醫(yī)院感染分子生物學(xué)研究方法進(jìn)展

邵宜波 顧有為 李旭

[摘要] 為建立合理的感染控制措施，醫(yī)院感染病原菌流行病學(xué)調(diào)查非常重要。本文闡述了在醫(yī)院感染領(lǐng)域運(yùn)用分子流行病學(xué)調(diào)查方法的進(jìn)展，并列舉了其在醫(yī)院感染暴發(fā)流行病調(diào)查中的應(yīng)用。分子生物學(xué)方法主要包括兩類：DNA檢測(cè)技術(shù)，如擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、質(zhì)粒指紋圖譜分析、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)、DNA測(cè)序技術(shù)等;蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，如多位點(diǎn)酶電泳法、免疫印跡技術(shù)。各種方法均有優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際操作中選用何種分型方法，應(yīng)根據(jù)情況來選擇。合理的分子流行病學(xué)分型方法的使用對(duì)醫(yī)院感染控制工作非常重要。

[關(guān)鍵詞] 醫(yī)院感染;流行病學(xué)分型;分子生物學(xué);進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R181? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（c）-0038-04

The progress in research methods in molecular biology of nosocomial infection

SHAO Yibo? ?GU Youwei? ?LI Xu

Department of Infection Management， the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University， Anhui Province， Hefei? ?230022， China

[Abstract] The epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is crucial to establish reasonable infection control measures. In this paper， the progress of molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection pathogens is described， and the application of some molecular biological methods in the epidemiological investigation of nosocomial infection outbreaks is listed. These molecular typing methods can be categorized into two main groups： DNA-based methods， such as amplified fragment length polymorphism， plasmid fingerprinting， polymerase chain reaction， pulsed field gel electrophoresis and DNA sequencing technology; protein-based methods， such as mutilocus enzyme electrophoresis and immunoblotting. Both kinds of methods have advantages and disadvantages. Therefore， which typing method is employed in practice should be selected based on the situation. It is very important for nosocomial infections to use a reasonable molecular biological typing method.

[Key words] Nosocomial infection; Epidemiologic typing; Molecular biology; Progress

醫(yī)院感染具有明顯的致死與致殘率非常高的特點(diǎn)，已經(jīng)成為住院患者健康及患者預(yù)后的最大影響因素。醫(yī)院感染的發(fā)生與各種微生物都有關(guān)，其中最為常見的是細(xì)菌。近年來感染控制領(lǐng)域難題及焦點(diǎn)是多重耐藥菌的感染，為提供有效的感染控制措施，醫(yī)院感染流行病學(xué)調(diào)查非常重要，這就需要了解病原菌在醫(yī)院內(nèi)的親緣關(guān)系和分布。我們通常采用各種分型技術(shù)來確定病原菌的親緣性，其中傳統(tǒng)分型法如細(xì)菌素、噬菌體和血清學(xué)分型等，這些分型法雖然有用，但容易受多種因素的影響，有很大的變異性，其重復(fù)性不佳，工作時(shí)間長(zhǎng)，工作量也大，不利于醫(yī)院感染的監(jiān)控。目前采用核酸技術(shù)分析醫(yī)院感染發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，能更加精準(zhǔn)高效地完成醫(yī)院感染的管理控制，已經(jīng)成為國(guó)際醫(yī)院感染管理研究中的重要方向。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)在實(shí)驗(yàn)診斷中的廣泛應(yīng)用，分子生物學(xué)方法在醫(yī)院感染的暴發(fā)事件定性判定、醫(yī)院感染的引發(fā)病原菌定型判定、醫(yī)院感染的溯源等方面發(fā)揮日益顯著的作用[1-2]。

目前，在預(yù)防醫(yī)學(xué)、醫(yī)院感染的預(yù)防控制、細(xì)菌流行病學(xué)等領(lǐng)域已廣泛采用分子基因分型技術(shù)，如脈沖場(chǎng)凝膠電泳技術(shù)、多位點(diǎn)序列分型技術(shù)、限制性內(nèi)切酶技術(shù)、質(zhì)粒指紋圖譜分析方法等。而使用合理的分子生物學(xué)分型方法，對(duì)醫(yī)院感染工作非常重要。本文就醫(yī)院感染常用的分型方法展開綜述，重點(diǎn)闡述各種方法的原理和最新研究進(jìn)展，并對(duì)其應(yīng)用情況和優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行討論。

1 DNA檢測(cè)技術(shù)

決定一切生物物種最基本的因子就是DNA分子上的功能片段——基因，它是遺傳信息的基本單位，醫(yī)院感染流行病學(xué)分析的重要方法之一是DNA檢測(cè)技術(shù)，它不需要特殊儀器、設(shè)備，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省時(shí)間，穩(wěn)定性和可重復(fù)性較高，可以廣泛用于病原體分型。DNA檢測(cè)的圖譜具有高度特異性，可以從基因水平來進(jìn)行分型，可將不同菌株區(qū)分開來。缺點(diǎn)是受核酸酶消化、提取技術(shù)及電泳條件等影響，難以統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。

1.1 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（AFLP）分析

作為一種新的分子標(biāo)記技術(shù)——AFLP技術(shù)，該技術(shù)已被廣泛用于基因組遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位以及生物進(jìn)化和分類的研究。通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)擴(kuò)增基因組DNA特定片段，先用限制性內(nèi)切酶切割基因組DNA，然后將雙鏈接頭連接到DNA片段的末端，接頭序列和相鄰的限制性位點(diǎn)序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性分析。AFLP結(jié)合了限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）和PCR技術(shù)高效性和穩(wěn)定性的優(yōu)點(diǎn)，擴(kuò)增出現(xiàn)特定的DNA條帶可以作為一種分子標(biāo)記，即引物誘導(dǎo)及DNA擴(kuò)增后得到的多態(tài)DNA。由于基因組的序列差異及酶切時(shí)產(chǎn)生的片段長(zhǎng)度、大小不完全相同，不同菌株之間的差異通過擴(kuò)增便能顯示出來，圖譜上表現(xiàn)為多種條帶圖形。可作為不同實(shí)驗(yàn)室之間的標(biāo)準(zhǔn)比較[3-4]。另外AFLP產(chǎn)量多，時(shí)間效率高，對(duì)細(xì)菌的分型和鑒定的操作重復(fù)性較強(qiáng)，因此，在調(diào)查公共衛(wèi)生流行病學(xué)時(shí)更有代表性和權(quán)威性。然而，AFLP依賴昂貴的儀器設(shè)備與耗材，阻礙了AFLP的普及應(yīng)用。

1.2 質(zhì)粒指紋圖譜分析

質(zhì)粒含有多種耐藥基因，是位于細(xì)菌染色體外的遺傳物質(zhì)。質(zhì)粒分析的基本原理是根據(jù)質(zhì)粒DNA電泳條帶所構(gòu)成的特異性圖譜對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行指紋圖譜分析，適用于許多細(xì)菌，有助于醫(yī)院感染流行病學(xué)原因調(diào)查分析。目前質(zhì)粒分析方法已簡(jiǎn)化，費(fèi)用已降低，具體步驟是將細(xì)菌質(zhì)粒提取進(jìn)行常規(guī)凝膠電泳，用限制性核酸內(nèi)切酶如EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ切割細(xì)菌質(zhì)粒，再分析切割出的片段長(zhǎng)度和數(shù)目，提高細(xì)菌的鑒別能力。該方法具有諸多特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)，優(yōu)點(diǎn)是實(shí)驗(yàn)操作難度較低、實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較短、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)開銷較小;該方法的缺陷在于部分細(xì)菌不含質(zhì)粒、部分細(xì)菌的質(zhì)粒會(huì)自發(fā)丟失，基因重排會(huì)改變酶切酶譜[5]。

1.3 PCR

PCR由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間短且操作過程簡(jiǎn)便，被廣泛應(yīng)用。PCR一般用限制性核酸內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物后通過電泳方法來分析結(jié)果。目前在實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用比較成熟的以PCR為基礎(chǔ)的方法主要有以下三種：隨機(jī)引物PCR（AP-PCR）、tRNA-PCR和rep-PCR。AP-PCR是將目的DNA用一段短序列隨機(jī)擴(kuò)增一些片段，根據(jù)這些片段來進(jìn)行病原體分型。tRNA-PCR是使用tRNA基因作為引物來擴(kuò)增目的病原體的DNA。rep-PCR是由于細(xì)菌基因組中廣泛分布著短重復(fù)序列，即基因外重復(fù)回文序列（REP），通過擴(kuò)增這些系列來獲得菌株特異性圖譜[6]。但這三種方法也有其局限性，AP-PCR重復(fù)性較低，tRNA-PCR鑒別力較差，rep-PCR引物較長(zhǎng)，因此需要較高的退火溫度。Percin等[7]通過rep-PCR將多黏菌素耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌分為三個(gè)不同的克隆型。Senok等[8]使用rep-PCR技術(shù)研究鮑曼不動(dòng)桿菌造成的醫(yī)院流行暴發(fā)。相比傳統(tǒng)PCR技術(shù)，rep-PCR優(yōu)點(diǎn)明確：轉(zhuǎn)化效率高、時(shí)間效率高、DNA需要量較小，可用于耐藥基因的檢測(cè)[9-10]。

1.4 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

1984年Schwartz等[11]第一次使用PFGE技術(shù)成功分離釀酒酵母染色體DNA。作為細(xì)菌分子流行病學(xué)分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”，PFGE技術(shù)具有分辨率高、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，是一種被普遍適用的分子檢測(cè)技術(shù)，在細(xì)菌及真菌的分型上，顯示出較好的鑒別力和重復(fù)性。在常規(guī)凝膠電泳的基礎(chǔ)上，PFGE通過不斷變化電場(chǎng)強(qiáng)度，使大片段DNA分子加速溶解。用低頻裂解限制性核酸內(nèi)切酶把目標(biāo)染色體DNA（細(xì)菌或真菌）切成多個(gè)大小不等的片段，然后進(jìn)行電泳分析。其特點(diǎn)是對(duì)樣品需求量小，操作方便，費(fèi)時(shí)少，分辨率、靈敏度較高。一般情況下，PFGE圖譜在細(xì)菌的暴發(fā)流行株間相似，容易判斷[12-13]。但是一旦染色體發(fā)生變異事件，如DNA缺失、插入或點(diǎn)突變時(shí)，其圖譜條帶就有相應(yīng)改變。目前，PFGE已成功應(yīng)用于細(xì)菌的流行病學(xué)研究[14-17]。但是，PFGE圖譜分析，花費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，過程細(xì)節(jié)多，操作步驟與操作人員技術(shù)高低有關(guān)，如果圖譜結(jié)果不一致，就會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果之間的比較產(chǎn)生影響，且實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，使用的儀器及材料較多、較貴。目前已出現(xiàn)了第二代快速的PFGE方法進(jìn)行基因分型，這無疑對(duì)PFGE起到積極的推動(dòng)作用。

1.5 DNA測(cè)序技術(shù)

隨著DNA測(cè)序方法的改進(jìn)，細(xì)菌分子分型技術(shù)也日益成熟，其中下述兩種DNA測(cè)序技術(shù)發(fā)展較快。

1.5.1 多位點(diǎn)序列分型（MLST）? MLST主要基于核酸序列測(cè)定，它已成為細(xì)菌的常規(guī)分型方法。通過PCR擴(kuò)增多個(gè)管家基因內(nèi)部片段來測(cè)定其序列，可以在全球不同實(shí)驗(yàn)室之間分析比較不同菌株的差異。優(yōu)點(diǎn)是更加快速和準(zhǔn)確、適合流行病學(xué)調(diào)查，由于可以快速比較分析細(xì)菌的流行病學(xué)和進(jìn)化研究方面數(shù)據(jù)結(jié)果，更有利于臨床及時(shí)采取有效的控制措施[18]。國(guó)內(nèi)學(xué)者最近也用該方法來研究屎腸球菌和糞腸球菌等具有耐藥特性菌株的遺傳背景[19]。該方法通過PCR擴(kuò)增測(cè)序分析不同的管家基因內(nèi)部片段序列型（ST），然后通過比較ST對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型。MLST可通過研究管家基因與參考菌株的相應(yīng)序列構(gòu)建進(jìn)化樹來判斷菌種歸屬，可以用于菌株的鑒定及變異[20]。有人用PFGE和MLST方法對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特菌開展了分型方面的研究[21]。Mezzatesta等[22]研究鮑曼不動(dòng)桿菌時(shí)發(fā)現(xiàn)，MLST和PFGE在分辨力和可重復(fù)性方面是相同的，該技術(shù)可直接分析臨床標(biāo)本，操作簡(jiǎn)便、實(shí)用型強(qiáng)，數(shù)據(jù)可實(shí)現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)共享，越來越多地被作為進(jìn)行國(guó)際間菌株比較的常用工具、進(jìn)行生物進(jìn)化和種群結(jié)構(gòu)的研究。但該技術(shù)的不足之處是必須事先掌握待檢測(cè)微生物的基因組序列，才能推測(cè)出該微生物的決定基因，因該方法對(duì)DNA測(cè)序的依賴程度太高且實(shí)驗(yàn)費(fèi)用較昂貴，制約了其應(yīng)用范圍。

1.5.2 高通量測(cè)序技術(shù)（深度測(cè)序技術(shù)）? 該技術(shù)的誕生是基因組學(xué)研究領(lǐng)域的一個(gè)里程碑，使一個(gè)物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組序列全面分析成為可能，所以又被稱為深度測(cè)序。與第一代測(cè)序技術(shù)相比，該技術(shù)極大降低了核酸測(cè)序單堿基的成本。以人類基因組測(cè)序?yàn)槔?0世紀(jì)末進(jìn)行的人類基因組計(jì)劃花費(fèi)30億美元解碼了人類生命密碼，而第二代測(cè)序使人類基因組測(cè)序進(jìn)入萬（美）元基因組時(shí)代。降低的單堿基測(cè)序成本可以揭示更多生物物種的基因組遺傳密碼。同時(shí)在已完成基因組序列測(cè)定的物種中，對(duì)其大規(guī)模的全基因組重測(cè)序也成為現(xiàn)實(shí)。它具有檢測(cè)速度快、全面、錯(cuò)誤少及數(shù)量大等特點(diǎn)，相對(duì)于傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)，高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)定序列量大，可以一次對(duì)多達(dá)幾百萬條DNA分子同時(shí)進(jìn)行序列測(cè)定[23-24]，可見其對(duì)時(shí)代變化的影響。有研究表明[25-26]，該技術(shù)對(duì)微生物多樣性分析研究效果較好。雖然測(cè)序速度快，但測(cè)序所需儀器價(jià)格較高，且對(duì)大數(shù)據(jù)的分析處理過程復(fù)雜，因此不適合小規(guī)模測(cè)序。

2 蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)

2.1 多位點(diǎn)酶電泳法

多位點(diǎn)酶電泳法又稱同工酶電泳法，可用于病原體分型，對(duì)臨床細(xì)菌具有一定的分型能力，原理是根據(jù)在凝膠中的蛋白質(zhì)電泳遷移率不同來進(jìn)行分型，而電泳遷移率不同是由于氨基酸不同造成的，將蛋白電泳后結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果來進(jìn)行分型比較。應(yīng)用在分子流行病學(xué)和遺傳學(xué)方面，比傳統(tǒng)的細(xì)菌分類學(xué)方法具有更多的優(yōu)勢(shì)，可以分辨出被檢測(cè)的所有菌株的型別，解釋菌株的群體遺傳差異及兩菌株的遺傳距離等。從實(shí)驗(yàn)過程來說，此操作流程比較簡(jiǎn)單，不需要特殊的儀器，PCR探針雜交等技術(shù)成本便宜，適宜于基層單位推廣應(yīng)用。盡管如此，作為一種方法，多位點(diǎn)酶電泳法還是有它的局限性，譬如有的病原體不含有某一同工酶，另外，很多的因素可以影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2.2 免疫印跡技術(shù)

免疫印跡法又稱蛋白質(zhì)印跡法，它是在凝膠電泳和固相免疫測(cè)定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù)?？梢酝ㄟ^特異性抗原抗體反應(yīng)來檢測(cè)某種蛋白是否存在于樣品中。其具有高分辨力、高特異性、強(qiáng)敏感性的優(yōu)點(diǎn)，已成為檢測(cè)蛋白質(zhì)表達(dá)與分布特性最有效且最常規(guī)的技術(shù)[27]。目前在醫(yī)院感染的流行病學(xué)分析方面取得一定的效果，其操作是將電泳后的細(xì)菌蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維膜上，與相應(yīng)的抗體反應(yīng)后，用酶標(biāo)第二抗體來測(cè)定目標(biāo)細(xì)菌的抗原。但該技術(shù)缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移過程容易出現(xiàn)大量干擾條帶，同時(shí)易受操作者提取技術(shù)和細(xì)菌自身環(huán)境影響。

3 小結(jié)

通過對(duì)各種類型方法的綜述，不同類型的分型技術(shù)具有各自的長(zhǎng)處和短處。實(shí)際操作中選用何種分型方法，應(yīng)參照指標(biāo)與需求來選取。既要考慮到分辨能力又要考慮到實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，同時(shí)要綜合實(shí)驗(yàn)成本、實(shí)驗(yàn)室資源以及實(shí)驗(yàn)者本身的操作技能和知識(shí)水平。

[參考文獻(xiàn)]

[1]? Somily AM，Al-Mohizea MM，Absar MM，et al. Molecular epidemiology of vancomycin resistant enterococci in a tertiary care hospital in Saudi Arabia [J]. Microb Pathog，2016，97（8）：79-83.

[2]? Suzuki M，Koyano S，Okugawa S，et al. Diversity of vancomycin-resistant enterococci in a low endemicity area [J]. J Glob Antimicrob Resist，2014，2（2）：115-118.

[3]? Zou K，Zhang D，Guo H，et al. A preliminary study for identification of candidate AFLP markers under artificial selection for shell color in pearl oyster Pinctada fucata [J]. Gene，2014，542（1）：8-15.

[4]? Ipek M，Seker M，Ipek A，et al. Identification of molecular markers associated with fruit traits in olive and assessment of olive core collection with AFLP markers and fruit traits[J]. Genet Mol Res，2015，14（1）：2762-2774.

[5]? 馬雪嬌，程君，胡立芬，等.臨床分離弗勞地枸櫞酸桿菌耐藥性分析及質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC酶基因檢測(cè)[J].安徽醫(yī)學(xué)，2019，40（9）：966-970.

[6]? Zhong Z，Chai T，Duan H，et al. REP-PCR tracking of the origin and spread of airborne Staphylococcus aureus in and around chicken house [J]. Indoor Air，2009，19（6）：511-516.

[7]? Percin D，Akyol S，Kalin G. In vitro synergism of combinations of colistin with selected antibiotics against colistin-resistant Acinetobacter baumannii [J]. GMS Hyg Infect Control，2014，9（2）：1-5.

[8]? Senok A，Garaween G，Raji A，et al. Genetic relatedness of clinical and environmental Acinetobacter baumanii isolates from an intensive care unit outbreak [J]. J Infect Dev Ctries，2015，9（6）：665-669.

[9]? Prasertsee T，Chokesajjawatee N，Santiyanont，et al. Quantification and rep-PCR characterization of Salmonella spp. in retail meats and hospital patients in Northern Thailand [J]. Zoonoses Public Health，2019，66（3）：301-309.

[10]? 劉琳，陳勇，韓黎，等.臨床分離不動(dòng)桿菌對(duì)耐碳青霉烯類耐藥表型與基因分型特征研究[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志，2018，35（6）：423-427.

[11]? Schwartz DC，Cantor CR. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis [J]. Cell，1984，37（1）：67-75.

[12]? Casarez EA，Pillai SD，Giovanni GDD. Genotype diversity of Escherichia coli isolates in natural waters determined by PFGE and ERIC-PCR [J]. Water Res，2007，41（16）：3643-3648.

[13]? Deekshit VK，Kumar BK，Rai P，et al. Antibiotic Resistance and Molecular Characterization of Seafood Isolates of Nontyphoidal Salmonella by PFGE [J]. Procedia Food Sci，2016，6：334-338.

[14]? Lytsy B，Engstrand L，Gustafsson A，et al. Time to review the gold standard for genotyping vancomycin-resistant enterococci in epidemiology：comparing whole-genome sequencing with PFGE and MLST in three suspected outbreaks in Sweden during 2013-2015 [J]. Infect Genet Evo，2017，54：74-80.

[15]? Arshadi M，Douraghi M，Shokoohizadeh L，et al. High prevalence of diverse vancomycin resistance Enterococcus faecium isolates in clinical and environmental sources in ICU wards in southwest of Iran [J]. Microb Pathog，2017， 111：212-217.

[16]? 張聰，李彩云，褚紅娜，等.2017-2018年河北省承德市蛋類樣品沙門氏菌脈沖場(chǎng)電泳分型及耐藥性分析[J].醫(yī)學(xué)動(dòng)物防制，2020，36（4）：352-355.

[17]? ？譧lvarez-Narváez S，Logue CM，Barbieri NL，et al. Comparing PFGE，MLST and WGS in monitoring the spread of macrolide and rifampin resistant Rhodococcus equi in horse production [J]. Vet Microbiol，2020，242：108571.

[18]? 黃振洲，于可藝，代航，等.麥?zhǔn)匣【辔稽c(diǎn)序列分型方法的建立與應(yīng)用[J].疾病監(jiān)測(cè)，2020，35（1）：75-80.

[19]? 鄒紹偉，王占黎，王英，等.屎腸球菌和糞腸球菌多位點(diǎn)序列分型及耐藥相關(guān)性[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2018， 13（1）：22-26，33.

[20]? 溫偉洪，梁英健，馬芙蓉，等.耐碳青霉烯腸桿菌科細(xì)菌碳青霉烯酶檢測(cè)與多位點(diǎn)序列分型分析[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2019，34（7）：577-582.

[21]? 霍哲，王晨，徐俊，等.北京市西城區(qū)食源性與臨床感染性單核細(xì)胞李斯特菌PFGE和MLST分型研究[J].中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2017，8（9）：675-679.

[22]? Mezzatesta ML，D′Andrea MM，Migliavacca R，et al. Epidemiological characterization and distribution of carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，clinical isolates in Italy [J]. Clin Microbiol Infect，2012，18（2）：160-166.

[23]? 陳定強(qiáng)，楊羚.基于高通量測(cè)序的多重耐藥大腸埃希菌HX43耐藥分子機(jī)制分析[J].廣州醫(yī)藥，2017，48（3）：7-11.

[24]? 劉鳳姣，楊海紅，吳燕，等.深度測(cè)序篩選調(diào)控小鼠骨骼肌細(xì)胞乙酰膽堿受體聚集簇形成的差異基因[J].生物技術(shù)通訊，2017，28（6）：715-724.

[25]? 余今菁，李歡，胡邱宇，等.基于高通量測(cè)序技術(shù)的潰瘍性結(jié)腸炎患者腸道菌群多樣性研究[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2018，47（4）：460-465.

[26]? 杜喜峰，馮晉興，于愛真，等.深度測(cè)序分析早產(chǎn)兒壞死性小腸結(jié)腸炎腸道菌群多樣性變化[J].中國(guó)婦幼保健，2017，32（19）：4700-4702.

[27]? 湯加勇，趙華.細(xì)胞樣Western Blot分析技術(shù)探討[J].實(shí)驗(yàn)科學(xué)與技術(shù)，2017，6（15）：53-55，75.

（收稿日期：2020-03-10）