鎘脅迫對姬松茸菌絲生理指標與鎘吸收的影響

劉朋虎，陳華，李波，王義祥*，翁伯琦

（1.福建農(nóng)林大學國家菌草工程技術(shù)研究中心，福州350002；2.福建省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，福州350013；3.福建省紅壤山地農(nóng)業(yè)生態(tài)過程重點實驗室，福州350003）

姬松茸（Agaricus brasiliensis）是食用菌生產(chǎn)的主要品種之一，由于其具有豐富的營養(yǎng)與特殊的風味，深受城鄉(xiāng)消費者的喜愛。但是大多數(shù)姬松茸品種對鎘比較敏感，在姬松茸生產(chǎn)栽培過程常有鎘吸收與累積量超標現(xiàn)象。近年來，鎘對食用菌生長的影響及防控技術(shù)研究成為研究熱點，而不同食用菌品種對栽培基質(zhì)中的鎘響應(yīng)各異[1-2]。一方面與品種的內(nèi)在特性有關(guān)，例如紅平菇耐受與富集鎘的能力比較強，其不僅在培養(yǎng)料鎘濃度相對較低（1～20 mg·kg-1）狀態(tài)下對鎘有很強的富集能力，而且可以維持一定的產(chǎn)量；另一方面與不同品種鎘吸收及代謝能力有關(guān)，當栽培原料中鎘含量為20～100 mg·kg-1時，隨著栽培基質(zhì)中鎘含量的增加，紅平菇子實體中鎘富集量雖呈逐步提高的趨勢，但增幅比較小[3-4]。有研究表明，雙孢蘑菇鎘脅迫對菌絲體生長會產(chǎn)生先激發(fā)后抑制現(xiàn)象，其菌絲體中的SOD、POD 和CAT 3 種酶活性呈現(xiàn)了“低促高抑”的變化動態(tài)[5]，通過改變其體內(nèi)重要生物酶活性而影響菌絲體后續(xù)生長。有研究表明，食用菌生長過程對鎘的富集作用有2 個主要途徑，即吸收與吸附[6-7]。紅平菇子實體細胞壁上存在的巰基、羧基、羥基等活性基團，進而可以通過共價、靜電或分子力的吸附作用，將鎘吸附在子實體表面。依靠生物吸附作用累積的鎘比較容易解脫，然而鎘一旦通過吸收而進入子實體細胞質(zhì)中，會有部分鎘離子與氨基酸、金屬硫蛋白等結(jié)合，生成沒有毒害作用的有機基團物質(zhì)，很大程度上降低鎘累積造成的毒害作用，這一過程可以通過抗氧化酶的變化予以判斷[2]。鎘脅迫對紫蘇[8]、小白菜[9]、水稻[10]及花生[11]生長及體內(nèi)的抗氧化酶活性均會產(chǎn)生影響，可以因地制宜采取不同技術(shù)措施來防控鎘毒害，并取得了一定的研究進展。有研究表明，不同食用菌的生理特性會影響其對重金屬的吸收，包括菌株組織結(jié)構(gòu)、生物化學成分、基質(zhì)活性分解、菌絲體的生長等[2]。Malinowska 等[12]研究表明，菌株的生理特性是影響食用菌對鎘富集作用的決定性因素。姬松茸對鎘敏感并容易引發(fā)鎘吸收累積，其機制與吸收過程中菌體抗氧化酶的響應(yīng)內(nèi)在關(guān)系與變化規(guī)律，是構(gòu)建科學診斷方法的重要依據(jù)。故本研究利用項目組通過輻射誘變成功選育的低鎘姬松茸品種J77 及對照品種J1 作為試驗材料，探討不同濃度鎘脅迫對2 個姬松茸品種菌絲SOD、POD、CAT 及APX酶活性、丙二醛含量及鎘吸收累積的影響，闡明其響應(yīng)動態(tài)趨勢與內(nèi)在變化規(guī)律，旨在為姬松茸前期生產(chǎn)栽培過程中防控鎘污染和鎘超標提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試品種與菌種制備

選擇J1 與J77 號作為姬松茸供試菌種[13]，由福建省農(nóng)業(yè)科學院項目組提供。2 個姬松茸品種培養(yǎng)基配方為10 mg 維生素B1、0.5 g 硫酸鎂、2 g 磷酸二氫鉀、20 g 蔗糖、20 g 瓊脂粉、230 g 馬鈴薯、1 000 mL 蒸餾水，pH 自然。28 ℃下試管培養(yǎng)至菌絲長滿整個斜面，用于后期接種。

1.2 試驗設(shè)計

試驗設(shè)0 mg·kg-1（CK）、低中鎘濃度（0.5、1、1.5、2、2.5、5 mg·kg-1）和高鎘濃度（10、15、20、25、50、75 mg·kg-1）；將含鎘母液配制好備用，按試驗設(shè)計將不同濃度鎘溶液加入培養(yǎng)液中，每個處理設(shè)20 個重復，2個菌株共設(shè)2×13×20=520瓶，進行分區(qū)排列。

1.3 菌絲培養(yǎng)

菌絲錐形瓶培養(yǎng)：培養(yǎng)基同試管培養(yǎng)（但不加瓊脂），將液體培養(yǎng)基與鎘母液（1 g·L-1）混合配制成為含不同鎘濃度的培養(yǎng)基，置于錐形瓶中，pH 自然；在250 mL的錐形瓶中分裝50 mL的液體量，用封口膜將瓶口封好，置于常規(guī)高壓鍋中滅菌30 min，然后在超凈臺上按照無菌操作接種，將均勻等分的斜面瓊脂塊接種于錐形瓶中，分區(qū)排列在培養(yǎng)室平臺架子上并調(diào)控室內(nèi)溫度，保持在28 ℃環(huán)境下靜置培養(yǎng)30 d，之后逐一過濾菌絲，分別稱取菌絲鮮質(zhì)量進行記錄與分析，鮮菌絲冷藏備用。

1.4 酶活測定

稱取鮮菌絲0.5 g 并放入5 mL 離心管中，用高通量組織研磨器研磨10 min后將離心管取出，緩慢加入5 mL 磷酸緩沖液（pH 7.0），置于離心機中。在4 ℃、15 000 r·min-1下離心時間15 min，抽取上清液待測備用。粗酶液中的過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）酶活性與丙二醛（MDA）含量測定，參照李波[14]的方法進行。

1.5 菌絲鎘含量測定

鮮菌絲在60 ℃烘干至恒質(zhì)量，然后準確稱取0.2 g 進行微波消解，消解液中鎘含量采用火焰原子吸收儀測定[15]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0 數(shù)據(jù)處理軟件對試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析和相關(guān)性分析，數(shù)據(jù)均為3 個重復的平均值±標準偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 鎘脅迫對姬松茸菌絲生長過程中抗氧化酶活性的影響

2.1.1 不同濃度鎘脅迫對J77與J1菌絲SOD 酶活性的影響

圖1 顯示，在菌絲生長過程中，不同鎘脅迫濃度條件下對SOD 酶活性影響各異。整體而言，J1 菌絲SOD 酶活性比J77 要高。鎘濃度處于中低水平（0～5 mg·L-1）時，J1與J77菌絲的SOD酶活性隨著外界鎘脅迫濃度的增加而提高。與0 mg·L-1處理（對照）相比，當外源添加鎘的濃度達到5 mg·L-1時，J1 與J77 菌絲的SOD 酶活性均出現(xiàn)最大值；J1 菌絲SOD 酶活性增加121.5%；J77 菌絲SOD 酶活性增加157.5%，差異均達顯著水平（P＜0.05）；J77 菌絲SOD 酶活性增加率比J1 高，說明J77 菌絲SOD 酶活性反應(yīng)能力大于J1。當鎘濃度＞5 mg·L-1時，兩個菌株菌絲SOD 酶活性均開始下降。鎘濃度處于中高水平（5～75 mg·L-1）時，J1菌絲SOD 酶活性降低68.5%；J77 菌絲SOD 酶活性降低70.1%，差異達顯著水平（P＜0.05）；兩個菌株差異不大。當鎘濃度達到50、75 mg·L-1時，兩個菌株菌絲SOD 酶活性與對照組相比分別降低了3.5%、12.7%，但兩品種之間的差異不顯著。

圖1 不同鎘脅迫處理對J1和J77菌絲SOD酶活性的影響Figure 1 Effect of different cadmium concentrations on SOD activity of J1 and J77 mycelia

2.1.2 不同濃度鎘脅迫對J77與J1菌絲POD 酶活性的影響

圖2 表明，在低鎘濃度脅迫處理（0～1.5 mg·L-1）下，J1 與J77 菌絲的POD 酶活性基本相近，兩品種之間差異不顯著；在中鎘濃度處理（2.5～15 mg·L-1）下，J1菌絲的POD酶活性比J77高，且兩菌株菌絲POD酶活性隨著外界鎘脅迫濃度的提高而增加。當鎘濃度為5 mg·L-1時，J1 菌絲POD 酶活性達到最大值，與對照的差異達顯著水平（P＜0.05）；當鎘濃度為10 mg·L-1時，J77 菌絲POD 酶活性達到最大值，與對照差異達顯著水平（P＜0.05）。在中高鎘濃度脅迫處理（10～75 mg·L-1）范圍內(nèi)，J1 與J77 菌絲的POD 酶活性都開始降低；J77菌絲POD 酶活性比對照減少了92.7%，差異達顯著水平；J1 菌絲POD 酶活性比對照減少了95.3%，差異達顯著水平。J1 雖然比J77 略高，但兩者差異不顯著。從菌絲生長過程可以觀察到，當外源鎘濃度超過15 mg·L-1時，J1 菌絲受到的鎘毒害程度比J77 菌絲更為嚴重；當外源鎘濃度為50～75 mg·L-1時，J1與J77菌絲的POD酶活性均達到最小值，且J1的數(shù)值更低。

圖2 不同濃度鎘脅迫對J1和J77菌絲POD酶活性的影響Figure 2 Effect of different cadmium concentrations on POD activity of J77 and J1 mycelia

2.1.3 不同濃度鎘脅迫對J77與J1菌絲CAT 酶活性的影響

圖3 顯示，J77 菌絲CAT 酶活性整體比J1 高。在低濃度鎘脅迫處理（0.5～2 mg·L-1）條件下，J1與J77菌絲的CAT 酶活性呈現(xiàn)逐步升高狀態(tài)，兩品種變化相近，差異性不顯著。在中濃度鎘脅迫處理（2.5～10 mg·L-1）條件下，J77菌絲CAT酶活性則隨著外源添加鎘濃度的提高而增加，并達到最大值，之后開始逐步下降；同期J1 菌絲CAT 酶活性在2.0 mg·L-1時開始上升，到5.0 mg·L-1時達到最大值，之后開始下降；與對照處理（0 mg·L-1）相比，在0～10 mg·L-1鎘濃度范圍內(nèi)，J77 菌絲CAT 酶活性增加359.7%，差異性顯著；J1菌絲CAT 酶活性增加343.1%，也呈現(xiàn)顯著差異；但J77增幅與J1增幅相差較小。在10～50 mg·L-1鎘脅迫濃度范圍內(nèi)，J77 菌絲CAT 酶活性減少40.9%，J1 菌絲CAT 酶活性減少60.4%，兩菌株相差19.5%，具有顯著差異性（P＜0.05），說明隨著鎘脅迫濃度提高對J1 菌絲的毒害程度加劇，CAT酶活性降低幅度更大。當鎘濃度為75 mg·L-1時，J77與J1菌絲的CAT酶活性都降到最低。

圖3 不同濃度鎘脅迫對J1和J77菌絲CAT酶活性的影響Figure 3 Effect of different cadmium concentrations on CAT activity of J77 and J1 mycelia

2.1.4 不同濃度鎘脅迫對J77與J1菌絲APX 酶活性的影響

圖4 表明，在低鎘脅迫濃度（0～1.5 mg·L-1）范圍內(nèi)，J1 與J77 菌絲的酶活性均隨著外界鎘脅迫濃度的提高而增加，而且J1 菌絲的APX 酶活性比J77 菌絲高。與0 mg·L-1（對照）處理相比，當鎘脅迫濃度分別為1.5、2 mg·L-1時，J1、J77 菌絲的APX 酶活性分別達到最大值；其中J1、J77 菌絲APX 酶活性分別增加近7.9、13 倍，兩菌株之間呈顯著差異性；之后兩個品種均逐漸降低。在菌絲生長過程中觀察到J77 的菌絲狀況優(yōu)于J1，說明其APX 酶活性反應(yīng)能力大于J1。在2～75 mg·L-1鎘濃度范圍內(nèi)，J1、J77 菌絲的APX 酶活性降幅分別為74.1%、73.1%，兩品種之間差異不顯著（P＜0.05）；當鎘濃度為75 mg·L-1時，J1、J77 菌絲的APX酶活性均達到最低點。

2.2 不同濃度鎘脅迫對J77與J1菌絲丙二醛含量的影響

圖4 不同濃度鎘脅迫對J77和J1菌絲APX酶活性的影響Figure 4 Effect of different cadmium concentrations on APX activity of J77 and J1 mycelia

圖5 不同濃度鎘脅迫對J77和J1菌絲MDA含量的影響Figure 5 Effect of different cadmium concentrations on MDA content of J77 and J1 mycelia

由圖5 可知，在不同濃度鎘脅迫處理條件下（0～75 mg·L-1），J1 菌絲丙二醛（MDA，膜脂過氧化指標，氧化應(yīng)激的標志物）含量整體比J77 菌絲高；而且J1顯示了較大幅度的提升，氧化程度比較劇烈，而J77在整個過程中提升幅度比較緩慢，氧化應(yīng)激程度比較低。在低中濃度鎘脅迫（0～10 mg·L-1）處理范圍內(nèi)，J1與J77 菌絲的MDA 活性則隨著鎘脅迫濃度的提高而增加。J1 菌絲在鎘脅迫濃度達10 mg·L-1時，其MDA含量比對照提高161%，達到最大值且達到差異顯著水平（P＜0.05）；J77 菌絲在鎘脅迫濃度達15 mg·L-1時，MDA 含量達到6.0 nmol·g-1（最大值），且比對照提高62.2%，達顯著性差異水平（P＜0.05）。J1 與J77 之間相差較大，表明J1 菌絲細胞膜過氧化反應(yīng)比J77 更強烈。在中高鎘脅迫濃度（15～50 mg·L-1）條件之下，J1、J77 菌絲的MDA 含量分別減少46.1%、26.4%，兩品種之間差異顯著（P＜0.05）。當鎘濃度為75 mg·L-1時，J1 與J77 菌絲的MDA 含量都降到最低；但外源鎘濃度與2 個菌株菌絲的丙二醛含量之間均無顯著相關(guān)性。

2.3 不同濃度鎘脅迫對姬松茸菌絲鎘含量的影響

不同濃度鎘脅迫處理對J77 和J1 菌絲中鎘含量的影響結(jié)果見圖6。由圖6 可知，在0～75 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，J77 與J1 菌絲中鎘含量的濃度均隨著外界鎘含量的提高而增加。當鎘濃度在0～2.5 mg·L-1范圍內(nèi)，J77 菌絲鎘含量增長近93 倍，而J1 菌絲鎘含量增長近117 倍；兩者差異顯著（P＜0.05）。當鎘濃度達到2.5 mg·L-1時，J1 菌絲鎘含量比J77 菌絲高近2.5 倍。說明在此濃度范圍內(nèi)，J1 菌絲的鎘吸收富集量高于J77 菌絲。當鎘濃度在2.5～50 mg·L-1范圍內(nèi)，J1 菌絲鎘含量增長了17.2倍，J77菌絲鎘含量增長了19.1倍；即J77 菌絲鎘增長率高于J1 菌絲，但J1 菌絲比J77 菌絲鎘含量高近2.3 倍。當鎘濃度在50～75 mg·L-1范圍內(nèi)，J77、J1 菌絲鎘含量的增長率分別為77.8%、8.27%，但J1 依然比J77 菌絲鎘含量高3 895.8 μg·kg-1，這說明即使在高鎘濃度脅迫條件下，J77 不僅耐受程度高于J1，且抵制鎘吸收能力也高于J1。將外源鎘濃度與兩個菌株菌絲鎘含量進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，外源鎘濃度與J77、J1菌絲鎘含量均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.971 和0.972（P＜0.01），且J1菌絲鎘含量與外源鎘濃度之間相關(guān)性高于J77 菌絲。由相關(guān)系數(shù)可知，隨著外源鎘濃度的不斷增加，J77和J1 菌絲鎘含量的增長速率都會顯著增加；但J1 菌絲鎘含量的增長量明顯高于J77 菌絲。兩菌株鎘含量的變化符合回歸方程y=-0.898 8x2+266.12x-200.99（R2=0.973）和y=1.568 6x2+79.907x+271.7（R2=0.954）。

3 討論

圖6 不同濃度鎘脅迫對J77和J1菌絲鎘含量的影響Figure 6 Effect of different cadmium concentrations on cadmium content of J77 and J1 mycelium

已有研究表明，植物細胞中存在著由超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）等組成的抗氧化酶系統(tǒng)，抗氧化酶系統(tǒng)的綜合作用是調(diào)節(jié)并防止細胞受到外界環(huán)境因子的不利脅迫而被氧化[16]。其中超氧化物歧化酶（SOD）可將O2-轉(zhuǎn)化為H2O2，而過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）可以通過相關(guān)生理生化反應(yīng)將H2O2清除[17]。如果POD、CAT、APX 無法及時清理SOD 所產(chǎn)生的H2O2，那么細胞中累積的H2O2將會繼續(xù)與O2-反應(yīng)而產(chǎn)生OH·，進而進一步加劇細胞氧化[18]。本試驗結(jié)果顯示，不同鎘脅迫處理對J77 和J1 菌絲抗氧化系統(tǒng)的影響各異，其總體變化趨勢是：無論是J1 還是J77 姬松茸品種，隨著鎘脅迫濃度的提高，在菌絲生長過程中其SOD、POD、CAT、APX 酶活性及MDA 含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化動態(tài)，與前人進行水稻苗等作物試驗結(jié)果相近，存在“低促高抑”現(xiàn)象[19]。

SOD 是生物機體內(nèi)天然存在的超氧自由基清除因子，SOD產(chǎn)生與主要作用是把有害的超氧自由基轉(zhuǎn)化為過氧化氫[20]。雖然過氧化氫會對機體發(fā)育產(chǎn)生不利的影響，但生物體內(nèi)活性極強的過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）會將其分解為完全無害的水[21]。這3 種酶組成了一個完整的防氧化鏈條。本試驗將J77、J1 菌絲的SOD、POD、CAT、APX 酶活性與外源鎘濃度進行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，J1、J77 菌絲的4 種酶活性中只有SOD 酶活性與外源鎘脅迫濃度之間呈極顯著負相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.526和-0.553（P＜0.01），J1 菌絲的SOD 酶活性與外源鎘脅迫濃度間的相關(guān)性大于J77，但J77 與J1 菌絲SOD 酶活性都受到較為明顯的抑制作用；POD、CAT、APX 酶活性與外源鎘脅迫濃度之間相關(guān)性并不顯著，但J77菌絲POD、CAT、APX 酶活性受到鎘的抑制程度相對小于J1，這與其他作物試驗結(jié)果有相似之處，即防氧化鏈條的各個要素之間是相互制約的。按照SOD 中金屬輔基的不同，大致可將SOD 分為3 大類，分別為Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、Fe-SOD[22]。在鎘脅迫程度逐步加大的條件之下，是否產(chǎn)生鎘替代的現(xiàn)象，或者由于產(chǎn)生鎘毒害而破壞完整的防氧化鏈條，進而在鎘脅迫過程中發(fā)生SOD 的失活，這是食用菌生理生化指標體系構(gòu)建與深入研究需探討的新命題[23]。在食用菌生長的重金屬毒理學研究方面，除了關(guān)注SOD 之外，同時測定CAT、POD、APX 指標變化也是重要環(huán)節(jié)，但作為診斷與判別指標，還需要篩選關(guān)鍵因子，實現(xiàn)測定一個指標即可了解食用菌菌絲或者子實體防氧化鏈條（系統(tǒng)）健康狀況，進而進行必要的修復與防控，這仍需要深入的研究[24]。

生物適應(yīng)逆境脅迫的重要機制之一就是有效清除活性氧，而生物體內(nèi)的SOD、POD、CAT和APX是活性氧自由基清除系統(tǒng)中關(guān)鍵的系列保護酶[25]。生物體內(nèi)鎘過量富集會誘發(fā)活性氧的積累，通常會直接或者間接破壞抗氧化酶和抗氧化劑功能，其抗氧化酶活性的提高有助于生物細胞免受鎘毒害[26]。在本試驗的鎘脅迫條件下，J1、J77 品種特征不同，但兩個品種菌絲的SOD、POD、CAT 和APX 活性變化規(guī)律基本一致，呈先升高后降低趨勢，這或許是姬松茸同其他作物品種一樣，其SOD、POD、CAT和APX活性存在一個鎘脅迫濃度的閾值，對低鎘濃度的應(yīng)激產(chǎn)生的保護作用降低了膜脂過氧化反應(yīng)；但隨著鎘濃度的升高，打破了體內(nèi)活性氧產(chǎn)生和清除的動態(tài)平衡，過量鎘引起的姬松茸菌絲體內(nèi)過氧化物不斷積累，不斷加劇過氧化損傷程度，菌絲活性與生長量逐步減少。J1 和J77的鎘脅迫濃度閾值在SOD 活性方面表現(xiàn)基本一致，但鎘脅迫對J1 POD、CAT 和APX 活性影響的閾值低于J77。整體而言，J1對鎘脅迫的抗性低于J77。在整個鎘脅迫過程中，由于J1 本身的抗鎘脅迫能力較弱，所以為維持正常的生物代謝過程，受鎘脅迫后需維持較高的抗氧化酶活性。此外，對于J77，在鎘的含量2.0 mg·L-1處理下，SOD、CAT、APX等的活性均出現(xiàn)一定程度的拐點，其具體原因仍有待進一步探索。今后還需要深入探索不同鎘脅迫程度對不同品種食用菌菌絲或者子實體吸收累積鎘動力學過程的變化規(guī)律，包括鎘吸收的增長率與累積量之間的內(nèi)在關(guān)系，或者以丙二醛（MDA）作為診斷評估指標，闡明其直接與間接的機制，為有效的鎘污染防控措施提供技術(shù)依據(jù)。

4 結(jié)論

（1）不同濃度鎘脅迫處理對J77 和J1 菌絲抗氧化系統(tǒng)的影響各異。就總體變化規(guī)律而言，隨著鎘脅迫濃度的增加，J1、J77 姬松茸菌株菌絲SOD、POD、CAT、APX 酶活性及MDA 含量均呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢。

（2）就J1 與J77 菌絲SOD 酶活性、POD 酶活性而言，鎘脅迫濃度敏感值為5 mg·L-1；而J1 與J77 菌絲CAT 酶活性耐受范圍相對較寬，在5～50 mg·L-1鎘濃度范圍內(nèi)，依然保持40%、60%的活性。在不同鎘脅迫處理條件下（0～75 mg·L-1），J1 菌絲丙二醛含量均高于J77 菌絲，且J1 顯示了較大幅度的提升，氧化程度比較劇烈；而J77 的提升幅度比較平緩，表明J1 的細胞膜過氧化反應(yīng)比J77菌絲更為嚴重。

（3）在0～50 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，J77 與J1 菌絲中鎘含量的濃度均隨著外源鎘含量的增加而增加，但J1菌絲鎘累積量比J77 高2.3 倍。當鎘濃度大于50 mg·L-1時，J77、J1 菌絲鎘含量的增長率分別為77.8%、8.27%，但J77 鎘含量低于J1，表明J77 具有抵制鎘吸收的潛力。