使用全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的效果評(píng)估

張鵬 魏巍 李玉燕 王懷娜 包丹丹 趙清華 丁愛(ài)君 郭龍宗

摘? 要：利用Freedom EVO 150全自動(dòng)酶免工作站結(jié)合商品化ELISA試劑盒，建立檢測(cè)動(dòng)物血清樣本的自動(dòng)化高通量酶免檢測(cè)方法，評(píng)估其可靠性和穩(wěn)定性，并探討其在獸醫(yī)衛(wèi)生領(lǐng)域的應(yīng)用前景。選取高、中、低抗體滴度的三組血清樣本、商品化的標(biāo)準(zhǔn)品血清及實(shí)驗(yàn)室自制的質(zhì)控品血清，在相同的實(shí)驗(yàn)條件下使用全自動(dòng)酶免工作站和純手工操作同時(shí)進(jìn)行四個(gè)項(xiàng)目的檢測(cè)。通過(guò)兩種檢測(cè)方法結(jié)果對(duì)比，可發(fā)現(xiàn)二者的結(jié)果具有平行性和一致性，且各質(zhì)控品的檢測(cè)結(jié)果都在正常范圍內(nèi)。本文初步建立了四個(gè)項(xiàng)目的自動(dòng)化檢測(cè)方法，并將其應(yīng)用于日常大批量檢測(cè)，從而大大提高工作效率和降低實(shí)驗(yàn)員的勞動(dòng)強(qiáng)度。

關(guān)鍵詞：自動(dòng)化;Freedom EVO;酶免工作站;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：S851.4+1? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B? ? ?文章編號(hào)：1673-1085（2020）7-0010-05

當(dāng)今科技飛速發(fā)展的時(shí)代，自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)正逐步進(jìn)入獸醫(yī)衛(wèi)生領(lǐng)域，建立自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的動(dòng)物疫病檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室體系已是一種趨勢(shì)。全自動(dòng)酶免工作站通常有移液機(jī)械臂、移板機(jī)械臂、孵育模塊、洗板模塊、讀數(shù)模塊、控制電腦和軟件等組成，它可根據(jù)客戶的具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行編程，自動(dòng)化的完成酶免實(shí)驗(yàn)的加樣、孵育、洗板、讀數(shù)等實(shí)驗(yàn)過(guò)程，配合商品化ELISA試劑盒可建立一整套完成的檢測(cè)體系。2019年底，本單位購(gòu)置Freedom EVO 150全自動(dòng)酶免工作站一套，結(jié)合商品化ELISA試劑盒和手工檢測(cè)，對(duì)其可靠性和穩(wěn)定性進(jìn)行了評(píng)估。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 樣本血清? 350份雞血清樣本采集自膠東半島某養(yǎng)殖場(chǎng)，分別對(duì)禽肺病毒（APV）、禽傳染性支氣管炎（IB）、禽敗血支原體（MG）、禽滑液支原體（MS）四個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行手工檢測(cè)，每個(gè)項(xiàng)目選取高、中、低抗體滴度，各29份血清。

1.1.2? 標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品? 血清標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自荷蘭BioChek公司（批號(hào)：FR16）;自制質(zhì)控品選取中等抗體的雞血清混合后離心分裝制成，其抗體的效價(jià)經(jīng)多次檢測(cè)已有參考范圍。

1.1.3? 主要試劑? 禽敗血支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號(hào)：FS7650）;禽滑液支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號(hào)：FS7713）;禽傳染性支氣管炎ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（荷蘭BioChek公司，批號(hào)：FS7510）;禽肺病毒ELISA抗體檢測(cè)試劑盒（美國(guó)IDEXX公司，批號(hào)：S101）。

1.1.4? 主要儀器? Freedom EVO 150全自動(dòng)酶免工作站（瑞士Tecan公司）;Wellwash 洗板機(jī)（美國(guó)ThermoFisher公司）;MK3酶標(biāo)儀（美國(guó)ThermoFisher公司）。

1.1.5? Freedom EVO 150 全自動(dòng)酶免工作站主要參數(shù)和布局圖? 主機(jī)平臺(tái)（含擴(kuò)展臺(tái)）長(zhǎng)195cm，深78cm，高120cm;臺(tái)面具有45個(gè)軌道，最多可平鋪放置28塊標(biāo)準(zhǔn)孔板，具有96通道移液機(jī)械臂和移板機(jī)械臂，雙機(jī)械臂相互獨(dú)立可平行工作;密閉式溫控孵育模塊位于臺(tái)面后方，可放置12塊板，溫控范圍：室溫在5～53℃;儲(chǔ)板架位于臺(tái)面后方，可放置24塊板;洗板模塊位于右側(cè)擴(kuò)展臺(tái)的上方，具有96通道洗板頭;讀數(shù)模塊位于右側(cè)擴(kuò)展臺(tái)的下方，具有12個(gè)測(cè)量通道，波長(zhǎng)范圍為：400～700nm，1nm步進(jìn);裝有控制軟件的控制電腦。臺(tái)面布局見(jiàn)圖1。

1.2? 方法

1.2.1? 試劑和樣本準(zhǔn)備? 實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，所有試劑及被檢血清樣本恢復(fù)至18～26℃，試劑和被檢血清樣本應(yīng)輕輕地旋轉(zhuǎn)或震蕩予以混勻。預(yù)先將自制質(zhì)控品和被檢血清樣本標(biāo)記好孔位置轉(zhuǎn)移到96孔稀釋板中。將濃縮洗板液配置成工作濃度的洗板液。

1.2.2? 待測(cè)樣本的稀釋? 將自制質(zhì)控品和被檢血清樣本進(jìn)行500倍稀釋。向稀釋板中加入190μL和240μL樣本稀釋液，分別取10μL標(biāo)記好孔位置的自制質(zhì)控品和被檢樣本加入到已經(jīng)準(zhǔn)備好的190μL樣本稀釋液中，充分混勻;再取10μL混合后的樣本加入到已經(jīng)準(zhǔn)備好的240μL樣本稀釋液里混勻，完成對(duì)自制質(zhì)控品和被檢樣本的500倍稀釋。稀釋步驟分別用全自動(dòng)酶免工作站完成和實(shí)驗(yàn)員手工操作完成。

1.2.3? 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)? 手工操作參考四個(gè)項(xiàng)目試劑盒中的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。自動(dòng)化操作先由工作站廠家工程師參考相應(yīng)的試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行編程，實(shí)驗(yàn)員按照提示運(yùn)行相應(yīng)的程序直至檢測(cè)完成。

2? 結(jié)果

2.1? 一致性測(cè)試結(jié)果? 測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖2～圖5。

從圖2～圖5可見(jiàn)，自動(dòng)化操作和手工操作的結(jié)果具有平行性和一致性。

2.2? 穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果

2.2.1? 陰陽(yáng)對(duì)照計(jì)算公式：陰性對(duì)照平均值（NC X）=（NC1+NC2）/2;陽(yáng)性對(duì)照平均值（PC X）=（PC1+PC2）/2。

2.2.2? 標(biāo)準(zhǔn)品和自制內(nèi)控品結(jié)果計(jì)算公式：標(biāo)品或內(nèi)控品S/P值=（標(biāo)品或內(nèi)控品OD值-NC X）/（PC X-NC X）;禽肺病毒（APV）Log10滴度=1.09×（Log10 S/P）+3.36;禽傳染性支氣管（IB）Log10滴度=1.0×（Log10 S/P）+3.62;禽敗血支原（MG）Log10滴度=1.1×（Log10 S/P）+3.156;禽滑液支原體（MS）Log10滴度=1.27×（Log10 S/P）+3.156。

2.2.3? 測(cè)試結(jié)果：根據(jù)上述公式可計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)品和自制內(nèi)控品的滴度，其測(cè)試結(jié)果分別見(jiàn)表1～表4。

由表1～表4可發(fā)現(xiàn)，各項(xiàng)目標(biāo)準(zhǔn)品和自制質(zhì)控品的檢測(cè)滴度均在參考范圍內(nèi)。

3? 討論

1971年，瑞典斯德哥爾摩大學(xué)Peter Perlmann和 Eva Engvall、荷蘭歐伽儂公司的Anton Schuurs和Bauke van Weemen以及法國(guó)巴斯德研究所的Stratis Avrameas等人分別獨(dú)立地發(fā)表了辣根過(guò)氧化物酶HRP標(biāo)記的應(yīng)用文章，建立了酶聯(lián)免疫分析方法[1]。20世紀(jì)80年代，基于臨床免疫分析的市場(chǎng)需求以及電機(jī)和微處理器技術(shù)的發(fā)展，第一臺(tái)真正的自動(dòng)化移液工作站得以被開(kāi)發(fā)[2]。20世紀(jì)90年代，作為自動(dòng)化移液工作站開(kāi)發(fā)最早和應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，具有廣闊前景和巨大用戶體量的自動(dòng)化酶免市場(chǎng)不斷刺激多個(gè)廠家投入其中，并不斷開(kāi)發(fā)出一代代的自動(dòng)化酶免分析系統(tǒng)，從最初的單通道、雙通道移液到后來(lái)的8通道和96通道移液。我國(guó)引入自動(dòng)化酶免工作站的歷史可以追溯到上世紀(jì)90年代末期。本世紀(jì)的最初十年，隨著醫(yī)院和血站的酶免檢測(cè)如火如荼的開(kāi)展[3，4]，全自動(dòng)酶免工作站的應(yīng)用也達(dá)到頂峰。近年來(lái)，隨著自動(dòng)化檢測(cè)技術(shù)逐步進(jìn)入獸醫(yī)衛(wèi)生領(lǐng)域，全自動(dòng)酶免工作站也開(kāi)始被廣大動(dòng)物疫病實(shí)驗(yàn)室的工作人員熟知和使用。

本研究選取禽肺病毒（APV）、禽傳染性支氣管炎（IB）、禽敗血支原體（MG）、禽滑液支原體（MS）四個(gè)項(xiàng)目的商品化ELISA檢測(cè)試劑盒對(duì)待檢血清樣本、自制內(nèi)控品、標(biāo)準(zhǔn)品分別使用全自動(dòng)酶免工作站和手工檢測(cè)進(jìn)行平行性測(cè)試和穩(wěn)定性分析，可以得出自動(dòng)化檢測(cè)具有可靠性和穩(wěn)定性的結(jié)論。基于此結(jié)論，本實(shí)驗(yàn)室建立多個(gè)項(xiàng)目的自動(dòng)化檢測(cè)方法，并應(yīng)用于日常大批量檢測(cè)。

全自動(dòng)酶免工作站是由機(jī)械臂、孵育模塊、洗板模塊、讀數(shù)模塊等部分組成的大型綜合設(shè)備，它可以全自動(dòng)完成酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的整個(gè)過(guò)程，包括稀釋、加樣、孵育、洗板、讀數(shù)、結(jié)果判讀等過(guò)程[5]。全自動(dòng)酶免工作站可以根據(jù)用戶的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行配置，從而分別滿足高通量和靈活性的要求，亦可兼顧。全自動(dòng)酶免工作站提高工作效率的核心在于多任務(wù)平行進(jìn)行的工作模式，簡(jiǎn)單地說(shuō)就是利用第一塊板的孵育時(shí)間，進(jìn)行后續(xù)板子的加樣進(jìn)板。由于孵育時(shí)間是有限的，所以加樣速度就決定了后續(xù)的進(jìn)板數(shù)量，也就決定了整個(gè)流程的批處理量。另外，由于每塊板孵育完成后都需要進(jìn)行洗板，洗板也成為重要的限速步驟。基于這兩點(diǎn)，我們選擇配置96通道移液機(jī)械臂進(jìn)行稀釋、加樣和加試劑，配置96通道高速洗板機(jī)進(jìn)行洗板，以適合大批量集中檢測(cè)。孵育作為酶免試驗(yàn)耗時(shí)最多的步驟也是非常重要的，為了避免邊緣效應(yīng)、避光和防蒸發(fā)，建議使用密閉式孵育塔。需要注意的是，使用全自動(dòng)酶免工作站進(jìn)行大批量檢測(cè)時(shí)須注意盡量選用同一批號(hào)的試劑盒。與手工操作相比，自動(dòng)化檢測(cè)對(duì)于試劑的消耗也更多，也需要與操作人員進(jìn)行一定時(shí)間的磨合，才能實(shí)現(xiàn)良好的人機(jī)交互?？傊煌膶?shí)驗(yàn)室需基于自身的應(yīng)用需求選擇更適合自身的自動(dòng)化產(chǎn)品。

全自動(dòng)酶免工作站可全面提升我們實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化水平，使實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和重復(fù)性都得到顯著提高和完善，在降低實(shí)驗(yàn)人員勞動(dòng)強(qiáng)度情況下提高了工作效率，縮短了重復(fù)勞動(dòng)時(shí)間，使科研工作者可以將更多的時(shí)間投入到廣闊的研究領(lǐng)域中。

參考文獻(xiàn)：

[1]? Wide L， Porath J. Radioimmunoassay of proteins with the use of Sephadex-coupled antibodies[J]. Biochem Biophys Acta， 1966，30： 257-60.

[2]? Lequin，R.M.Enzyme Immunoassay （ELISA）/Enzyme-Linked Immunosorbent Assay （ELISA）[J].Clinical Chemistry， 51（12）：2415-8.

[3]? 朱美芹， 王莉莉. Tecan Freedom Evolyzer-2200全自動(dòng)酶免疫分析儀應(yīng)用評(píng)價(jià)[J].實(shí)用醫(yī)技雜志， 2013， 020（010）：1090-1092.

[4]? 戴蕾，畢永春，宋景秋，等.TECAN Freedom EVOlyzer全自動(dòng)酶免分析一體機(jī)的應(yīng)用體會(huì)[J]. 醫(yī)療衛(wèi)生裝備， 2012， 033（008）：135-136.

[5]? 吳再輝.全自動(dòng)免疫工作站的設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)[D].長(zhǎng)春：長(zhǎng)春理工大學(xué)，2018.