同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小麥粉中黃曲霉毒素B1的不確定度評(píng)定

楊 濤，袁 輝

(新疆產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，新疆 烏魯木齊 830011)

黃曲霉毒素是主要由黃曲霉、寄生曲霉產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物[1]，在濕熱地區(qū)食品和飼料中出現(xiàn)黃曲霉毒素的幾率很高。它們存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果中，特別是容易污染花生、玉米、小麥等糧油產(chǎn)品，是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類(lèi)健康危害極為突出的一類(lèi)霉菌毒素。

黃曲霉毒素 B1是黃曲霉毒素的產(chǎn)物中對(duì)人體最具威脅的物質(zhì)，具有致癌、致突變和致畸形作用。目前，檢測(cè)黃曲霉毒素B1的方法主要有薄層色譜法[2]， 高效液相色譜法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[3-4]，以及酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法[5]等。本研究按照2016年12月發(fā)布的GB 5009.22—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測(cè)定》[6]中第一法：同位素稀釋液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對(duì)小麥粉中黃曲霉毒素B1進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù) CNAS—GL 06《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》和 JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[7-8]規(guī)定的方法建立了數(shù)學(xué)模型，分析了液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定小麥粉中黃曲霉毒素B1過(guò)程中所引入的不確定度來(lái)源，并對(duì)各個(gè)不確定來(lái)源進(jìn)行了分析、量化處理，得出小麥粉中黃曲霉毒素B1含量的擴(kuò)展不確定度，對(duì)其最終測(cè)定結(jié)果進(jìn)行不確定度評(píng)估，為小麥粉中黃曲霉毒素B1的測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，含量標(biāo)示為(100.54±0.3)μg/ml，純度為99%，Pribolab公司；同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品，含量標(biāo)示為(0.501 ± 0.008) μg/ml，純度為99.3%，Pribolab公司；甲醇，色譜純，F(xiàn)isher公司；乙酸銨，色譜純，sigma公司；黃曲霉毒素B1免疫親和柱，華安麥科；小麥粉為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000+高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司； 色譜柱：島津C18色譜柱，150 mm×2.1 mm，3 μm；Sartorius BSA22025電子天平，感量0.01 g，德國(guó)Sartorius公司；固相萃取裝置，美國(guó)J2 Scientific公司；5418離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf；超純水機(jī)，美國(guó)millipore公司。

1.3 方法

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

移取黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品1.00 ml于10 ml容量瓶，甲醇定容為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。移取儲(chǔ)備液0.5 ml于50 ml容量瓶，定容為標(biāo)準(zhǔn)工作液。移取13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品2 ml于10 ml容量瓶，作為同位素內(nèi)標(biāo)工作液。準(zhǔn)確移取工作液10、100、300、500、1 000 μl至10 ml容量瓶中，加入200 μl同位素內(nèi)標(biāo)工作液，甲醇定容至刻度，得到內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為2 ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3.2樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取試樣5.00 g于離心管中，加入100 μl內(nèi)標(biāo)，震蕩后靜置30 min。加入(7+3)甲醇水20 ml，超聲提取20 min。6 000 r/min離心10 min，取上清液4 ml，加25 ml水稀釋?zhuān)瑢⒋齼艋鹤⑷朊庖哂H和柱中，調(diào)節(jié)壓力以6 ml/min的流速過(guò)免疫親和柱，直至2～3 ml空氣通過(guò)柱體。準(zhǔn)確加入1 ml色譜甲醇洗脫，流速為1～2 ml/min，收集全部流出液于樣品瓶中，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，供測(cè)試使用。

1.3.3儀器分析條件

流動(dòng)相為5 mmol乙酸銨溶液∶甲醇，流速0.3 ml/min，柱溫40℃，進(jìn)樣量：10 μl。質(zhì)譜條件：電噴霧正離子掃描模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)見(jiàn)表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)條件

1.3.4數(shù)學(xué)模型的建立與不確定度來(lái)源的分析

1.3.4.1不確定度的評(píng)估

不確定度的評(píng)估需要明確測(cè)量值的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而分析其可能的不確定來(lái)源。本實(shí)驗(yàn)中黃曲霉毒素B1的數(shù)學(xué)計(jì)算模型如式(1)所示：

(1)

式中，X為試樣中黃曲霉毒素B1的含量，μg/kg；m為試樣質(zhì)量，g；V1為 樣品提取液總體積，20 ml；V2為免疫親和柱上樣體積，4 ml；V3為樣品定容體積，1 ml；c為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測(cè)得試液中黃曲霉毒素B1的質(zhì)量濃度，ng/ml；f為樣品加標(biāo)回收率，%。

1.3.4.2不確定度分量的主要來(lái)源及其分析

該方法前處理過(guò)程主要為手工操作，受人為因素影響較大。根據(jù)檢測(cè)方法和實(shí)際操作情況，高效液相色譜法測(cè)定黃曲霉毒素B1不確定度主要有以下幾個(gè)來(lái)源：一是標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度，包括標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過(guò)程引入的不確定度，最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線產(chǎn)生的不確定度；二是樣品前處理過(guò)程引入的不確定度，包括樣品稱(chēng)量、提取溶劑的總體積、免疫親和柱上樣體積和最終定容體積以及提取效率和樣品回收率引入的不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度(c)[9-11]

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度主要由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身純度、標(biāo)準(zhǔn)工作液稀釋配制過(guò)程以及標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合等引入。

2.1.1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自身純度引入的不確定度(s)

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)證書(shū)可得知，黃曲霉毒素B1和同位素內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1的含量分別為100.54±0.3 μg/ml和0.501±0.008 μg/ml(k=2)，按照均勻分布計(jì)算，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的相對(duì)不確定度分別為：

urel(s1)=0.03÷(100.54×2)=0.001 49

urel(s2)=0.008÷(0.501×2)=0.007 98

因此，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度為：

2.1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中移液器和玻璃量器引入的不確定度(D)

2.1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中體積引入的不確定度(V)

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制的過(guò)程中使用了一系列的移液器和玻璃量器，依據(jù)JJG 196—2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》和JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[12-13]所明示，對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所使用的移液器和玻璃量器均有相應(yīng)的最大允許誤差，按照矩形分布，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中移液器和玻璃量器引入的相對(duì)不確定度見(jiàn)表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中玻璃量器和移液器引入的不確定度

在標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋配制過(guò)程中，使用10 ml容量瓶7次，100 ml容量瓶1次， 1 000 μl移液器移取1 000 μl體積4次，1 000 μl移液器移取500 μl體積1次，300 μl移液器移取300 μl體積1次，100 μl移液器移取100 μl體積1次，10 μl移液器移取10 μl體積1次，200 μl移液器移取200 μl同位素內(nèi)標(biāo)體積5次。由表2中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中，移液器和玻璃量器引入的相對(duì)不確定度為：

=0.053

2.1.2.2標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中溫度波動(dòng)引入的不確定度(T)

移液器和玻璃量器的鑒定是在20℃下進(jìn)行，配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的溫度要控制在(20±5)℃，因此，可以通過(guò)估算溫度范圍和體積膨脹系數(shù)，計(jì)算由溫度波動(dòng)引入的不確定度。由于玻璃的膨脹系數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于液體的膨脹系數(shù)，所以玻璃的膨脹系數(shù)可忽略不計(jì)。標(biāo)準(zhǔn)溶液是用甲醇稀釋配制的，甲醇在20℃時(shí)的膨脹系數(shù)為1.19 ×10-3ml/℃，溫度變化按照矩形分布，各移液器和玻璃量器因溫度波動(dòng)引入的不確定度見(jiàn)表3。

表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過(guò)程中溫度引入的不確定度

根據(jù)表3中的數(shù)據(jù)，以及移液器和玻璃量器使用次數(shù)，合成標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中，溫度變化引入的相對(duì)不確定度：

=0.015

因此，標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程中移液器和玻璃量器引入的不確定度為：

=0.055

2.1.3最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度(q)

標(biāo)液系列的質(zhì)量濃度為0.1、1、3、5、10 ng/ml，內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度均為2 ng/ml，在液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀上對(duì)五個(gè)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)溶液各測(cè)量3次，共計(jì)15次，得到各質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所對(duì)應(yīng)的峰面積比值。標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)如表4，用最小二乘法擬合各標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度與峰面積比值的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

表4 內(nèi)標(biāo)法測(cè)定黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)

對(duì)被測(cè)樣品溶液中的的黃曲霉毒素B1共測(cè)量2次，即p=2。根據(jù)峰面積，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到樣品中黃曲霉毒素B1平均質(zhì)量濃度為x=4.3 ng/ml。于是由最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線引入的不確定度u(q)為

=0.176 6

其中：

由標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合的相對(duì)不確定度為：

urel(q)=u(q)/x=0.041

因此，樣品在測(cè)定過(guò)程中，由標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度為：

2.2 樣品前處理過(guò)程引入的不確定度[10,14]

2.2.1樣品稱(chēng)量過(guò)程引入的不確定度(m)

天平校準(zhǔn)的允許最大誤差為0.01 g，標(biāo)準(zhǔn)要求稱(chēng)樣質(zhì)量為5.00 g，按矩形分布原則，稱(chēng)樣時(shí)由天平的最大允許誤差導(dǎo)致的樣品質(zhì)量不確定度為

2.2.2添加內(nèi)標(biāo)溶液引入的不確定度(I)

采用100 μl移液器加入內(nèi)標(biāo)13C17-黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μl，由移液器引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

urel(I)=uT6rel=0.011 5

2.2.3樣品提取液總體積(V1)

樣品提取液使用25 ml量筒量取(7+3)甲醇水20 ml，JJG196—2006《常用玻璃量器》[12]規(guī)定：20℃時(shí)25 ml量筒的容量允許誤差為±0.25 ml，按矩形分布，則量筒量取提取液體積引來(lái)的不確定度分量為：

2.2.4免疫親和柱上樣體積(V2)

使用5 ml移液器移取4 ml提取液進(jìn)行免疫親和柱法，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[13]：20℃時(shí)5 ml移液器在5 ml檢定點(diǎn)的最大允許誤差為0.6%，按矩形分布，則免疫親和柱上樣體積引來(lái)的不確定度分量為：

2.2.5樣品定容體積(V3)

樣品最終定容使用1 ml單標(biāo)線移液管移取色譜級(jí)甲醇進(jìn)行定容，按照J(rèn)JG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》[13]：20℃時(shí)1 ml移液器在1 ml檢定點(diǎn)的最大允許誤差為0.1%，按照矩形分布，則樣品定容體積引來(lái)的不確定度分量為：

2.2.6提取效率和過(guò)小柱得到的回收率影響(f)

如1.3.2所述，測(cè)定小麥粉中的黃曲霉毒素B1的前處理需經(jīng)過(guò)對(duì)樣品的稱(chēng)量、提取、上柱凈化、洗脫定容等步驟后經(jīng)儀器分析測(cè)試。在這冗長(zhǎng)的過(guò)程中必然會(huì)造成樣品的測(cè)定值偏離真值。本實(shí)驗(yàn)對(duì)樣品進(jìn)行6次平行測(cè)試，根據(jù)6次結(jié)果進(jìn)行計(jì)算，回收率結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 回收率結(jié)果統(tǒng)計(jì)

根據(jù)表5的數(shù)據(jù)，回收率的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.0%，因此由樣品回收率引入的相對(duì)不確定度為：

urel(f)=0.040

2.3 分析儀器引入的不確定度(E)

本實(shí)驗(yàn)所采用的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀的擴(kuò)展不確定度為5%，k=2(由新疆自治區(qū)計(jì)量測(cè)試研究院出具的校準(zhǔn)證書(shū))，則由液相色譜-串聯(lián)質(zhì)樸儀引入的相對(duì)不確定度為：

urel(E)=0.05÷2=0.025

2.4 測(cè)量不確定度的評(píng)定與報(bào)告

2.4.1合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

各相對(duì)不確定度分量見(jiàn)表6。

表6 各相對(duì)不確定度分量匯總表

由表6可以看出，小麥粉中黃曲霉毒素B1的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量貢獻(xiàn)較大的分別是標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋配制、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及提取效率和過(guò)小柱得到的回收率，而樣品稱(chēng)量、樣品提取液體積等引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度相對(duì)較小。

由表6中的數(shù)據(jù)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

=0.084

2.4.2擴(kuò)展不確定度

依據(jù)JJF1135—2005《化學(xué)分析測(cè)量不確定度評(píng)定》[15]規(guī)定，在95%置信水平下，取包含因子k為2，小麥粉中黃曲霉毒素B1的測(cè)量值為4.3 ng/ml，按照前處理過(guò)程，計(jì)算得到小麥粉中黃曲霉毒素B1的含量為4.30 μg/kg，則擴(kuò)展不確定度

U= 4.30×0.084×2 =0.72 μg/kg

2.4.3測(cè)定結(jié)果

按照該方法測(cè)定小麥粉中黃曲霉毒素B1的結(jié)果為：X=(4.30±0.72)μg/kg，k=2。

3 結(jié)論

在報(bào)告測(cè)量的結(jié)果時(shí)，必須給出相應(yīng)的不確定度，一方面便于使用它的人評(píng)定其可靠性，另一方面也增強(qiáng)了測(cè)量結(jié)果之間的可比性。

本研究根據(jù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程建立數(shù)學(xué)模型，對(duì)小麥粉中黃曲霉毒素B1測(cè)定過(guò)程中的各個(gè)不確定度來(lái)源進(jìn)行了量化分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，影響黃曲霉毒素B1測(cè)定的不確定度的主要因素，主要來(lái)源于標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程，其百分比高達(dá)27.73%；其次是最小二乘法標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及提取效率和過(guò)小柱的回收率引入的不確定度，均在20%以上；而樣品稱(chēng)量以及前處理過(guò)程中定容體積等引入的不確定度相對(duì)而言都比較小。

看似對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響不大的標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過(guò)程，因?yàn)橛袃?nèi)標(biāo)的加入，稀釋的步驟越多，所產(chǎn)生的不確定度越大，從而增大了不確定度因素。因此，在小麥粉中黃曲霉毒素B1測(cè)定過(guò)程中，要著重加強(qiáng)不確定分量中百分比最大的三個(gè)方面的質(zhì)量控制，從而降低測(cè)量不確定度，使測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性得以提高。