Q514X)兩個突變位點均尚未報道，突變類型為堿基缺失造成的移碼突變和堿基點突變造成的無義突變。CC2D2A基因位于4p15.32，編碼包含1620個氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白1020到1205位被稱為C2結(jié)構(gòu)域，在物種間高度保守[11]。本研究新發(fā)現(xiàn)的CC2D2A三個變異位點一個位于C2結(jié)構(gòu)域，兩個位于N端，均涉及C2結(jié)構(gòu)域改變和C端蛋白喪失。中國漢族人中該基因C2結(jié)構(gòu)域和C端(1205-1620位氨基酸)單體型與智力障礙高度相關(guān)[12]，側(cè)面反映這兩段結(jié)構(gòu)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要關(guān)系。CC2D2A基因也是初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)(trasition zone,TZ)的重要蛋白，作為細(xì)胞“天線”存在的初級纖毛與腎小管發(fā)育密切相關(guān)[13]。因此CC2D2A基因移碼突變影響蛋白功能，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞初級纖毛異常，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟囊性樣變[13]。目前對人類TCTN2基因研究和病例報道及研究極少，因此本研究對家系1[14]和家系5 MKS胎兒(數(shù)據(jù)未展示)腎臟病理切片均進(jìn)行HE染色，觀察腎臟結(jié)構(gòu)，結(jié)果與既往國外文獻(xiàn)報道類似，與其他基因相關(guān)的MKS嚙齒類動物模型腎臟病理改變無明顯區(qū)別。搜索gnomAD(http://gnomad.broadinstitute.org)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)家系5位點TCTN2 c.343G>T，p.E115X突變尚無報道，而位點c.1540C>T ，p.Q514X人群等位基因頻率為4.063e-6。后續(xù)對TCTN2基因兩個新突變的功能試驗提示無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)機(jī)制參與了這對截短蛋白的調(diào)控(數(shù)據(jù)未展示)。TCTN2、TMEM67基因亦位于初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)，多篇研究指出包括CC2D2A、TCTN2、TMEM67在內(nèi)的多個基因所編碼蛋白在初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)形成NPHP 和MKS/JBTS 復(fù)合物，蛋白之間存在互作[15-16]，推測這些基因的改變有可能會不同程度的影響蛋白質(zhì)相互作用，從而影響共同的下游比如信號通路，造成某一類纖毛病。

通過初級纖毛疾病panel檢測，未能為家系6找到致病基因。分析原因可能在于存在此次纖毛病panel未涵蓋的致病基因或新基因、存在大片段缺失重復(fù)、致病位點測序質(zhì)量差、生信分析過程信息被過濾、致病位點在非編碼區(qū)等。2017年課題組再次使用全外顯子測序技術(shù)對此家系進(jìn)行分析，可惜的是仍未找到致病基因。對于此類家系，需要對測序數(shù)據(jù)每年進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的再搜索，必要時使用全基因組測序。

綜上所述，對MKS疾病基因的檢測和致病突變的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了MKS基因突變譜，為后續(xù)的遺傳咨詢奠定了基礎(chǔ)，為深入研究MKS為代表的纖毛病提供了新的案例和依據(jù)。