牛乳鐵蛋白衍生肽FP-PF的安全性及其抑菌機(jī)理

付永巖 李盈盈 姜瞻梅 劉 飛 姜成剛 侯俊財* 田 波 王玉堂

（1 東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 乳品科學(xué)教育部重點試驗室 哈爾濱150030 2 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 哈爾濱150001）

抗生素濫用和產(chǎn)生耐藥性已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的生態(tài)問題，其直接導(dǎo)致抗生素大量殘留，引起一系列健康問題[1]。 另外，“超級細(xì)菌”的出現(xiàn)也表明細(xì)菌的抗藥性越來越強(qiáng)，種類更繁多、功能更強(qiáng)大的新型抗生素相繼涌現(xiàn)[2]。在過去的20年里，我國對抗生素的需求量逐年升高， 被認(rèn)為是全球嚴(yán)重濫用抗生素國家之一[3]。 抗菌肽發(fā)展迅速，先后從多種生物體（主要是昆蟲、細(xì)菌和脊椎動物的有機(jī)體）中發(fā)現(xiàn)并分離，其無毒副作用，殺菌能力強(qiáng)，無藥物殘留并且能抑制細(xì)菌移位，極大地解決了抗生素抗菌譜窄、應(yīng)用范圍窄、藥物殘留多、生產(chǎn)效率低等問題[4]。 由于其在很多領(lǐng)域，如食品防腐劑、醫(yī)藥學(xué)、化妝品、動植物抗病基因工程等都有巨大的利用價值[5]，因此，研究新型抗菌肽已成為基因工程熱門領(lǐng)域之一[6]。

工藝復(fù)雜，產(chǎn)量低，費用高以及結(jié)構(gòu)關(guān)系不好等因素， 限制了天然牛乳鐵蛋白肽的廣泛應(yīng)用[7]。通過分子改造重新優(yōu)化設(shè)計， 可以提高其抗菌活性，降低溶血性及毒性。 在酸性條件下，受到胃蛋白酶作用的牛乳鐵蛋白在N 末端釋放出牛乳鐵蛋白肽（LfcinB），此環(huán)形多肽含有25 個氨基酸殘基 （FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF-NH2）和1 個二硫鍵。 本試驗中選用牛乳鐵蛋白肽的片段LfcinB18-28（KCRRWQWRMKK-NH2）進(jìn)行對稱改造，引入非極性氨基酸：苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）以及堿性氨基酸：精氨酸（R），得到新型抗菌肽FP-PF（FPRRWQWRRPF-NH2）。依據(jù)不同抗菌肽的結(jié)構(gòu)特點，抗菌能力稍有不同。 普遍來說，昆蟲源和蛙源的抗菌肽抗菌活性較強(qiáng)， 例如蜂毒素（melittin）。 蜂毒素含有26 個氨基酸殘基，具有典型的兩親性α-螺旋結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。 低濃度的蜂毒素即可達(dá)到殺菌的效果[8-9]，然而蜂毒素具有的較高溶血性和細(xì)胞毒性等副作用， 降低了其使用價值。 本試驗以抗菌肽FP-PF 為研究對象，蜂毒素為對照肽，對短鏈陽離子FP-PF 的毒性、溶血性和抑菌機(jī)理進(jìn)行研究， 旨在為短鏈陽離子FPPF 成為未來抗生素替代品，降低合成成本方面提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 抗菌肽的分子合成 抗菌肽FP-PF、 母肽LFcinB18-28 和蜂毒素均產(chǎn)自上海吉爾（GL）生化有限公司，用反相高效液相色譜法（RP-HPLC）將其純化。用無菌蒸餾水配制成2.56 mmol/L 的抗菌肽溶液，置-20 ℃保存。

1.1.2 其它材料 無水乙醇， 法國Kermel 公司；噻唑藍(lán)（MTT）、N-苯基-1-萘胺（NPN）、鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷（ONPG）、多粘菌素B 和二甲基亞砜（DMSO），美國Sigma 公司；DMEM 培養(yǎng)基，美國Gibco 公司；HEPES 緩沖液，中國Biosharp 公司；人腎上皮293 細(xì)胞，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所。

1.2 設(shè)備與儀器

VD-1320 型潔凈工作臺， 北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；空氣恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司； 超低溫冰箱， 青島海爾股份有限公司；96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板和1 000 g 離心機(jī)，上海智城分析儀器制造有限公司；721 型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司； 熒光分光光度計 （F-4500）、透射電子顯微鏡（H7650）和掃描電子顯微鏡（S4800），日本Hitachi 公司。

1.3 方法

1.3.1 分子特性的預(yù)測 按照網(wǎng)址：http：//web.expasy.org/compute_pi/提供的軟件預(yù)測抗菌肽FPPF 和蜂毒素的凈電荷數(shù)及理論分子質(zhì)量。 按照網(wǎng)址：http：//rzlab.ucr.edu/scripts/wheel/wheel.cgi 提供的軟件預(yù)測螺旋輪結(jié)構(gòu)。 按照網(wǎng)址：http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/提供的軟件預(yù)測抗菌肽FPPF 和蜂毒素的疏水性和疏水力矩。

1.3.2 溶血活性的測定 參考Zweytick 等[10]方法。 將1 mL 人新鮮血液置于離心機(jī)中離心（1 000×g，10 min），PBS 緩沖液沖洗收集到的紅細(xì)胞，用10 mL PBS 重懸細(xì)胞。 96 孔板中，前10 孔中各添加50 μL 紅細(xì)胞懸液， 再分別加入PBS 稀釋后的10 個濃度梯度（256～0.5 μmol/L）抗菌肽FP-PF。陽性對照： 分別加入50 μL 的0.01%聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和紅細(xì)胞懸液。 陰性對照：分別加入50 μL 的PBS 緩沖液和紅細(xì)胞懸液。37 ℃培養(yǎng)1 h 后，10 min 離心取上清液，檢測OD570nm處吸光值。 溶血率根據(jù)式（1）計算：

式中，A——抗菌肽樣品試驗組吸光值；At——陽性對照組吸光值；A0——陰性對照組吸光值。

1.3.3 細(xì)胞毒性的測定 選用MTT 法[11]，復(fù)蘇人腎上皮293 細(xì)胞， 置37 ℃下5% CO2的培養(yǎng)箱中，用DMEM 傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，制成單細(xì)胞懸液。 按1.3.2 節(jié)的方法稀釋FP-PF， 加入50 μL 制備好的單細(xì)胞懸液。 陽性對照：只添加單細(xì)胞懸液。 陰性對照：既不添加單細(xì)胞懸液，也不添加抗菌肽。 在5% CO2培養(yǎng)箱（37 ℃，24 h）中，分別添加40 μL MTT 溶液培養(yǎng)4 h 后，添加150 μL DMSO 溶液，振蕩10 min，檢測OD492nm值。

1.3.4 抑菌機(jī)理研究

1.3.4.1 細(xì)胞外膜通透性測定 采用Ma 等[12]的研究方法檢測細(xì)胞外膜的通透性， 試驗菌株為大腸桿菌UB 1005。 將生長對數(shù)期的細(xì)菌置于離心機(jī)中，離心（8 000 r/min，10 min）后加入5 mmol/L HEPES 緩沖溶液。取2 μL 1 mmol/L NPN 和2 mL菌懸液混合加入石英比色皿， 再加入抗菌肽。 用F-4500 熒光分光光度計在激發(fā)光波長350 nm 和發(fā)射波長420 nm 處，測定熒光強(qiáng)度的變化。 陽性對照：多粘菌素B。 NPN 根據(jù)公式（2）計算：

式中，F(xiàn)obs——加入抗菌肽穩(wěn)定時的熒光值，單位；F0——未加抗菌肽穩(wěn)定時的熒光值；F100——加入多粘菌素B 的熒光值。

1.3.4.2 細(xì)胞內(nèi)膜通透性的測定 采用Zhou 等[13]的研究方法，試驗菌株為大腸桿菌UB 1005。在含2%乳糖的MHB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株， 當(dāng)細(xì)菌生長到對數(shù)期時放入離心機(jī)中， 離心（8 000 r/min，10 min）后用pH 7.4 的PBS 緩沖液制備懸浮液，最后添加鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷，使其最終的濃度到達(dá)1.5 mmo/L。 取2 mL 菌液混合4 μmol/L 和8 μmol/L（最小抑菌濃度MIC）濃度的抗菌肽放入比色皿中，在波長420 nm 處，每隔2 min 記錄所有0～38 min 的結(jié)果。

1.3.4.3 細(xì)胞膜去極化的測定 選用Yang 等[14]的研究方法，試驗菌株為大腸桿菌UB 1005。細(xì)菌離心10 min， 添加pH 7.4 的5 mmol/L HEPES 緩沖液 （20 mmol/L 葡萄糖和5 mmol/L EDTA）。 添加DiSC3-5 染料，使最終濃度到達(dá)0.4 μmol/L，避光震蕩培養(yǎng)1～1.5 h； 加入終濃度為200 mmol/L 的KCl 儲存液， 避光震蕩培養(yǎng)0.5 h。 在激發(fā)光波長622 nm 和發(fā)射波長670 nm 處用F-4500 熒光分光光度計進(jìn)行檢測。

1.4 電鏡分析

1.4.1 掃描電鏡 參照J(rèn)uba 等[15]的研究方法，大腸桿菌ATCC 25922 作為試驗菌種。

1）菌體準(zhǔn)備 將待測菌種傳代培養(yǎng)至對數(shù)生長期，用PBS 制備菌懸液，調(diào)整濃度為OD600nm=0.2；

2）抗菌肽處理 用上述選菌液將抗菌肽調(diào)至終濃度為最小抑菌濃度（MIC=4 μmol/L），震蕩培養(yǎng)2 h，對照組為未加抗菌肽的菌液；

3）樣本處理 離心，棄上清，收集細(xì)菌沉淀，用PBS 沖洗3 次， 添加1 mL 2.5%的戊二醛，4 ℃冰箱過夜固定；

4）梯度脫水 用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液（50%，70%，80%，90%，95%和100%）梯度脫水，每次15 min， 再用100%叔丁醇-100%乙醇溶液（體積比1 ∶1）處理15 min 并離心，最后用純叔丁醇處理0.5 h；

5）鍍膜 將處理好的樣品放入冷凍干燥機(jī)中，干燥、冷凍之后，鍍上1 層金屬膜；

6）觀察 放在電子顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.4.2 透射電鏡的分析測定 參照Chou 等[16]的研究方法，試驗菌種：參照1.4.1 節(jié)。

1）菌體準(zhǔn)備 參照1.4.1 節(jié)中1）；

2）抗菌肽處理 參照1.4.1 節(jié)中2）；

3）樣本處理 參照1.4.1 節(jié)中3），PBS 沖洗，最后用1%鋨酸固定70 min；

4）梯度脫水 參照1.4.1 節(jié)中4），脫水后再用100%的叔丁醇溶液-100%乙醇溶液（體積比1∶1）處理15 min；

5）浸透 離心后，置于烘箱（37 ℃）中，用包埋液-丙酮（體積比1∶1）浸泡0.5 h，再用包埋液-丙酮（體積比4∶1）過夜浸泡，置于烘箱（45 ℃）中用純包埋液浸泡2 h；

6）包埋聚合 將混合包埋液滴入橡膠包埋板中，用醋酸雙氧鈾（Uranyl acetate）和檸檬酸鉛（Lead citrate）染色；

7）觀察 放在電子顯微鏡下觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽FP-PF、LFcinB18-28 和蜂毒素的分子特性

如表1 所示，抗菌肽FP-PF 和母肽LFcinB18-28的理論分子質(zhì)量與實際分子質(zhì)量比相差不大，即合成肽為目標(biāo)肽。FP-PF 與LFcinB18-28和蜂毒素的凈電荷和疏水力矩相比都有所下降， 疏水性與LFcinB18-28相比有明顯的提高，表明改善了合成肽的兩親性。 抗菌肽的螺旋輪圖見圖1， 方塊數(shù)增加，說明增加了疏水性氨基酸數(shù)量。

圖1 抗菌肽的螺旋輪圖Fig.1 Helical wheel diagrams of antimicrobial peptides

表1 FP-PF、LFcinB18-28 和蜂毒素的分子特性Table 1 The characterization of FP-PF， LFcinB18-28 and melittin

2.2 抗菌肽FP-PF 和蜂毒素的溶血活性

由圖2 可知， 當(dāng)肽濃度在1～256 μmol/L 之間，F(xiàn)P-PF 的溶血率明顯小于蜂毒素，蜂毒素的溶血率在0～110%之間。 當(dāng)肽濃度為1 μmol/L 時，蜂毒素的溶血率為46.80%； 當(dāng)肽濃度為2 μmol/L時，溶血率上升到109.97%，并一直維持在該數(shù)值左右，沒有明顯下降。 相對于蜂毒素，F(xiàn)P-PF 的溶血率一直小于5%，表明FP-PF 的溶血性很低。

2.3 抗菌肽FP-PF 和蜂毒素的細(xì)胞毒性

由圖3 可知， 當(dāng)肽濃度為1～64 μmol/L 時，F(xiàn)P-PF 對人腎上皮293 細(xì)胞的毒性明顯小于蜂毒素，說明FP-PF 對細(xì)胞生長的影響很小，其中64 μmol/L FP-PF 處理的細(xì)胞存活率仍大于92%。當(dāng)肽濃度為8 μmol/L 時， 蜂毒素處理的細(xì)胞存活率為23.40%；當(dāng)肽濃度達(dá)16 μmol/L 時，蜂毒素處理的細(xì)胞存活率為0，表明蜂毒素有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性。

圖2 FP-PF 和蜂毒素的溶血活性Fig.2 The hemolytic activities of FP-PF and melittin

圖3 FP-PF 和蜂毒素的細(xì)胞毒性Fig.3 The cytotoxicity of FP-PF and melittin

2.4 抗菌肽的抑菌機(jī)制

2.4.1 抗菌肽對外膜通透性的影響 圖4 所示FP-PF 和蜂毒素對細(xì)胞外膜的破壞作用。 由圖4可知，F(xiàn)P-PF 和蜂毒素的濃度為1～16 μmol/L，F(xiàn)PPF 和蜂毒素滲透大腸桿菌UB 1005 外膜的能力存在劑量的依賴性。 FP-PF 的NPN 的釋放量從68.87%升到99.66%，隨著肽濃度的增加，釋放量也明顯增加， 說明FP-PF 處理后細(xì)胞外膜通透性增大，破壞程度也增大。

圖4 FP-PF 和蜂毒素對NPN 熒光吸收強(qiáng)度的影響Fig.4 Effect of FP-PF and melittin for uptaking NPN

2.4.2 抗菌肽對內(nèi)膜通透性的影響 通過檢測加入FP-PF 和蜂毒素后細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)β-半乳糖苷酶活性，明確抗菌肽對細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)膜的滲透程度。 圖5 顯示在1/2 倍和1 倍MIC 濃度下抗菌肽FP-PF和蜂毒素對細(xì)胞內(nèi)膜的破壞程度。 隨著肽濃度升高和時間延長，F(xiàn)P-PF 和蜂毒素對內(nèi)膜的破壞程度也加大。 無論是1/2 倍MIC 濃度還是1 倍MIC濃度的抗菌肽與細(xì)菌懸液反應(yīng)后，β-半乳糖苷酶均較快速及較大幅度的釋放。 同一濃度下，隨著時間的增加，β-半乳糖苷酶的釋放量增大，說明FPPF 和蜂毒素誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)膜滲透性具有時間依賴性。FP-PF 在兩種濃度下內(nèi)膜通透性相差很大，30 min 后，1/2 倍MIC 濃度下OD420nm為0.45，1 倍MIC 濃度下為0.72，說明高濃度FP-PF 破壞內(nèi)膜。

2.4.3 抗菌肽對膜的去極化作用 圖6 為不同濃度下FP-PF 和蜂毒素對細(xì)菌細(xì)胞膜去極化的結(jié)果。 當(dāng)細(xì)胞膜被破壞時，表面形成通道，熒光染料DiSC3-5 由通道進(jìn)入介質(zhì)中，使熒光強(qiáng)度增大。 2 μmol/L 和4 μmol/L 肽濃度時，時間對熒光強(qiáng)度的影響：隨著濃度增加和反應(yīng)時間延長，F(xiàn)P-PF 和蜂毒素對細(xì)胞膜表面電勢的影響逐漸增大， 說明FP-PF 和蜂毒素使大腸桿菌的細(xì)胞膜去極化。 在同一濃度下，隨著反應(yīng)時間的延長，熒光強(qiáng)度也增大，說明細(xì)胞膜去極化作用有時間依賴性。在同一反應(yīng)時間，隨著濃度的增加，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，細(xì)胞去極化作用有濃度依賴性。

圖5 不同濃度抗菌肽處理大腸桿菌UB 1005 β-半乳糖苷酶活性的釋放Fig.5 Release of cytoplasmic β-galactosidase activity of E. coli UB 1005 treated with the antimicrobial peptides in different concentrations

圖6 不同濃度抗菌肽對大腸桿菌UB 1005 細(xì)胞膜的去極化作用Fig.6 The cytoplasmic membrane depolarization of E. coli UB 1005 by AMPs in different concentrations

2.5 電鏡分析

2.5.1 掃描電子顯微鏡分析 掃描電子顯微鏡下，可清楚觀察到細(xì)菌細(xì)胞膜表面的形態(tài)變化。圖7 分別為1 倍MIC 濃度下FP-PF 處理后以及未加處理的大腸桿菌掃描電鏡圖。由圖7 可知，空白對照組中的大腸桿菌依然保持原來的形狀， 表面光滑，細(xì)胞飽滿充盈，生長狀態(tài)很好。 加入FP-PF 處理后的細(xì)菌部分被破壞，外形不完整，細(xì)胞破裂，內(nèi)容物流出，細(xì)胞表面有褶皺，不光滑。

2.5.2 透射電子顯微鏡分析 利用透射電子顯微鏡觀察經(jīng)抗菌肽處理的細(xì)菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化。 圖8為1 倍MIC 濃度下FP-PF 處理后和未加處理的大腸桿菌的透射電鏡圖。由圖8 可知，空白對照組的大腸桿菌形狀完整，內(nèi)容物充實，分布均勻，細(xì)胞壁和細(xì)胞膜都很完整， 表面光滑。 加入FP-PF處理后的細(xì)菌形狀被破壞， 不能清晰地看到桿狀或者橢圓狀細(xì)菌，并且細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜分離，有缺口，大量內(nèi)容物流出，分布不均勻，細(xì)胞膜部分破裂，邊緣不清晰。

圖8 FP-PF 處理大腸桿菌ATCC 25922 的透射電鏡顯微圖Fig.8 TEM micrographs of E. coli ATCC 25922 cells treated with FP-FP

3 討論與結(jié)論

研究表明， 決定抗菌肽生物活性的因素包括疏水性強(qiáng)弱、含正電荷數(shù)和疏水力矩[17-18]。 天然的牛乳鐵蛋白肽結(jié)構(gòu)關(guān)系不好，其安全性有待提高。精氨酸（R）、苯丙氨酸（F）和脯氨酸（P）能夠有效地構(gòu)成抗菌肽[19]，其中帶正電荷的精氨酸和脯氨酸，能夠與細(xì)菌中帶負(fù)電的成分相結(jié)合，使之更加貼合在細(xì)胞膜表面[20]。 Haney 等[21]研究表明在抗菌肽中引入帶正電的氨基酸會增強(qiáng)其抑菌能力。 脯氨酸也是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中構(gòu)成氨基酸鄰近效應(yīng)最頻繁的氨基酸。 Lu 等[22]研究證明在抗菌肽中引入含疏水性的氨基酸（P 和F）會降低其細(xì)胞毒性。在批量生產(chǎn)抗菌肽時，安全性是重要的因素。 Soman 等[23]研究表明蜂毒素作為常用的對照肽，其缺點是安全性不好。 與蜂毒素相比， 新型抗菌肽FP-PF的溶血性和細(xì)胞毒性都有較大程度的改善。

抗菌肽大部分為陽性堿性肽， 會與陰離子物質(zhì)相結(jié)合，使膜的滲透壓變大，破壞細(xì)胞膜，使內(nèi)容物外泄，最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡[24]。NPN 是一種細(xì)胞外膜敏感性熒光染料， 常用于細(xì)胞外膜通透性測定試驗。 通過測定NPN 的釋放量，了解細(xì)胞外膜的滲透情況[25]。 FP-PF 肽可破壞細(xì)胞外膜，使?jié)B透性增大，且隨著抗菌肽濃度的增加，NPN 的釋放量也增加，外膜滲透性提高，透化作用增強(qiáng)。 β-半乳糖苷酶存在細(xì)胞內(nèi)，無色的ONPG 是β-半乳糖苷酶的反應(yīng)底物，細(xì)胞膜被破壞后β-半乳糖苷酶釋放到細(xì)胞外， 與細(xì)胞膜外面的底物ONPG 發(fā)生反應(yīng)生成鄰-硝基苯酚（黃色），可通過熒光強(qiáng)度了解細(xì)胞內(nèi)膜的滲透性[26]。 細(xì)胞膜熒光染料DiSC3-5是疏水性的， 當(dāng)細(xì)胞膜電位發(fā)生改變后，DiSC3-5染料進(jìn)入膜雙分子層的疏水環(huán)境中， 使熒光強(qiáng)度增加， 因此常作為細(xì)胞膜去極化試驗中的反應(yīng)試劑。 用抗菌肽FP-PF 處理細(xì)胞后，細(xì)胞膜上產(chǎn)生孔道， 膜電位被干擾， 原本聚集在細(xì)胞膜表面的DiSC3-5 染料被釋放，發(fā)出熒光，熒光強(qiáng)度的大小反映細(xì)胞膜去極化程度[27]。 抗菌肽FP-PF 使細(xì)胞膜去極化， 且具有時間和濃度依賴性。 在抗菌肽FP-PF 處理細(xì)胞50 s 內(nèi)去極化速度呈直線上升趨勢，隨后增加速度越來越緩慢。以上結(jié)果表明抗菌肽FP-PF 是通過破壞細(xì)胞外膜和內(nèi)膜來抑菌。 用掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞表面和內(nèi)部的結(jié)構(gòu)變化， 結(jié)果表明， 抗菌肽處理的細(xì)胞，結(jié)構(gòu)被破壞。細(xì)胞膜不光滑，出現(xiàn)褶皺，形成孔洞，細(xì)胞內(nèi)容物流失。 抑菌機(jī)理試驗表明，F(xiàn)P-PF通過改變細(xì)胞膜的滲透性和完整性抑制細(xì)菌生長。 綜上所述，與蜂毒素相比，新型抗菌肽FP-PF具有毒性小，溶血率低的特點，因此在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域應(yīng)用前景看好。