甘露醇和海藻糖對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響

謝清泉

【摘 要】：目的：探索甘露醇和海藻糖對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響。方法：正常水平Q1由枸櫞酸鈉抗凝管收集正常人志愿獻(xiàn)血后分離得到;異常水平Q2由磷酸鹽緩沖液稀釋Q1得到。分別向Q1和Q2中添加凍干保護(hù)劑甘露醇和海藻糖，配制成凝血質(zhì)控品。隨后考察比較不同組別加速破壞穩(wěn)定性和復(fù)溶穩(wěn)定性。結(jié)果：未添加凍干保護(hù)劑凝血質(zhì)控品，14天加速穩(wěn)定性和72 h復(fù)溶穩(wěn)定性凝血四項(xiàng)各檢測(cè)值降幅超過(guò)15%;添加1.5%甘露醇凝血質(zhì)控品，14天加速穩(wěn)定性和72 h復(fù)溶穩(wěn)定性凝血四項(xiàng)各檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi);添加4%海藻糖凝血質(zhì)控品，72 h復(fù)溶穩(wěn)定性凝血四項(xiàng)各檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，但14天加速穩(wěn)定性不能滿(mǎn)足。結(jié)論：甘露醇和海藻糖都能明顯提高凝血質(zhì)控品的穩(wěn)定性，其中甘露醇效果較優(yōu);兩者組合配制的凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性均優(yōu)于伯樂(lè)血凝質(zhì)控品。

【關(guān)鍵詞】：甘露醇;海藻糖;凝血質(zhì)控品;穩(wěn)定性

【中圖分類(lèi)號(hào)】R43【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A【文章編號(hào)】1672-3783（2020）06-18--01

凝血四項(xiàng)包括凝血酶原時(shí)間 （PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間 （APTT）、凝血酶時(shí)間 （TT）、纖維蛋白原 （FIB），屬于檢驗(yàn)科臨檢檢查項(xiàng)目之一，歸屬于血栓性疾病檢查，為手術(shù)前必查項(xiàng)目、血栓前檢查項(xiàng)目及監(jiān)控臨床口服抗凝藥物患者檢查的項(xiàng)目[1]。這就需要臨床實(shí)驗(yàn)室的檢查結(jié)果準(zhǔn)確可靠，而檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到多種因素的干擾，這就需要臨床實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制，以監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)室的工作質(zhì)量，決定常規(guī)檢驗(yàn)報(bào)告是否能發(fā)出[2]。而開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制就需要質(zhì)控品，一般每個(gè)臨床實(shí)驗(yàn)室每天需要用質(zhì)控品監(jiān)測(cè)兩次，質(zhì)控品使用量較大，同時(shí)現(xiàn)有的凝血質(zhì)控品價(jià)格較高，且復(fù)溶后保存時(shí)間較短，這就給實(shí)驗(yàn)室?guī)?lái)了巨大的成本壓力，如果凝血質(zhì)控品效期較長(zhǎng)及復(fù)溶后能保持較長(zhǎng)時(shí)間，這就會(huì)一定程度上縮減實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)成本，因此討論凍干保護(hù)劑對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響具有比較重要的意義。為此我們研究了糖類(lèi)凍干保護(hù)劑海藻糖和多元醇類(lèi)甘露醇對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響，以期能獲得穩(wěn)定性好的凝血質(zhì)控品。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Sysmex全自動(dòng)血凝分析儀CS-2000i

所用試劑為Siemens凝血酶原時(shí)間測(cè)定試劑盒 （凝固法），批號(hào)：562868;

Siemens活化部分凝血活酶時(shí)間測(cè)定試劑盒 （凝固法），批號(hào)：557279;

Siemens氯化鈣溶液，批號(hào)：563828;

Siemens凝血酶時(shí)間測(cè)定試劑盒 （凝固法），批號(hào)：48158;

Siemens纖維蛋白原測(cè)定試劑盒 （凝固法），批號(hào)：547546;

Siemens Owrens巴比妥緩沖液，批號(hào)：554632;

Sysmex清潔液 I，批號(hào)：A8024;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 1，批號(hào)：78461;

Bio-Rad Lyphochek Coagulation Control， Level 2，批號(hào)：78462;

1.2材料

正常人血漿是由正常人志愿獻(xiàn)血，枸櫞酸鈉采血管收集后分離得到。

1.3方法

1.3.1 凝血質(zhì)控品Q(chēng)1和Q2的配制

Q1是由正常人血漿直接添加凍干保護(hù)劑冷凍干燥后得到;Q2是由正常人血漿用磷酸鹽緩沖液稀釋后，添加凍干保護(hù)劑冷凍干燥后得到。

1.3.2 加速穩(wěn)定性

將凝血質(zhì)控品放到37℃溫箱中放置7 d和14 d后，取新開(kāi)封復(fù)溶質(zhì)控物與穩(wěn)定期末質(zhì)控物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3次，其檢測(cè)結(jié)果的平均值分別記為x0和x，根據(jù)公式1計(jì)算結(jié)果的相對(duì)偏差B，要求偏差小于±15%。

公式1：B=（x-x0）/ X0×100%

1.3.3 復(fù)溶穩(wěn)定性

將質(zhì)控品復(fù)溶后在2 ℃～8 ℃下放置24 h和72 h，取新開(kāi)封復(fù)溶質(zhì)控物與穩(wěn)定期末質(zhì)控物同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)測(cè)定3次，其檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算平均值，根據(jù)公式1計(jì)算結(jié)果的相對(duì)偏差。

2 結(jié)果

2.1不添加凍干保護(hù)劑質(zhì)控品的穩(wěn)定性檢測(cè)

血漿直接配制的Q1和Q2，37℃加速破壞穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1，復(fù)溶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見(jiàn)表2。由表1數(shù)據(jù)可得：37℃ 加速7天Q1的PT，APTT和TT三個(gè)項(xiàng)目的降幅均在45%以上，Q2的PT值已測(cè)不出。而我們自己設(shè)定的穩(wěn)定性降幅標(biāo)準(zhǔn)需在15%以?xún)?nèi)。37℃ 加速14天Q1和Q2穩(wěn)定性也不能滿(mǎn)足要求。由表2數(shù)據(jù)可得：復(fù)溶后24 h Q1和Q2的FIB降幅均已超過(guò)15%。以上都表明不添加任何凍干保護(hù)劑配制的凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性較差，需要添加凍干保護(hù)劑增加穩(wěn)定性。

2.2 甘露醇對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響

為了驗(yàn)證甘露醇對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響，我們分別添加0.5%，1%和1.5%甘露醇配制一批凝血質(zhì)控品，37℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表3，復(fù)溶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。由表3數(shù)據(jù)可得0.5%甘露醇37℃加速7天Q2的FIB降幅為16.61%，已超過(guò)15%;1%甘露醇37℃加速7天Q1和Q2凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，但14天Q1 FIB降幅為15.66%，超過(guò)15%;1.5%甘露醇37℃加速7天14天的Q1和Q2的凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，以上表明隨著甘露醇濃度的提高，凝血質(zhì)控品加速破壞穩(wěn)定性逐漸提高，且均優(yōu)于未添加凍干保護(hù)劑批次。此外由表4數(shù)據(jù)可得：1%和1.5%高濃度甘露醇凝血質(zhì)控品的Q1與Q2的復(fù)溶24 h ， 72 h凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，且隨著甘露醇濃度的提高，穩(wěn)定性也逐漸提高，且相比未添加凍干保護(hù)劑凝血質(zhì)控品復(fù)溶穩(wěn)定性也有明顯改善。這可能是因?yàn)楦事洞甲鳛樘畛鋭?，填充在凝血過(guò)程相關(guān)蛋白和因子之間，從而降低冷凍干燥過(guò)程中產(chǎn)生的凍結(jié)應(yīng)力，低溫應(yīng)力和干燥應(yīng)力對(duì)蛋白等的損傷，最終提高了凝血質(zhì)控品的穩(wěn)定性

2.3 海藻糖對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響

為了驗(yàn)證海藻糖對(duì)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性的影響，分別添加1%，2%和4%海藻糖配制一批凝血質(zhì)控品。37℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表5，由表5數(shù)據(jù)可得，雖然各海藻糖濃度的Q1 Q2的37℃加速7天與14天凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅未都在15%以?xún)?nèi)，但相比未添加凍干保護(hù)劑批次個(gè)別項(xiàng)目檢測(cè)值達(dá)到100%以上，添加海藻糖的凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性已有明顯提高，且隨著海藻糖濃度的提高凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅越來(lái)越低。表明海藻糖在一定程度上能提高凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。復(fù)溶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見(jiàn)表6，由表6數(shù)據(jù)可得只有4%海藻糖濃度的Q1 Q2的復(fù)溶24 h ， 72 h凝血四項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，但三個(gè)濃度凝血四項(xiàng)個(gè)檢測(cè)值降幅整體上明顯低于未添加凍干保護(hù)劑批次。再次表明海藻糖在一定程度上能提高凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)楹Ｔ逄亲鳛閮龈杀Ｗo(hù)劑，在凍干過(guò)程中與凝血相關(guān)蛋白質(zhì)和因子形成氫鍵或者填充在蛋白質(zhì)間，形成空隙支撐蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，從而減少冷凍干燥過(guò)程中產(chǎn)生的低溫應(yīng)力，干燥應(yīng)力和凍結(jié)應(yīng)力對(duì)蛋白質(zhì)造成的損傷，從而提高了凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。

2.4 同時(shí)添加甘露醇和海藻糖對(duì)穩(wěn)定性的影響

同時(shí)1.5%甘露醇和4%海藻糖配制一批凝血質(zhì)控品，37℃加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)見(jiàn)表7，由表7數(shù)據(jù)可得同時(shí)添加海藻糖和甘露醇配制的Q1和Q2，37℃加速7天和14天凝血四項(xiàng)各檢測(cè)值降幅均在10%之間，而伯樂(lè)的加速14天Q1的APTT降幅為15.16%，Q2的PT降幅為21.75%，均已超過(guò)15%。復(fù)溶穩(wěn)定性數(shù)據(jù)見(jiàn)表8，由表8數(shù)據(jù)可得同時(shí)添加海藻糖和甘露醇的Q1與Q2復(fù)溶24 h和96 h，凝血四項(xiàng)各項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在6%之間，而伯樂(lè)的復(fù)溶48 h Q2的FIB降幅已達(dá)到17.79%。以上表明同時(shí)添加1.5%甘露醇和4%海藻糖制備的凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性均優(yōu)于伯樂(lè)。

3 討論

開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制是保證臨床實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)，而開(kāi)展室內(nèi)質(zhì)量控制需要高成本的質(zhì)控品，提高質(zhì)控品的穩(wěn)定性能在一定程度上降低實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)成本。

凍干態(tài)的凝血質(zhì)控品制備過(guò)程中需經(jīng)過(guò)冷凍干燥過(guò)程，而冷凍干燥過(guò)程包括預(yù)凍、升華干燥和解吸干燥3 個(gè)階段。整個(gè)過(guò)程中存在低溫應(yīng)力、凍結(jié)應(yīng)力、干燥應(yīng)力 （蛋白質(zhì)表面水分子的缺失） 等，冰晶形成、離子強(qiáng)度增加、pH 值變化等會(huì)形成凍結(jié)應(yīng)力，這些應(yīng)力可能會(huì)造成蛋白質(zhì)失去天然的構(gòu)象從而失去活性[3-4]。由表1和表2數(shù)據(jù)可得，未添加凍干保護(hù)劑的凝血質(zhì)控品加速破壞穩(wěn)定性不能滿(mǎn)足7天，復(fù)溶穩(wěn)定性不能滿(mǎn)足24 h。這可能就是凍干過(guò)程中各種應(yīng)力對(duì)凝血酶等相關(guān)蛋白質(zhì)造成損傷，從而造成酶失去活性，最終造成穩(wěn)定性差。由表5和表6可得，添加4%海藻糖凝血質(zhì)控品的復(fù)溶穩(wěn)定性能滿(mǎn)足72 h，且加速穩(wěn)定性凝血四項(xiàng)降幅整體明顯低于未添加凍干保護(hù)劑批次，添加海藻糖能明顯提高凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。這可能是因?yàn)楹Ｔ逄堑忍穷?lèi)與凝血相關(guān)蛋白質(zhì)形成氫鍵或者作為填充劑填充在凝血相關(guān)蛋白質(zhì)之間，從而保護(hù)蛋白質(zhì)免于冷凍干燥過(guò)程中產(chǎn)生的各種應(yīng)力的損傷，維持凝血相關(guān)蛋白活性，從而提高凝血質(zhì)控品的穩(wěn)定性。之前就有文獻(xiàn)報(bào)道二糖海藻糖能夠與乳酸脫氫酶形成氫鍵，從而使其穩(wěn)定[5]。純海藻糖在30℃高相對(duì)濕度時(shí)具有優(yōu)異的性能，能使β-半乳糖苷酶具有長(zhǎng)期儲(chǔ)存穩(wěn)定性[6]。此外還有文獻(xiàn)報(bào)道D-海藻糖使堿性磷酸酶穩(wěn)定脫水和加熱的能力明顯優(yōu)于L-海藻糖，但兩種二糖都能為酶提供一定保護(hù)[7]。這些都與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。由表3和表4數(shù)據(jù)可得，添加1.5%甘露醇凝血質(zhì)控品加速破壞穩(wěn)定性能滿(mǎn)足14天凝血四項(xiàng)各檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)，復(fù)溶穩(wěn)定性能滿(mǎn)足72 h，穩(wěn)定性明顯高于未添加凍干保護(hù)劑批次。這可能是因?yàn)楦事洞伎赡芴畛湓谀傅鹊鞍踪|(zhì)之間，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，從而維持蛋白活性，最終提高凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。之前也有文獻(xiàn)報(bào)道甘露醇不僅可作為優(yōu)良的骨架劑使用，而且在還能兼做蛋白質(zhì)的凍干保護(hù)劑[8]。3%甘露醇是重組豬胰蛋白酶理想的凍干保護(hù)劑，對(duì)于酶活性保留率達(dá) 81.3% ～ 101.0%[9]。甘露醇具有低溫保護(hù)、容易成型以及形成的共晶物熔化溫度高等特性，常被用于凍干藥品低溫保護(hù)劑[10]。最終同時(shí)添加4%海藻糖和1.5%甘露醇使凝血質(zhì)控品37℃加速破壞14天凝血四項(xiàng)各項(xiàng)檢測(cè)值降幅在10%以?xún)?nèi)，復(fù)溶96 h穩(wěn)定性各項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在6%以?xún)?nèi)，且優(yōu)于伯樂(lè)凝血質(zhì)控品穩(wěn)定性。目前實(shí)時(shí)穩(wěn)定性9個(gè)月凝血四項(xiàng)各項(xiàng)檢測(cè)值降幅均在15%以?xún)?nèi)。至此，我們確定了一種能應(yīng)用與臨床實(shí)驗(yàn)室的穩(wěn)定性較高的凝血質(zhì)控品配方。這就在一定程度上減少了臨床實(shí)驗(yàn)室所需質(zhì)控品數(shù)量，從而降低了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)成本。

參考文獻(xiàn)

陳曉燕. 臨床血栓與止血檢驗(yàn)分析的質(zhì)量保證探討[J]. 醫(yī)技雜志， 2011， 18 （ 5）： 527.

中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》的通知. 2006.

LIU B， ZHOU X. Freeze-Drying of Proteins/ / WOLKERS W， OLD-ENHOF H. Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols [M]. NewYork Springer New York， 2015： 459-476.

WANG W. Lyophilization and development of solid protein phar-maceuticals [J]. Int J Pharm， 2000， 203（1-2）： 1-60.

MENSINK M A，BOCKSTAL P J V，PIETE R S S，et al.In-line near infrared spectroscopy during freeze-drying as a tool to measure efficiency of hydrogen bond formation between protein and sugar，predictive of protein storage stability[J]. Int J Pharm， 2015， 496 （ 2）： 792-800.

Naomi Teekamp， Yu Tian， J. CarolinaVisser， et al. Addition of Pullulan to Trehalose Glasses Improves the Stability of β-Galactosidase at High Moisture Conditions [J]. ScinceDirect， 2017： 374-380.

HAINES A H. Non-equivalence of D-and L-trehalose instabilising alkaline phosphatase against freeze-drying and thermal stress. Is chiral recognition involved [J]. Org Biomol Chem， 2006， 4 （ 4）： 702-706.

Souillac P O， Costantino H R， Middaugh C R， et al. Investigation of protein/carbohydrate interactions in the dried state [J]. J Pharm Sci， 2002， 91 （1）： 206-216.

周超， 李素霞. 對(duì)重組豬胰蛋白酶凍干制劑穩(wěn)定性研究及細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用 [J]. 食品與藥品， 2012， 14 （7）： 229-232.

Kim AI， Akers MJ， Nail SL. The physical state of mannitol after freeze-drying： effects of mannitol concentration， freezing rate， and a noncrystallizing cosolute [J]. J Pharm Sci， 1998， 87 （8）： 931-935.