新型鯰魚體表黏液抗菌肽抑菌活性驗證及抑菌機理

劉權(quán)偉 李婷婷 勵建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心遼寧省食品安全重點實驗室 遼寧省高等學(xué)校生鮮食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院 遼寧錦州121013 2 大連民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 遼寧大連116600）

抗菌肽（Antimicrobial peptides）是先天免疫系統(tǒng)中至關(guān)重要的一部分， 它是生物體為抵抗病原微生物入侵，從而形成具有抗菌作用的短肽[1-2]。瑞典科學(xué)家Steiner 等[3]早在1981年就從羅賓蛾（Hyalophoracecropia）中得到具有殺菌活性的短肽Cecropin。 之后，人們陸續(xù)從各種生物體中分離出具有抑菌效果的短肽[4]。由于抗菌肽引起細胞死亡的機制不是與細胞膜上的特定受體結(jié)合， 而是與膜磷脂的非特異性相互作用[5]，所以抗菌肽產(chǎn)生耐藥性的幾率較小[6-7]。 同時，抗菌肽還具有抗菌譜廣，殺菌活力強等特點，被認為是能夠替代抗生素的首選藥物，具有良好的應(yīng)用前景[8]。 人們通過對已有抗菌肽的探索， 發(fā)現(xiàn)大多數(shù)天然抗菌肽具有兩個相同的特征，首先基本是陽離子類型，其次，它主要是一種對水和脂類都有親和力的兩親結(jié)構(gòu)[9]。 經(jīng)過大量研究，雖然抗菌肽的殺菌機理尚未明確， 但大多數(shù)抗菌肽被認為作用于細菌細胞膜上，發(fā)揮抑菌作用[10]。 另外，抗菌性與抗菌肽肽鏈形成的二級結(jié)構(gòu)以及抗菌肽的生物學(xué)特性等方面也有關(guān)系。 例如含α-螺旋的抗菌肽通常會穿透細菌細胞膜的磷脂雙分子層，導(dǎo)致跨膜電位消散，最終殺死細菌[11]。

鯰魚（Clarias fuscus）屬于魚綱鯰形目鯰科，多數(shù)生活在海水的中、下部，適應(yīng)生存環(huán)境能力較強。 與其它類型的魚相比，當周圍環(huán)境惡劣時，鯰魚的體表黏液和內(nèi)臟會應(yīng)激形成一些抗菌活性物質(zhì)， 尤其是在受傷之后這種活性物質(zhì)的產(chǎn)量顯著增多[12]。 表皮分泌的黏液是魚類天然免疫的重要部分[13-14]，它主要通過表皮杯狀或黏液細胞產(chǎn)生的大分子蛋白發(fā)揮作用[15-16]。 早在1988年，Austin 等[17]初次報道了虹鱒魚表皮黏液對傳染性病原體有顯著的抑制作用， 激發(fā)了研究人員對魚類表皮黏液的研究熱情。 Park 等[18]發(fā)現(xiàn)鯰魚受傷后能夠分泌抗菌肽，Su 等[19]在黃鯰魚體表黏液中也分離到抗菌肽。 本實驗室研究人員前期[20]從鯰魚體表黏液粗提物中共分離獲得4 個抗菌肽氨基酸片段，即：片段1：RLKEKNKA；片段2：RIVELTLPRVSVRL；片段3：KQEIILKF；片段4：RQIKIXRR。 使用這4個氨基酸片段， 通過固相合成法合成相對應(yīng)的抗菌肽凍干粉。 試驗發(fā)現(xiàn)，4 個氨基酸片段中，由片段2 氨基酸序列合成的抗菌肽抑菌效果最為顯著，具有繼續(xù)研究的價值。

本文以此段合成抗菌肽為研究對象， 以腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌為檢測菌株， 驗證了該新型魚源抗菌肽的抗菌活性， 并對其抑菌機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌，渤海大學(xué)食品安全實驗室保存；抗菌肽（RIVELTLPRVSVRL，純度97.775%），合成于上海生物工程公司；營養(yǎng)肉湯、平板計數(shù)培養(yǎng)基、LB 營養(yǎng)瓊脂， 青島海博生物技術(shù)有限公司；GENMED 正苯基萘胺攝入法細菌膜損傷熒光檢測試劑盒， 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司。

1.2 主要儀器、設(shè)備

PE Victor X3 多功能酶標儀， 美國鉑金埃爾默儀器；970CRT 熒光分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司；E-1045 鍍金儀，日本日立公司；S-4800 掃描電鏡，日本日立公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺，蘇景集團蘇州安泰技術(shù)有限公司；Biofuge stratus 臺式高速離心機， 美國Thermo Fisher 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 理化特性預(yù)測 通過抗菌肽數(shù)據(jù)庫APD（http：//aps.unmc.edu/AP/main.php）預(yù)測抗菌肽的理化特性。 進入官網(wǎng)后點擊“CalcuLation & Prediction”， 輸入氨基酸序列進行預(yù)測。 使 用HeliQuest 軟件（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）對抗菌肽序列進行螺旋輪作圖分析。

1.3.2 抗菌肽抗菌活性試驗 采用瓊脂平板擴散法測定其抑菌效果[21]。

1.3.2.1 抑菌活性驗證試驗 采用牛津杯法[22]。將滅過菌的牛津杯置于無菌平板上， 并將15 mL 含測試菌的瓊脂培養(yǎng)基 （培養(yǎng)基中含菌量約為106CFU/mL）倒入每個平板中，待培養(yǎng)基凝固后取出牛津杯， 向每個孔中分別加入體積為100 μL，質(zhì)量分數(shù)為1.0%的抗菌肽溶液。 最后將平板置于37°C 的恒溫培養(yǎng)箱孵育，24 h 后觀察并測量抑菌圈的直徑。 測量3 次，取平均值。

1.3.2.2 抑菌活性穩(wěn)定性 將1.3.2.1 步驟中的平板置于37°C 恒溫培養(yǎng)箱中，觀察7 d 內(nèi)抑菌圈的變化情況。

1.3.2.3 最小抑菌濃度（MIC）測定 采用微量稀釋法測定[23]。 將培養(yǎng)至指數(shù)期的細菌生長液按照50 μL/孔的用量添至96 孔細胞培養(yǎng)板中，并將50 μL 經(jīng)二倍稀釋的抗菌肽添至每個孔，使各孔中抗菌肽的終質(zhì)量分數(shù)分別為0.500%，0.250%，0.125%，0.063%，0.032%，0.016%。 使用50 μg/mL氨芐青霉素作為陽性對照， 將等體積的無菌去離子水作陰性對照。 將培養(yǎng)板置于37 ℃孵育10 h，用酶標儀測定OD595值。 通過比較測量值，選擇與陽性對照沒有明顯差異的最低濃度作為抗菌肽針對細菌的最小抑菌濃度。 獨立測定3 次， 取平均值。

1.3.3 細菌生長曲線 將100 μL 活化的腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌接種于LB 肉湯培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至含量為106CFU/mL。 按照2%的接種量，分別將腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌接種至新的營養(yǎng)肉湯。分別取2 mg 抗菌肽加入適量測定組菌液中 （60 μL的50%二甲基亞砜中助溶），使最終抗菌肽質(zhì)量為0.5%?？瞻捉M加入等量同濃度的二甲基亞砜，搖床培養(yǎng)（37°C，160 r/min），每隔2 h 測定1 次其在波長595 nm 處的吸光值。 橫坐標為培養(yǎng)時間，縱坐標為OD595測量值，繪制細菌生長曲線。

1.3.4 掃描電鏡觀察 取適量腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌過夜培養(yǎng)至對數(shù)期， 加入抗菌肽使其終質(zhì)量分數(shù)為0.5%，于37°C 繼續(xù)培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)完成的細菌懸浮液置于離心管中， 以4 000 r/min 離心10 min。隨后，先將離心的沉淀部分用無菌水洗滌，再將其置于2.5%戊二醛磷酸緩沖液中固定12 h，用無菌水洗滌3 次，每次10 min。 洗滌后，將細菌沉淀懸浮在無菌水中， 取適量滴在干凈的蓋玻片上，冷凍干燥處理12 h。通過電鏡掃描觀察腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的形態(tài)、結(jié)構(gòu)變化。

1.3.5 細菌外膜通透性的測定 根據(jù)GENMED正苯基萘胺攝入法， 研究鯰魚體表黏液抗菌肽對細菌外膜通透性的影響。 參考細菌膜損傷熒光檢測試劑盒說明書，步驟如下：

1）移取1 mL 新鮮菌液（OD600= 0.5）到新的1.5 mL 離心管；

2）放入微型臺式離心機離心，轉(zhuǎn)速13 000 r/min，離心時長1 min，小心抽去上清液；

3）加 入1 mL GENMED 緩沖液（Reagent A），充分混勻；

4）將其置于13 000 r/min 的微型離心機，離心1 min，小心取出上清液；

5）重復(fù)步驟3）～4）1 次；

6）加入1 mL GENMED 緩沖液（Reagent A），充分混勻；

7）抽取150 μL 菌液加入96 孔板中；

8）加入45 μL 0.5%抗菌肽和5 μL GENMED 染色液（Regent B）混勻，放入25 °C 培養(yǎng)箱培養(yǎng)5 min；

9）快速放入熒光分光光度計測定熒光單位（設(shè)置激發(fā)波長355 nm，散發(fā)波長460 nm）；

10）比較不同樣品細菌的膜損傷程度。

采用970CRT 熒光分光光度計測定， 將其參數(shù)設(shè)置為：靈敏度3，掃描速度為高速，EX 縫寬10 nm，EM 縫寬10 nm。

1.3.6 抗菌肽的圓二色譜測定 將抗菌肽溶解于模擬細胞膜疏水環(huán)境的PB 緩沖液和2.5%SDS 緩沖液中， 制成一定濃度的抗菌肽溶液。 于室溫測定，石英樣品池的光程為0.1 cm，帶寬1.0 nm，分辨率0.5 nm， 掃描測定波長范圍190～250 nm，掃描速度50 nm/min。圓二色性通過平均殘基摩爾橢圓率來表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 理化屬性分析

表1 抗菌肽屬性預(yù)測Table 1 Prediction of the properties of antimicrobial peptides

物性預(yù)測顯示： 該抗菌肽氨基酸數(shù)為14，疏水率50%，凈電荷2 z，相對分子質(zhì)量1 651.034，分子式為C74H135N23O19S0， 蛋白結(jié)合勢為1.83 kcal/mol。 如圖預(yù)測顯示該序列多肽可以形成α 螺旋，在同一疏水表面的氨基酸殘基不少于2 個。 綜合理化性質(zhì)預(yù)測表明所合成的多肽具有與細胞膜相互作用的潛力， 且和APD 數(shù)據(jù)庫中的抗菌肽AP00450 相似度高達40%。

根據(jù)ExPASy （The Expert Protein Analysis System）蛋白質(zhì)組學(xué)分析網(wǎng)站提供的在線服務(wù)軟件進行螺旋輪圖分析（http：//heliquest.ipmc.cnrs.fr/）結(jié)果表明該抗菌肽7 個疏水殘基中有4 個在同一表面，親水殘基在相反的位置，預(yù)測該抗菌肽可能形成一種兩親性結(jié)構(gòu)。研究表明，在目前已知的抗菌肽中，它們氨基酸序列的同源性較低。在陽離子型抗菌肽中，它們通常由12 至45 個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量在5 ku 以下， 最少具有兩個凈正電荷，具有陽離子特征和兩親性[24]。 本試驗合成肽鏈物性預(yù)測結(jié)構(gòu)均符合抗菌肽理化特性。

圖1 抗菌肽的螺旋輪分布Fig.1 Helix distribution of antimicrobial peptides

2.2 抗菌肽抑菌活性

2.2.1 抑菌活性驗證 圖2 顯示1.0%的抗菌肽水溶液對腐敗希瓦氏菌及大腸桿菌的抑制效果?？梢钥闯?， 抗菌肽對腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌表現(xiàn)出顯著的抑菌活性， 抑菌圈大小分別為15.15 mm 和16.56 mm。

圖2 抗菌肽對細菌的抑制作用Fig.2 The inhibitory effect of antimicrobial peptides on bacteria

2.2.2 抑菌活性穩(wěn)定性 在上述抗菌活性驗證試驗基礎(chǔ)上，觀察抗菌肽7 d 內(nèi)抑菌圈的變化。 觀測結(jié)果表明抑菌圈的大小沒有明顯變化， 表示抗菌肽的殺菌穩(wěn)定性較好。

2.2.3 最小抑菌濃度 分別將經(jīng)抗菌肽處理的腐敗希瓦氏菌及大腸桿菌菌懸液置于酶標儀上測定其在波長595 nm 處的吸光度值。 結(jié)果腐敗希瓦氏菌、大腸桿菌的最小抑菌質(zhì)量分數(shù)分別為0.063%，0.032%。

2.3 抗菌肽對細菌生長曲線的影響

在不同的生長階段， 微生物中細菌懸浮液的吸光度值在一定波長范圍變化， 并且細菌懸浮液的濃度與吸光度值成正比。 細菌生長可通過細菌懸浮液吸光度曲線的趨勢來判斷[25]。 圖3 顯示抗菌肽對細菌生長曲線的影響。 兩種指示菌經(jīng)抗菌肽處理后生長曲線與正常培養(yǎng)的對照組差異明顯。 對照組10 h 后呈對數(shù)增長，20 h 后達到穩(wěn)定狀態(tài)； 而試驗組經(jīng)抗菌肽處理， 細菌未呈對數(shù)增長，且整體數(shù)量較少，說明抗菌肽對細菌的生長抑制作用顯著。

圖3 抗菌肽對細菌生長曲線的影響Fig.3 Effects of antimicrobial peptides on the growth curves of bacteria

2.4 抗菌肽對細菌形態(tài)的影響

通過觀察圖4 和圖5 可知， 未經(jīng)抗菌肽處理的指示菌形態(tài)飽滿，表面光滑且未變形，菌體無缺損；而經(jīng)0.5%抗菌肽處理12 h 后，菌體發(fā)生扭曲變形，內(nèi)部出現(xiàn)凹陷，且細胞膜表面粗糙、皺縮，并出現(xiàn)孔洞，導(dǎo)致內(nèi)容物大量泄漏，失去規(guī)則的形態(tài)結(jié)構(gòu)。 這說明該抗菌肽可能是通過破壞細菌的細胞膜，導(dǎo)致細菌內(nèi)容物外泄，從而達到殺死細菌的目的。 魏曉曉等[26]用掃描電鏡觀察，修飾后的牛血紅蛋白源抗菌肽JH-3 可引起金黃色葡萄球菌表面皺縮，在大腸桿菌表面形成通道；而謝海偉等[27]發(fā)現(xiàn)合成的鱟素抗菌肽可使大腸桿菌等細菌細胞的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生改變， 細胞表面可觀測到坍塌和破裂現(xiàn)象。

圖4 抗菌肽處理腐敗希瓦氏菌的掃描電鏡圖Fig.4 SEM of S. putrefaciens treated with antimicrobial peptides

圖5 抗菌肽處理大腸桿菌的掃描電鏡圖Fig.5 SEM of E. coli treated with antimicrobial peptides

2.5 抗菌肽對細菌外膜通透率的影響

通?？咕牡囊志^程首先是穿過細胞壁接觸細菌細胞膜， 然后使氨基酸殘基與磷脂雙分子層在靜電作用下發(fā)生結(jié)合， 抗菌肽將疏水端插入細胞膜的疏水區(qū)域來改變膜的結(jié)構(gòu)， 破壞細菌細胞膜的完整性，最終達到抑菌效果[28]。 革蘭氏陰性細菌的外膜可防止一些物質(zhì)損害細胞膜的脂多糖和膜蛋白，對細菌細胞起到保護作用。正苯基萘胺（1-N-phenyl-naphtylamine，NPN）是一種疏水性（hydrophobic）熒光探針，在磷脂環(huán)境下產(chǎn)生強烈藍色熒光。 完整的細菌細胞外膜對正苯基萘胺進行排斥，一旦膜遭到損害，正苯基萘胺便可進入膜磷脂層，從而增強熒光現(xiàn)象，這種熒光現(xiàn)象的強、弱成為常用的評價細胞膜損傷程度的熒光檢測信號[29]。 抗菌肽對兩種指示菌外膜損傷的作用見圖6，與李婷婷等[30]研究結(jié)果類似，添加抗菌肽后，兩組指示菌試驗組熒光值比對照組顯著提高（P＜0.05），說明指示菌外膜受到損傷，表明抗菌肽通過損害細菌細胞外膜使其死亡。

圖6 抗菌肽對細菌外膜通透性的影響Fig.6 Effect of antimicrobial peptides on the permeation of bacteria outer membrane

2.6 圓二色譜檢測

與抗菌肽的氨基酸殘基排列順序相比， 其二級或高級結(jié)構(gòu)在研究它們的生物學(xué)功能方面更加重要。 通過圓二色譜的測定獲得抗菌肽二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋（α-helix）、β-折疊（beta-pleated sheet）、轉(zhuǎn)角（turn）和不規(guī)則卷曲（Random coil）比例。

在該試驗中，使用JASCO 715 圓二色譜儀鑒定在不同緩沖液中抗菌肽的二級結(jié)構(gòu)。 與王超煒等[31]測定結(jié)果相符，圖7a 顯示，在PBS 緩沖液中，抗菌肽在波長200 nm 附近有負的譜帶，表面抗菌肽在緩沖液中為無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)； 圖7b 顯示，當周圍環(huán)境替換為模擬膜環(huán)境時（2.5% SDS 溶液），在波長192 nm 附近，抗菌肽有正的譜帶，而在波長208 nm 和222 nm 附近有兩個負的譜帶， 表面抗菌肽在模擬膜環(huán)境時出現(xiàn)典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。根據(jù)相關(guān)報道，二級結(jié)構(gòu)中具有α-螺旋的抗菌肽多數(shù)以桶形模型對細菌細胞膜進行滲透， 進而殺死細菌[32]。 綜合上述結(jié)果推斷鯰魚體表黏液抗菌肽憑借桶板模型機制到達抑菌作用。

圖7 抗菌肽在不同緩沖溶液中的圓二色譜圖Fig.7 Circular dichroism of antimicrobial peptides in different buffer solutions

3 結(jié)論

體外合成的來源于鯰魚體表黏液的抗菌肽對腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌均有較為明顯的殺菌作用。 該新型抗菌肽對腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的生長均有明顯抑制作用， 且最小抑菌質(zhì)量分數(shù)分別為0.063%和0.032%。 抑菌機理研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對腐敗希瓦氏菌和大腸桿菌的細胞膜、 細胞壁造成明顯的損傷， 嚴重破壞微生物的細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。 此外， 抗菌肽還通過增加細菌細胞外膜通透性， 使體內(nèi)的物質(zhì)發(fā)生泄漏。 該抗菌肽在2.5%SDS 溶液中呈典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)。

4 展望

該新型鯰魚體表黏液抗菌肽雖然對多種細菌有殺傷作用，但是殺菌效率仍有待提高。以該序列為模板，通過在特定位置刪減、增添優(yōu)勢氨基酸或者雜合組成新的抗菌肽， 有望在很大程度上提高抗菌肽的抑菌效率。此外，從自然源分離抗菌肽成本較高， 分離過程復(fù)雜。 而化學(xué)合成肽的價格昂貴、安全性低，這些都限制了抗菌肽的發(fā)展。 依靠基因工程技術(shù)實現(xiàn)抗菌肽的高效生產(chǎn)將成為新的研究熱點。