??????湘南臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)及內(nèi)生細(xì)菌的分離

雷平 黃彬彬 黃軍 畢世宇 郭照輝 劉清術(shù) 唐瀅

摘 要：為確保湘南臍橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展安全，嚴(yán)格防控柑橘黃龍病，從湘南地區(qū)幾個(gè)臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品，利用文獻(xiàn)報(bào)道的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)常用引物對(duì)樣品進(jìn)行分子檢測(cè)，并從病株組織中分離內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析鑒定。結(jié)果表明：在柑橘黃龍病的常規(guī)PCR檢測(cè)中，湘南臍橙總核酸對(duì)P400引物的靈敏度最高，是湘南地區(qū)臍橙中柑橘黃龍病害常規(guī)PCR檢測(cè)的最佳引物，其次為P535引物，而OI和16S這2對(duì)引物的靈敏度較低;對(duì)臍橙中柑橘黃龍病病株組織內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定發(fā)現(xiàn)，柑橘中可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類為7個(gè)屬，分別為短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

關(guān)鍵詞：臍橙;柑橘黃龍病;PCR檢測(cè);內(nèi)生細(xì)菌;湘南

中圖分類號(hào)：S432.42文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1006-060X（2020）07-0001-04

Abstract： In order to ensure the industry security of navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka） in South Hunan and keep strict prevention or control of citrus Huanglongbing （HLB）， the diseased and healthy samples were collected from 4 navel orange ochards of Yizhang County， Chenzhou City， Hunan Province for the PCR detection of citrus HLB pathogen and the isolation of endogenous? bacteria. 4 kinds of PCR primers were used. In the routine PCR detection of citrus HLB， total nucleic acid of citrus HLB pathogen in the navel orange leaves has the highest sensitivity to primer P400 which is the optimal for PCR detection of citrus HLB for southern Hunan navel orange， followed by primer P535， while OI and 16S primers have lower sensitivity. Curtobacterium， Sphingomonas， Deinococcus， Pseudomonas， Methylobacterium， Microbacterium and Bacillus are seven species of culturable endogenous bacteria isolated from diseased samples. Curtobacterium， Sphingomonas and Bacillus are the dominant genera isolated with LB and 1/10LB， while Curtobacterium， Sphingomonas and Microbacterium are the dominant genera isolated with navel orange leaf juice + agar.

Key words： navel orange （Citrus sinensis Osb. var. brasliliensis Tanaka）; citrus Huanglongbing （HLB）; PCR detection; endogenous? bacteria; South Hunan

湘南地處我國(guó)三大柑橘產(chǎn)業(yè)帶（贛南—湘南—桂北），具有獨(dú)特的氣候、資源、區(qū)位、交通和人才優(yōu)勢(shì)。湘南臍橙種植面積已遠(yuǎn)超1.8萬(wàn)hm2（該面積為《宜章縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2002—2010）》和《宜章縣產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃（2012—2017）》中規(guī)劃的臍橙發(fā)展面積），成為了當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)的支柱產(chǎn)業(yè)，特別是郴州的“宜章臍橙”已注冊(cè)成地理商標(biāo)，具有較大的發(fā)展前景[1]。但隨著氣候的變暖，湘南臍橙受到了從華南地區(qū)向北擴(kuò)散的柑橘黃龍病的影響，部分果園頻繁出現(xiàn)果樹(shù)葉片斑駁黃化，甚至果樹(shù)枯死和毀園的現(xiàn)象。因此，加強(qiáng)臍橙的檢疫與防治工作，對(duì)于湘南臍橙產(chǎn)業(yè)乃至湘南和湖南柑橘產(chǎn)業(yè)的發(fā)展有著重大的現(xiàn)實(shí)意義。

自20世紀(jì)初柑橘黃龍病首次在我國(guó)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，先后在廣東、廣西、福建、臺(tái)灣等地區(qū)發(fā)生，且為害較為嚴(yán)重。雖然云南、貴州、浙江、四川、湖南等地也有發(fā)現(xiàn)，但屬零星分布，主要是苗木運(yùn)輸所致，加強(qiáng)苗木監(jiān)控即可有效遏制病情發(fā)生。然而，由于近年來(lái)全球氣溫持續(xù)變暖，柑橘木虱活動(dòng)范圍不斷北擴(kuò)，柑橘黃龍病的發(fā)生有逐漸向北擴(kuò)散的趨勢(shì)，湘南地區(qū)由于臨近廣東、廣西等柑橘黃龍病高發(fā)區(qū)，故首當(dāng)其沖地遭受柑橘黃龍病的為害。Gao等[2]的血清學(xué)試驗(yàn)和Bastianel等[3]基于OMP基因的酶切分型試驗(yàn)都表明柑橘黃龍病病原亞洲種具有較大的分化。董俊[4]的研究表明，華南地區(qū)的柑橘黃龍病病原存在著多種亞種的分化，并且其遺傳分化的規(guī)律主要取決于地域的分布和寄主植物品種的差異。雖然近年來(lái)有一些針對(duì)湖南地區(qū)的柑橘黃龍病的分子檢測(cè)研究[5-6]，但是關(guān)于湘南柑橘，特別是湘南臍橙柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物及病原伴生菌的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此，筆者通過(guò)常規(guī)技術(shù)以多組柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物對(duì)湘南臍橙主產(chǎn)區(qū)——宜章的臍橙黃龍病株進(jìn)行檢測(cè)鑒定，以期篩選出對(duì)湘南臍橙具有高特異性、高靈敏度的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物，并從陽(yáng)性病株中分離出一些柑橘黃龍病病原的伴生菌，為湘南地區(qū)臍橙柑橘黃龍病的診斷及防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 采 樣

臍橙枝葉樣品采自湖南省郴州市宜章縣4個(gè)不同的臍橙種植園（圖 1）。采樣植株為 6～10年生臍橙，主要采集1～3年生葉片，圖1中1～3號(hào)均為柑橘黃龍病株陽(yáng)性樣品且病害程度遞增，4號(hào)樣品為柑橘黃龍病株陰性樣品。所有樣品均由宜章縣農(nóng)業(yè)局植保站提供。采樣時(shí)間為2018年6月上旬，樣品采摘后帶回室內(nèi)4℃保存，3 d內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)和分離培養(yǎng)。

1.2 臍橙柑橘黃龍病的PCR檢測(cè)

參考高玉霞等[7]的方法提取植物葉片總核酸，略作調(diào)整?；静襟E：葉片清洗干凈并涼干后，切取葉片0.5 g，置于干凈的研缽中，用液氮快速研磨成粉末狀;收集到1.5 mL無(wú)菌離心管中，加入500 μL TES緩沖液（0.1 mol/L Tris-HCl，pH值8.0;2 mmol/EDTA，pH值8.0;2% SDS）漩渦混勻;加入500 μL酚∶氯仿∶異戊醇=25∶24∶1的混合液;漩渦5 min混勻;室溫12 000 r/min離心5 min，吸取上清液用1 mL無(wú)水乙醇和100 μL的NaAc混勻，-20℃ 5 min沉淀;室溫12 000 r/min離心3 min去掉上清液，然后用500 μL 75%乙醇清洗2次;室溫12 000 r/min離心3 min，沉淀在常溫下風(fēng)干，加入100 μL無(wú)菌水溶解，即為總核酸樣品，-20℃保存。

PCR引物：根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，選取16S引物對(duì)[7]、P400引物對(duì)[8]、P535引物對(duì)[9]、OI引物對(duì)[10]進(jìn)行臍橙柑橘黃龍病檢測(cè)，引物序列見(jiàn)表1，由湖南擎科生物有限公司合成。

PCR檢測(cè)體系：2×PCR Mix buffer 25 μL，10 μmol/L引物各2 μL，模板1 μL，添加雙蒸H2O至50 μL。所有試劑均為寶生物工程（大連）有限公司TAKARA系列產(chǎn)品。

16S引物PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)30 次→72℃10 min→4℃保存。P400引物PCR擴(kuò)增程序：94℃5 min→94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，循環(huán)30次→72℃ 10 min→4℃保存。P535引物PCR擴(kuò)增程序：94℃ 5 min→94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，循環(huán)32次→72℃ 10 min→4℃保存。OI引物PCR擴(kuò)增程序：94℃?5 min→94℃ 30 s，61℃ 1 min，72℃ 1.5 min，循環(huán)32次→72℃ 10 min→4℃保存。

1.3 臍橙柑橘黃龍病株內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

內(nèi)生菌的分離參考王真真等[11]的方法，進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整。將采摘的1～3號(hào)臍橙樣品的葉片和枝條剪下用清水洗凈泥沙，置于超凈工作臺(tái)中吹干;放入磷酸氫二鈉溶液中超聲1 min進(jìn)一步去除表面雜質(zhì)，從中取出植物組織依次用無(wú)水乙醇、4%次氯酸鈉、硫代硫酸鈉進(jìn)行表面消毒，消毒后用大量無(wú)菌水清洗以去殘留的消毒劑;取最后一步清洗液涂布LB平板檢測(cè)表面消毒是否徹底，將消毒徹底的植物組織置于超凈工作臺(tái)中吹干;然后將樣品研磨成漿液，分別取1、10、100 μL汁液涂布LB、1/10 LB固體培養(yǎng)基和臍橙葉汁培養(yǎng)基平板，每種培養(yǎng)基涂布5個(gè)平板，30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～7 d，挑取單菌落至LB平板劃線，獲得純培養(yǎng)物。

3種培養(yǎng)基制備方法如下。（1）LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉浸膏10 g、氯化鈉3 g、瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.5±0.5。（2）1/10LB液體培養(yǎng)基：用蒸餾水將LB培養(yǎng)基稀釋10倍后，調(diào)節(jié)pH值6.5±0.5。（3）臍橙葉汁培養(yǎng)基：將100 g新鮮健康臍橙葉洗凈、剪碎，加入500 mL超純水后用榨汁機(jī)榨汁，葉汁高速離心后上清經(jīng)過(guò)0.22 μm過(guò)濾器進(jìn)行除菌，將200 mL過(guò)濾葉汁加入等體積滅菌后的2倍水瓊脂培養(yǎng)基中（瓊脂 40 g，蒸餾水1 000 mL，pH值6.5±0.5），混合均勻后傾倒平板。

菌株的鑒定利用 CTAB 法提取菌株純培養(yǎng)的基因組DNA，進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物、反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序參照王芳[12]的方法。擴(kuò)增產(chǎn)物送至湖南擎科生物測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行 Blast 比對(duì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 湘南臍橙采用不同引物進(jìn)行柑橘黃龍病PCR檢測(cè)的結(jié)果

2.1.1 樣品總核酸提取質(zhì)量 如圖2所示，4個(gè)樣品的總核酸提取較為成功，目的條帶亮度較高，符合后續(xù)PCR檢測(cè)要求。

2.1.2 不同引物擴(kuò)增結(jié)果 如圖3所示，2號(hào)樣品和3號(hào)樣品采用P535和P400引物均擴(kuò)增出柑橘黃龍病基因條帶，1號(hào)樣品只有P400引物擴(kuò)增出了條帶，而16S和OI這2對(duì)引物在4個(gè)樣品中均未擴(kuò)增出條帶;從擴(kuò)增出的條帶亮度來(lái)看，P400引物擴(kuò)增出的條帶較為清晰，且目的條帶的亮度與病害發(fā)病程度呈正相關(guān)性。因此，可以認(rèn)為在柑橘黃龍病的常規(guī)PCR檢測(cè)中，湘南臍橙總核酸對(duì)P400引物的靈敏度最高，其次為P535引物，而OI和 16S這2對(duì)引物的靈敏度較低。

2.2 湘南臍橙中柑橘黃龍病株內(nèi)生細(xì)菌的分離結(jié)果

試驗(yàn)結(jié)果顯示，從1～3號(hào)湘南臍橙樣品中分離挑選出180株細(xì)菌，通過(guò)16S rDNA測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這些菌株分別屬于短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobac-terium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB，1/10LB和臍橙葉汁培養(yǎng)基中分別挑取60株，LB培養(yǎng)基中有短桿菌屬15株 、鞘氨醇單胞菌屬13株、芽孢桿菌屬13株為優(yōu)勢(shì)菌屬;1/10 LB培養(yǎng)基中有短桿菌屬12株 、鞘氨醇單胞菌屬10株、芽孢桿菌屬8株為優(yōu)勢(shì)菌屬;而在臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中有短桿菌屬11株、鞘氨醇單胞菌屬8株、微桿菌屬7株為優(yōu)勢(shì)菌屬;分離鑒定部分結(jié)果見(jiàn)表2。

3 結(jié)論與討論

柑橘黃龍病是一類專性寄生在蕓香科植物韌皮部的植物病害，研究表明，柑橘黃龍病病菌會(huì)引起篩孔堵塞，導(dǎo)致植物篩管運(yùn)輸糖類、養(yǎng)分等可溶性有機(jī)物的功能喪失，最終導(dǎo)致植物葉片缺素、黃化、斑駁甚至枯萎死亡[13]。當(dāng)前對(duì)于柑橘黃龍病既無(wú)特效治療藥物也無(wú)抗性品種，這使得該病對(duì)柑橘生產(chǎn)造成毀滅性打擊，號(hào)稱“柑橘癌癥”，一旦發(fā)病就無(wú)可救藥，只能做出“砍一株保一園，砍一園保一片，砍一片保一業(yè)”的下策[14-15]。而目前，湘南地區(qū)的臍橙產(chǎn)業(yè)發(fā)展勢(shì)頭正旺盛，特別是“宜章臍橙”因其獨(dú)特的氣候、土壤等優(yōu)勢(shì)已成功申報(bào)地理證明商標(biāo)。但隨著氣候變暖，柑橘木虱的北擴(kuò)，使得當(dāng)?shù)卦S多果園出現(xiàn)了果樹(shù)葉片黃化，果實(shí)青化、畸形及植株枯死的現(xiàn)象。因此，尋求一組高特異性、高靈敏度、高穩(wěn)定性的柑橘黃龍病PCR檢測(cè)引物，幫助種植戶在生產(chǎn)中及時(shí)、快捷地確診湘南地區(qū)臍橙的柑橘黃龍病病害顯得尤為重要，對(duì)湘南地區(qū)臍橙產(chǎn)業(yè)的發(fā)展也具有重要意義。此外，借助植物內(nèi)生菌在植物體內(nèi)普遍存在這一自然特性以及其與植物親和的天然優(yōu)勢(shì)，利用內(nèi)生菌來(lái)防治植物病害現(xiàn)已成為了一種綠色、高效的植物病害防治措施[16]。因此，研究從湘南地區(qū)幾個(gè)臍橙種植園采集柑橘黃龍病疑似病株樣品和健康植株樣品，利用柑橘黃龍病PCR檢測(cè)常用引物對(duì)樣品進(jìn)行分子檢測(cè)，并從病株組織中分離內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分析鑒定，為湘南地區(qū)臍橙的柑橘黃龍病害檢測(cè)與防控提供一定的參考。

試驗(yàn)結(jié)果表明，P400引物是湘南地區(qū)臍橙中柑橘黃龍病害常規(guī)PCR檢測(cè)的最佳引物;對(duì)臍橙中柑橘黃龍病病株組織內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定發(fā)現(xiàn)，柑橘中內(nèi)生細(xì)菌主要?dú)w類為7個(gè)屬，分別為短桿菌屬（Curtobacterium）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、異常球菌屬（Deinococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、微桿菌屬（Microbacterium）、芽孢桿菌屬（Bacillus）;其中，LB和1/10LB培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和芽孢桿菌屬;而臍橙樹(shù)葉汁培養(yǎng)基中的優(yōu)勢(shì)菌屬為短桿菌屬、鞘氨醇單胞菌屬和微桿菌屬。

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（責(zé)任編輯：成 平）