抽動(dòng)障礙患者血清Sirt1和IL-8水平

劉海春 徐向平

抽動(dòng)障礙(tic disorders，TD)是起病于兒童或青少年時(shí)期的一組綜合征，其特征為不自主的、反復(fù)的、突發(fā)的、快速的、重復(fù)的、無節(jié)律的一個(gè)或多個(gè)部位的運(yùn)動(dòng)抽動(dòng)，伴有或者不伴有發(fā)聲抽動(dòng)。抽動(dòng)障礙一般病程較長，癥狀常反復(fù)變化不定，病情遷延，部分可發(fā)展為難治性抽動(dòng)，嚴(yán)重影響患者身心健康和社會(huì)功能。抽動(dòng)障礙現(xiàn)有的治療藥物相對(duì)副作用大，藥物治療療程較長，用藥總療程1～2年[1]，如果癥狀再發(fā)或加重，則需重新給藥治療甚至考慮加大用藥劑量?；颊哂盟幰缽男圆睿委熜Ч芳?。由此可見深入研究TD的發(fā)病機(jī)制，針對(duì)發(fā)病機(jī)制開展有效治療，具有重要的意義和價(jià)值。

抽動(dòng)障礙的病因目前尚不明確，大量研究證實(shí)其發(fā)病機(jī)制與免疫失調(diào)有關(guān)[2]，患者血液中多種細(xì)胞因子發(fā)生變化，包括TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-12、MCP-1等升高。Sirt1是沉默信息調(diào)節(jié)因子2(silent information regulator2，Sir2)相關(guān)酶1，是一種NAD+依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，其調(diào)節(jié)作用涉及多個(gè)過程，從腫瘤發(fā)生，到神經(jīng)元發(fā)育，到糖脂等物質(zhì)代謝，并且是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器[3]。Sirt1的免疫調(diào)節(jié)作用是近年的研究熱點(diǎn)，大量研究證明其可通過抑制NF-κB及AP-1通路降低TNF-α和多種白介素水平[4]，包括IL-1β、IL-2、IL-6、IL-8等，并可以調(diào)節(jié)MCP-1水平?；赟irt1的免疫調(diào)節(jié)作用以及免疫失調(diào)對(duì)抽動(dòng)障礙發(fā)病的影響，我們推測(cè)Sirt1的表達(dá)水平可能與TD患者免疫失調(diào)有關(guān)。Sirt1作為白介素和TNF-α等多種細(xì)胞因子的調(diào)控因子，它在TD患者血清中有何變化，是否參與TD的免疫調(diào)節(jié)，目前尚未見報(bào)導(dǎo)。IL-8是淋巴細(xì)胞分泌的趨化性細(xì)胞因子，主要趨化并激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)。Sirt1可以通過NF-κB通路抑制IL-8的表達(dá)。有研究表明抽動(dòng)障礙患者血清中多種白介素升高，但細(xì)胞因子IL-8在TD患者血清中有何變化，目前報(bào)導(dǎo)較少。本研究將測(cè)定抽動(dòng)障礙患者血清Sirt1和細(xì)胞因子IL-8水平，以明確TD患者血清IL-8和Sirt1的變化，初步探討Sirt1在TD免疫調(diào)節(jié)中的作用。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2017年8月至2018年1月就診于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科門診及病房且符合抽動(dòng)障礙診斷標(biāo)準(zhǔn)的患兒100人為實(shí)驗(yàn)組，其中男性72例，占72.0%；女性28例，占28.0%，平均年齡：(8.8±2.9)歲。抽動(dòng)障礙的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《美國精神疾病診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第5版(DSM- V)。所有患兒就診時(shí)均未服用《兒童抽動(dòng)障礙診斷與治療專家共識(shí)》[1]推薦使用的治療藥物。選擇同期在哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科門診進(jìn)行體檢的健康兒童78人為對(duì)照組，年齡和性別與抽動(dòng)障礙組相匹配，無免疫性疾病病史，近期無感染及過敏性疾病。其中男性55例，占70.5%；女性23例，占29.5%，平均年齡為(9.6±3.6)歲。本研究通過哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，所有研究對(duì)象家長均簽署知情同意書。

二、血清Sirt1蛋白及IL-8濃度的檢測(cè)

取抽動(dòng)障礙患者組及健康對(duì)照組空腹靜脈血5 ml，于室溫下靜置2 h，離心(3000轉(zhuǎn)×10 min)，分離血清，-20 ℃冰箱貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.血清Sirt1蛋白濃度的檢測(cè)：(1)將-20 ℃冰箱貯存的血清在檢測(cè)前12 h移入4℃冰箱，檢測(cè)前室溫下放置30 min；(2)將人血清Sirt1的ELISA試劑盒(EK-Bioscience，上海酶研生物科技有限公司)放置室溫中平衡20 min，充分混勻各試劑；(3)向標(biāo)準(zhǔn)品孔分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50 ul(S0為空白孔)，Sirt1標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為：0 ng/ml、1.25 ng/ml、2.5 ng/ml、5 ng/ml、10 ng/ml、20 ng/ml；(4)依次向樣本孔加入樣本稀釋液和待測(cè)樣本，加入量分別為40 ul和10 ul；(5)將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體加入標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中，每孔加入100 ul，空白孔(S0)不加，然后用封板膜密封反應(yīng)孔，于微量振蕩器上充分混勻30 s，立即放入37℃恒溫箱中溫育60 min；(6)向洗液瓶中加入蒸餾水475 ml，再加濃縮洗滌緩沖液25 ml，混勻；(7)取出溫育后的酶標(biāo)板，將液體棄去，在吸水紙上拍干，把配置好的洗滌液加入各孔中，加滿后靜置1 min，甩去洗滌液，再次于吸水紙上拍干酶標(biāo)板，重復(fù)洗板5次，方法同前；(8)每孔加入底物A 50 ul，加入底物B 50 ul，37 ℃避光孵育15 min；(9)取終止液加入各孔，每孔50 ul，立即用酶標(biāo)儀在450 nm波長條件下測(cè)定各孔的OD值；(10)使用Excel 2010繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，其中橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為對(duì)應(yīng)的OD值，通過曲線方程和樣本OD值，計(jì)算對(duì)應(yīng)樣本濃度。將計(jì)算值放大5倍后得到最終Sirt1濃度值。

2.血清IL-8濃度的檢測(cè)：準(zhǔn)備好需檢測(cè)的血清樣本和人血清IL-8的ELISA試劑盒(EK-Bioscience，上海酶研生物科技有限公司)，IL-8標(biāo)準(zhǔn)品(S0-S5)濃度依次為：0 pg/ml、7.5 pg/ml、15 pg/ml、30 pg/ml、60 pg/ml、120 pg/ml，檢測(cè)過程同上述血清Sirt1檢測(cè)方法。血清Sirt1和IL-8濃度檢測(cè)全部樣品同批次完成。

結(jié) 果

一、抽動(dòng)障礙組和對(duì)照組基線資料比較：抽動(dòng)障礙組和健康對(duì)照組基線資料比較，TD組平均年齡為(8.8±2.9)歲，對(duì)照組平均年齡為(9.6±3.6)歲，兩組平均年齡經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)結(jié)果顯示，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；TD組男72例，女28例，對(duì)照組男55例，女23例，兩組性別經(jīng)χ2檢驗(yàn)結(jié)果顯示，性別比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。說明兩組樣本基線資料基本一致，具有可比性。

表1 TD組和健康對(duì)照組基線資料比較Table1 Comparison of baseline characteristics between TD group and control group

二、血清Sirt1和IL-8濃度測(cè)定結(jié)果：采用ELISA方法測(cè)定的Sirt1濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線曲線方程為y=0.0906x+0.0037，相關(guān)系數(shù)R值為0.9988，詳見圖1。TD組血清Sirt1濃度值為(19.1±8.8) ng/ml，對(duì)照組血清Sirt1濃度值為(23.3±9.9)ng/ml，兩組血清Sirt1濃度比較顯示，TD組明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表2。采用ELISA方法測(cè)定的IL-8濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.019x+0.0781，相關(guān)系數(shù)R值為0.9953，詳見圖2。TD組血清IL-8濃度值為(141.6±53.6)pg/ml，對(duì)照組血清IL-8濃度值為(157.0±61.1)pg/ml，兩組血清IL-8濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 TD組和健康對(duì)照組Sirt1、IL-8濃度比較Table 2 Comparison of Sirt1 and IL-8 concentration between TD group and control group

圖1 采用ELISA方法測(cè)定的Sirt1標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 1 Standard curve of Sirt1 measured by ELISA method

圖2 采用ELISA方法測(cè)定的IL-8標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2 Standard curve of IL-8 measured by ELISA method

討 論

抽動(dòng)障礙病因復(fù)雜，目前尚不明確，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為遺傳因素、神經(jīng)遞質(zhì)的失衡、神經(jīng)元異常、激素和微量元素水平、社會(huì)精神因素都參與了抽動(dòng)障礙的發(fā)病[5]，近年來越來越多證據(jù)表明，免疫功能紊亂在抽動(dòng)障礙的發(fā)病機(jī)制中也占有重要地位。

臨床上抽動(dòng)障礙患兒在某次細(xì)菌或病毒感染后常出現(xiàn)癥狀加重或病情反復(fù)的現(xiàn)象，利用細(xì)菌或病毒模仿主動(dòng)免疫可建立Tourette綜合征(tourette syndrome，TS)動(dòng)物模型，這些都間接印證了抽動(dòng)障礙可能與免疫紊亂關(guān)系密切。自從鏈球菌感染相關(guān)性兒童自身免疫性神經(jīng)精神障礙(pediatric autoimmune neuropsychiatric disorders associated with streptococcal infections，PANDAS)概念的提出學(xué)者們發(fā)現(xiàn)抽動(dòng)障礙的發(fā)生與鏈球菌感染有一定關(guān)系。后來另一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)多數(shù)TS患者血清或腦脊液中存在大量的抗神經(jīng)元抗體，且這種抗體又可以誘導(dǎo)與TS癥狀相似的抽動(dòng)動(dòng)物模型。學(xué)者們對(duì)TS患者細(xì)胞因子和免疫球蛋白的檢測(cè)，對(duì)淋巴細(xì)胞亞群和外周淋巴細(xì)胞基因表達(dá)譜的研究，發(fā)現(xiàn)抽動(dòng)障礙患者可能存在過度活躍的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答[2]。

近年來許多學(xué)者對(duì)抽動(dòng)障礙伴有或不伴有強(qiáng)迫障礙的患者外周血細(xì)胞因子進(jìn)行了檢測(cè)并得出結(jié)論：IL-12和IL-2在TD發(fā)病中起一定作用，且血清IL-2濃度與抽動(dòng)嚴(yán)重程度評(píng)分呈正相關(guān)[6]；TS患者血IL-1β，IL-6，IL-17等均顯著升高，抗核抗體陽性，抗鏈球菌溶血素陽性[7]；細(xì)胞因子紊亂在抽動(dòng)障礙的發(fā)病機(jī)制中扮演了重要角色，并且監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子，特別是TNF-α，對(duì)診斷有潛在的幫助[8]。Yeon等人排除共患病和藥物的影響，對(duì)患者血清炎性細(xì)胞因子進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者血清lL-12和TNF-α升高，并且未服藥患者TNF-α更高[9]。Gariup等人對(duì)包括情感障礙、適應(yīng)障礙、抽動(dòng)障礙、焦慮癥和強(qiáng)迫癥的精神神經(jīng)障礙患者進(jìn)行了多種細(xì)胞因子的測(cè)定，結(jié)果顯示IL-8在所有類型的患者中均有顯著增高[10]，但研究中抽動(dòng)障礙患者例數(shù)較少；與此不同，程德君等研究發(fā)現(xiàn)，抽動(dòng)障礙患兒血清IL-8并未發(fā)生顯著變化[11]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為TD患者血清中多種細(xì)胞因子水平升高，細(xì)胞因子的紊亂可能參與了TD的發(fā)生，其介導(dǎo)的炎癥通路可能是TD發(fā)病的重要機(jī)制。IL-8是淋巴細(xì)胞分泌的趨化性細(xì)胞因子，主要趨化并激活中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)IL-8能作用于不同細(xì)胞，它可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)程、刺激血管的形成、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等，與多種免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。本研究檢測(cè)抽動(dòng)障礙患者的血清IL-8水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示抽動(dòng)障礙患兒和健康兒童的血清IL-8水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，此結(jié)果與程德君等檢測(cè)TD患者血清IL-8結(jié)果相同。但Gariup等人檢測(cè)發(fā)現(xiàn)抽動(dòng)障礙患者血IL-8水平升高，此結(jié)果可能與其實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的TD患者只有8例有關(guān)，而本研究檢測(cè)的TD患者有100例，可以避免患者例數(shù)過少引起的誤差。

Sirt1是一種NAD+依賴性蛋白質(zhì)脫乙酰酶，其調(diào)節(jié)功能參與了腫瘤發(fā)生、神經(jīng)元發(fā)育、物質(zhì)代謝等過程，并且是免疫反應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)器。研究證明Sirt1主要通過NF-κB和AP-1通路[4]抑制促炎細(xì)胞因子的釋放，降低TNF-α和多種白介素水平，在炎癥性疾病的調(diào)控中起重要作用。

核因子NF-κB是一種普遍表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，可控制許多參與炎癥的基因表達(dá)，因此NF-κB通路是刺激炎癥細(xì)胞因子和淋巴細(xì)胞活化的中心信號(hào)傳導(dǎo)節(jié)點(diǎn)。Sirt1可使NF-κB脫乙?；?，抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性[12]。而NF-κB通路的抑制可以減少巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等產(chǎn)生炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、MCP-1、COX-2等。除了NF-κB途徑，核因子AP-1轉(zhuǎn)錄活性在免疫應(yīng)答的激活中也具有重要作用。Sirt1與AP-1的亞基相互作用，并在T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中去乙?；疉P-1，抑制AP-1通路，減少IL-2的產(chǎn)生。

Barroso等人通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)Sirt1的激活可以抑制TNF-α誘導(dǎo)的NF-κB活化，從而降低NF-κB靶基因IL-8的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，而在Sirt1抑制劑存在的情況下，細(xì)胞中IL-8 mRNA的水平則不降低[13]。Sadarani等人對(duì)慢性阻塞性肺病(Chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者研究表明，白藜蘆醇和地塞米松聯(lián)用可以降低COPD患者肺泡灌洗液中白細(xì)胞和TNF-α、IL-8等炎癥因子水平，而使用sirtinol(Sirt1抑制劑)后，其抑制炎癥因子的作用基本消除[14]。Kim等人研究證實(shí)，一氧化碳的處理增加了缺血再灌注損傷肝細(xì)胞中Sirt1的表達(dá)，并且減少了肝臟中TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子[15]。Lv等人通過對(duì)腦卒中大鼠腦組織中Sirt1和細(xì)胞因子的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，丹酚酸B可以激活Sirt1，抑制炎癥反應(yīng)，降低卒中大鼠腦組織中的TNF-α、IL-1β水平，減少細(xì)胞凋亡，起到保護(hù)腦組織的作用[16]。

Sirt1具有抑制炎癥反應(yīng)、調(diào)節(jié)免疫功能的作用，對(duì)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、自身免疫性腦脊髓炎等多種免疫相關(guān)性疾病有抑制作用。本研究檢測(cè)抽動(dòng)障礙患兒血清Sirt1水平，結(jié)果顯示抽動(dòng)障礙患兒血清Sirt1水平較健康兒童明顯降低(P<0.005)，這表明Sirt1水平的降低可能導(dǎo)致免疫紊亂，參與抽動(dòng)障礙的發(fā)生。

綜上所述，抽動(dòng)障礙患者血清Sirt1濃度降低，提示Sirt1可能調(diào)節(jié)免疫，參與抽動(dòng)障礙的發(fā)生。