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    適應(yīng)性進化提高淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌T17自發(fā)酸脅迫抗性的生理機制

    2020-07-04 10:58:16任喜東王晨瑩劉新利
    食品科學(xué) 2020年12期
    關(guān)鍵詞:胞內(nèi)細胞膜菌體

    任喜東,于 超,王晨瑩,劉新利,*

    (1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,山東 濟南 250353;2.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)山東省微生物工程重點實驗室,山東 濟南 250353;3.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 濟南 250353)

    ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine,ε-PL)是一種由25~35個L-賴氨酸通過ε-氨基和α-羧基之間的酰胺鍵連接而成的同型氨基酸聚合物,具有熱穩(wěn)定性好、水溶性強、安全性高及抑菌譜廣等優(yōu)點,在日本、韓國及美國被廣泛用于食品防腐[1-3]。目前,ε-PL的產(chǎn)生菌主要為鏈霉菌,其最適的生長pH值偏中性[4]。然而,在ε-PL的生物合成過程中產(chǎn)生菌則面臨著自發(fā)酸脅迫(微生物在發(fā)酵過程中自發(fā)形成的酸性物質(zhì)對菌體造成的酸脅迫):隨著發(fā)酵的進行,環(huán)境pH值最終自發(fā)下降到3.0左右;而且,ε-PL合成的最適pH值(pH 4.0)對產(chǎn)生菌而言也是一種酸脅迫環(huán)境[3-5]。酸脅迫會引起胞內(nèi)pH值(pHi)的下降,導(dǎo)致一些對酸敏感的酶失活,造成細胞膜和胞內(nèi)大分子的結(jié)構(gòu)損傷,最終引起細胞死亡[6]。因此,ε-PL產(chǎn)生菌對自發(fā)酸脅迫具有一定的耐受性。

    目前,關(guān)于革蘭氏陽性菌對酸脅迫耐受機制的研究主要集中于乳酸菌和蠟樣芽胞桿菌等,研究表明,胞外堿性物質(zhì)的合成、胞內(nèi)質(zhì)子(H+)的去除、細胞膜組分的改變、休克蛋白和分子伴侶的合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的表達以及代謝途徑的改變等都能夠提高菌株的酸耐受能力[6]。然而,在同為革蘭氏陽性菌的鏈霉菌中相關(guān)研究報道較少。前期分別對Streptomyces albulus M-Z18在pH 5.0、4.0和pH 3.0分批發(fā)酵過程中細胞壁、細胞膜、胞內(nèi)微環(huán)境以及全局基因轉(zhuǎn)錄水平的研究發(fā)現(xiàn),細胞通過協(xié)同方式維持酸性pH值條件下細胞壁和細胞膜的正常功能、pHi值的動態(tài)平衡以及DNA和RNA的穩(wěn)定;更為重要的是,隨著pH值的下降,ε-PL合成酶的轉(zhuǎn)錄水平逐漸升高,pH 3.0時ε-PL合成酶的轉(zhuǎn)錄水平相比pH 5.0時上調(diào)35.75 倍[7]。此外,在ε-PL的發(fā)酵過程中人為引入酸性pH值沖擊(短時pH 3.0脅迫),補料-分批發(fā)酵中ε-PL產(chǎn)量達到54.70 g/L,較對照提高了52.50%[3]。考慮到ε-PL是一種堿性的氨基酸聚合物(等電點為9.0左右),其側(cè)鏈的多NH2結(jié)構(gòu)能夠在酸性條件下結(jié)合胞外游離的H+。由此推測,合成ε-PL也是產(chǎn)生菌應(yīng)對自發(fā)酸脅迫的一種方式[7]。因此,提高ε-PL產(chǎn)生菌的耐酸能力并解析其如何在自發(fā)酸脅迫條件下生存,對于豐富鏈霉菌的酸脅迫耐受機制以及提高ε-PL的產(chǎn)量至關(guān)重要。

    適應(yīng)性進化,是一種研究微生物在特定環(huán)境條件下進化過程的有效方法,通過將微生物置于一定的環(huán)境壓力下,經(jīng)過長期的馴化,獲得具有特定生理功能的突變菌株[8],廣泛應(yīng)用于篩選具有抗脅迫[9]、抗藥性[10]的微生物以及提高代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量[11]等。本研究以1 株ε-PL產(chǎn)生菌淀粉酶產(chǎn)色鏈霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)T17為原始菌株,利用酸性適應(yīng)性進化的方法篩選得到3 株進化菌株,從耐酸能力、細胞膜以及胞內(nèi)微環(huán)境等水平比較原始菌株和進化菌株之間的差異,分析適應(yīng)性進化提高S. diastatochromogenes T17應(yīng)對自發(fā)酸脅迫能力的生理機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    1.1.1 菌株

    利用雙層瓊脂顯色法[12]從土壤中篩選得到1 株野生ε-PL產(chǎn)生菌株S. diastatochromogenes T17,通過酸性適應(yīng)性進化的方法,篩選得到3 株進化菌株S. diastatochromogenes AE44、S. diastatochromogenes AE51和S. diastatochromogenes AE56。均保藏于齊魯工業(yè)大學(xué)生物工程學(xué)院生物制藥工程研究所。

    1.1.2 試劑

    2’,7’-雙-(2-羧乙基)-5-(-6)-羧基熒光素-乙酰氧基甲酯(2’,7’-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein,acetoxymethyl ester,BCECF AM) 碧云天生物技術(shù)研究所;H+-ATPase試劑盒(細菌) 上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司;Super-Bradford蛋白定量試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司。

    1.1.3 培養(yǎng)基

    種子和發(fā)酵培養(yǎng)基(M3G):葡萄糖50 g/L,酵母粉5.0 g/L,(NH4)2SO410 g/L,KH2PO4·2H2O 1.4 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,K2HPO4·2H2O 0.8 g/L,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g/L,ZnSO4·7H2O 0.03 g/L,用1 mol/L NaOH或H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH值至設(shè)定值,115 ℃滅菌15 min。如果配制M3G固體培養(yǎng)基,則添加20 g/L的瓊脂。

    1.2 儀器與設(shè)備

    L-20AT高效液相色譜儀 日本Shimadzu公司;L-8900全自動氨基酸分析儀 日本Hitachi公司;Trace1310 ISQ氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Thermo Fisher公司;JEM-1200EX透射電子顯微鏡 日本電子株式會社;VCX800超聲波破碎儀 美國Sonics公司;Synergy NEO2多功能酶標儀 美國BioTek公司。

    1.3 方法

    1.3.1 種子培養(yǎng)

    取兩環(huán)生長成熟的孢子接種到裝有50 mL M3G培養(yǎng)基(初始pH 6.8)的300 mL錐形瓶中(孢子濃度約為2×105個/mL),在30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h作為種子液。

    1.3.2 酸性適應(yīng)性進化

    以2%的接種量將培養(yǎng)24 h的S. diastatochromogenes T17種子液接種至初始pH 4.0的M3G培養(yǎng)基中,30 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)4 d(發(fā)酵2 d后pH值即降到3.1左右,隨后保持不變),再以2%的接種量轉(zhuǎn)接至新鮮的相同培養(yǎng)基中。如此不斷重復(fù),連續(xù)轉(zhuǎn)接70 d。在進化的不同時期,挑選在pH 4.0的M3G固體平板上生長快速、產(chǎn)孢子能力強的菌株,即為耐酸能力提高的進化菌株。

    1.3.3 酸脅迫生長性能測定

    取培養(yǎng)24 h的原始菌株和進化菌株種子液,經(jīng)梯度稀釋(100、10-1、10-2、10-3)后,點種于不同pH值(5.0、4.5、4.0)的M3G平板上,30 ℃靜置培養(yǎng)4 d,觀測菌落生長情況;取2 mL培養(yǎng)24 h的種子液接種到裝有50 mL M3G培養(yǎng)基(初始pH 4.0)的300 mL錐形瓶中,置于搖床中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)96 h,測定菌體干質(zhì)量。

    1.3.4 自發(fā)酸脅迫實驗

    取2 mL培養(yǎng)24 h的原始菌株和進化菌株種子液接種到裝有50 mL M3G培養(yǎng)基(初始pH 6.8)的300 mL錐形瓶中,置于搖床中30 ℃、200 r/min培養(yǎng)48 h,分別在第0、48小時取樣測定相關(guān)生理參數(shù)。

    1.3.5 pHi值測定

    取不同自發(fā)酸脅迫時間(0 h和48 h)的原始菌株和進化菌株,用50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)離心洗滌菌體3 次后(4 500×g,10 min),冰水浴超聲破碎菌絲體(功率480 W,破碎2 s、停2 s,5 min),離心收集破碎菌絲的懸浮液(600×g,4 min),按照Breeuwer等[14]報道的方法,加入BCECF AM反應(yīng),分別測定菌絲懸浮液的熒光強度Itotal和離心上清液(10 000×g,10 min)的熒光強度Ifiltrate。激發(fā)波長為490 nm和440 nm,發(fā)射波長為525 nm,測定體系為200 μL,縫隙寬度為9 nm。按照下式計算總的熒光強度I。再根據(jù)lgI的值由標準曲線計算pHi值。

    式中:I490nmtotal、I440nmtotal分別為菌絲懸浮液在490、440 nm激發(fā)波長下的熒光強度;I490nmfiltrate、I440nmfiltrate分別為離心上清液在490、440 nm激發(fā)波長下的熒光強度。

    1.3.6 胞內(nèi)ATP測定

    胞內(nèi)ATP測定的方法參照Cichna等[13],并稍作改動。發(fā)酵液4 500×g離心5 min棄去上清液,重懸于0.5 mol/L HClO4溶液(0 ℃)中以阻止菌體代謝。冰水浴超聲破碎菌體(功率480 W,破2 s停2 s,10 min),經(jīng)12 000×g離心20 min,上清液過0.22 μm的濾膜后于高效液相色譜測定。

    色譜條件:Agilent Zorbax SB-AQLAChrom C18-AQ色譜柱(250 mm×4.6 mm);檢測波長254 nm;柱溫25 ℃;流動相5%乙腈、95% Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(pH 7.0,0.2 mol/L)以及四丁基溴化銨(10 mmol/L);流速1.0 mL/min;進樣體積10 μL。

    1.3.7 H+-ATPase活性測定

    根據(jù)H+-ATPase試劑盒提供的方法測定。酶活性單位定義:能夠在1 min內(nèi)將1 μmol的NADH氧化所用的酶量為1 U。

    1.3.8 胞內(nèi)氨基酸含量測定

    取750 μL發(fā)酵液于1.5 mL離心管中,用超純水離心洗滌3 次(8 000×g,60 s),加入750 μL的10 g/100 mL三氯乙酸溶液,37 ℃水浴10 min,然后放入沸水中煮沸30 min,12 000×g離心10 min后上清液于氨基酸分析儀測定。

    1.3.9 細胞膜脂肪酸含量測定

    參照Sasser[15]的方法,發(fā)酵液離心棄去上清液(4 500×g,5 min),下層菌體用生理鹽水(0.9%NaCl)洗滌2 次,順序經(jīng)過皂化、甲基化、提取及堿洗后,取上層有機相利用氣質(zhì)聯(lián)用色譜分析脂肪酸成分。

    氣相色譜條件:TG-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);升溫程序:80 ℃保持1 min,以10 ℃/min的速率升溫至200 ℃,繼續(xù)以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃,最后以2 ℃/min的速率升到270 ℃,保持3 min;進樣口溫度290 ℃;載氣流速1.2 mL/min;不分流進樣,開閥時間1 min。

    質(zhì)譜條件:電子電離源:電子能量70 eV;傳輸線溫度280 ℃;離子源溫度280 ℃;溶劑延遲時間5 min;質(zhì)量掃描范圍m/z 30~400。

    1.3.10 蛋白含量測定

    采用Super-Bradford蛋白定量試劑盒測定。樣品采用生理鹽水(0.9% NaCl)適當稀釋,在595 nm波長處測定吸光度。

    1.3.11 菌體干質(zhì)量測定

    取10 mL發(fā)酵液,4 500×g離心10 min棄去上清液,經(jīng)預(yù)先稱質(zhì)量的濾紙過濾,105 ℃烘干至質(zhì)量恒定后用于測量。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

    數(shù)據(jù)分析采用費舍爾最小顯著差異法,P<0.05,差異顯著。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 適應(yīng)性進化對酸脅迫下菌體生長性能的影響

    圖1 酸脅迫條件下不同菌株的生長情況Fig. 1 Growth performance of strains under acidic stress

    如圖1a所示,4 株菌在pH 5.0、4.5和4.0的M3G固體平板上的菌落生長和孢子成熟情況各不相同。雖然4 株菌在pH 5.0平板上的菌落大小相似,但是3 株進化菌株的菌落顏色呈褐色,而原始菌株的菌落顏色較淺,這說明進化菌株即使在pH 5.0條件下也能正常產(chǎn)孢子,而原始菌株則由于受到酸脅迫影響孢子的生成;進化菌株在pH 4.5平板上的生長情況比原始菌株更好,在稀釋倍數(shù)為10-3時可以明顯觀察到;在pH 4.0的環(huán)境中生長時,由于受到的酸脅迫更加強烈,4 株菌的生長受到明顯的限制,菌體生長緩慢且沒有孢子產(chǎn)生,但仍然可以看出進化菌株的菌落較原始菌株大。如圖1b所示,在pH 4.0的M3G液體培養(yǎng)基中生長96 h后,進化菌株AE44、AE51和AE56的菌體干質(zhì)量分別為(0.33±0.02)、(0.35±0.02)g/L和(0.40±0.01)g/L,較原始菌株T17分別提高了32%、40%和60%。綜上所述,與原始菌株相比,進化菌株在酸脅迫環(huán)境中菌體生長和產(chǎn)孢子速度更快,證明了進化菌株對酸脅迫的耐受能力更強。

    2.2 自發(fā)酸脅迫對原始菌株和進化菌株pHi值的影響

    如圖2所示,在第0小時(環(huán)境pH(pHex)值為6.5),4 株菌的pHi值之間沒有明顯差別,均維持在7.7以上。隨著發(fā)酵過程的進行,環(huán)境pH值自發(fā)下降,第48小時(pHex3.2),4 株菌的pHi值均呈現(xiàn)不同程度的下降:原始菌株下降到5.19±0.15,進化菌株則保持在6.27~6.53之間。由此可見,與原始菌株相比,進化菌株在自發(fā)酸脅迫條件下的pHi值明顯高于原始菌株。pHi值能夠影響細胞中營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、蛋白質(zhì)的合成、糖酵解作用以及核酸的合成。在正常的生長代謝中,微生物的pHi值必須維持動態(tài)平衡,否則當pHi值下降到一定范圍后,會引起蛋白質(zhì)以及DNA的損傷,可能導(dǎo)致細胞死亡[16]。因此,保持pHi值的相對穩(wěn)定對微生物的生長代謝至關(guān)重要。前期研究發(fā)現(xiàn),S. albulus M-Z18在pH 5.0、4.0、3.0分批發(fā)酵27 h,其pHi值都在7.7左右,由于菌株在酸脅迫環(huán)境中所處時間短,pHi值還未開始下降[7]。Wu Chongde等[17]比較了Lactobacillus casei Zhang及其耐酸進化菌株在pH 5.0、3.3的酸脅迫環(huán)境中處理1 h后的pHi值,發(fā)現(xiàn)進化菌株的pHi值比原始菌株高,而且這種差距會隨著脅迫pH值的降低而增大。此外,據(jù)Yamanaka等[18]報道,ε-PL合成酶的最適pH值為8.5,酸性pH值能夠顯著抑制其酶活性;因此,較高的pHi值也有利于胞內(nèi)ε-PL的合成。綜上所述,在自發(fā)酸脅迫條件下,進化菌株能夠維持更高的pHi值,為菌體的正常生長和代謝以ε-PL的合成提供有利的pHi值環(huán)境。

    圖2 不同酸脅迫時間下原始菌株和進化菌株的pHi值Fig. 2 Comparison of pHi values at different acid stress times between the original and evolutionary strains

    2.3 自發(fā)酸脅迫對菌株胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性的影響

    胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性在維持pHi值穩(wěn)定方面發(fā)揮最重要的作用,H+-ATPase主要通過消耗ATP將胞內(nèi)H+排出胞外[6]。如表1所示,在第0小時,原始菌株和進化菌株的胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性沒有明顯區(qū)別;第48小時,與原始菌株相比,進化菌株始終保持較高的胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性:其中,進化菌株AE44、AE51、AE56的胞內(nèi)ATP含量是原始菌株T17的1.7 倍以上,H+-ATPase活性分別比原始菌株提高79.87%、85.53%和100.63%。因此,在自發(fā)酸脅迫條件下,進化菌株始終比原始菌株保持較高的胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性,從而能有效地將胞內(nèi)H+泵出胞外,維持pHi值的穩(wěn)定,提高菌株在酸脅迫環(huán)境下的存活率。此外,Yamanaka等[19]的研究表明,ε-PL合成酶作用的發(fā)揮需要消耗大量的ATP;自發(fā)酸脅迫條件下,進化菌株胞內(nèi)ATP含量更高,這也為ε-PL合成酶提供更多的能量,有利于ε-PL的合成。

    表1 不同酸脅迫時間下原始菌株和進化菌株的胞內(nèi)ATP含量和H+-ATPase活性Table 1 Comparison of ATP concentration and H+-ATPase activity at different acid stress times between the original and the evolutionary strains

    2.4 自發(fā)酸脅迫中原始菌株與進化菌株胞內(nèi)氨基酸含量的差異

    氨基酸代謝在調(diào)控pHi值、代謝產(chǎn)能或還原力以及增強細胞對環(huán)境脅迫的抵抗力等方面發(fā)揮重要的作用[20]。因此,考察自發(fā)酸脅迫條件下(48 h,pHex3.2),原始菌株和進化菌株胞內(nèi)所有氨基酸含量的變化。如圖3所示,在自發(fā)酸脅迫條件下,與原始菌株相比,進化菌株胞內(nèi)天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸以及脯氨酸含量明顯增加,這說明它們可能在S.diastatochromogenesAE44等3 株進化菌株抵抗酸脅迫中發(fā)揮作用。

    圖3 自發(fā)酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株胞內(nèi)氨基酸含量的變化Fig. 3 Comparison of intracellular contents of amino acids between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

    天冬氨酸能夠消耗胞內(nèi)H+轉(zhuǎn)化為丙氨酸,同時,天冬氨酸還可以生成精氨酸,進入精氨酸脫亞胺酶系統(tǒng)產(chǎn)生ATP和NH3[21]。此外,氨基酸脫羧酶系統(tǒng)在微生物抵御外界酸脅迫中發(fā)揮重要作用[22]。在酸脅迫中,胞外的谷氨酸被轉(zhuǎn)運到胞內(nèi),在谷氨酸脫羧酶的作用下被轉(zhuǎn)化成γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)和CO2,同時消耗胞內(nèi)H+;隨后,合成的GABA被釋放到胞外。由于GABA比谷氨酸的酸性弱,因此,這一過程不僅減少了胞內(nèi)H+的濃度,也導(dǎo)致外界環(huán)境的堿化[23]。許多研究表明,賴氨酸也能夠通過賴氨酸脫羧酶的作用消耗胞內(nèi)H+,維持pHi值穩(wěn)定并增強細胞對酸脅迫抗性[24-26]。甘氨酸和脯氨酸也可能通過脫羧酶的作用維持pHi值的穩(wěn)定,作者前期研究也表明胞內(nèi)甘氨酸的積累可能與ε-PL產(chǎn)生菌的耐酸機制有關(guān)[7];脯氨酸則被發(fā)現(xiàn)能夠在脅迫條件下降低植物細胞酸性和維持生物大分子結(jié)構(gòu)穩(wěn)定等[27]。此外,賴氨酸為ε-PL合成的前體,天冬氨酸則是賴氨酸合成的前體,而谷氨酸則為賴氨酸的合成提供氨基[28],所以胞內(nèi)賴氨酸、谷氨酸和天冬氨酸含量的增加也有利于ε-PL的合成。

    2.5 自發(fā)酸脅迫條件下菌株細胞膜脂肪酸含量的差異

    細胞膜可以依靠脂肪酸組分的變化應(yīng)對外界的酸脅迫環(huán)境[29]。細胞膜脂肪酸包括飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸,改變其比例和鏈長能夠直接影響細胞膜的流動性與穩(wěn)定性[30]??疾煸谧园l(fā)酸脅迫條件下(48 h,pHex3.2),原始菌株和進化菌株細胞膜脂肪酸成分的變化,結(jié)果見圖4。S.diastatochromogenesT17的細胞膜脂肪酸主要由飽和脂肪酸肉豆蔻酸(C14:0)、十五烷酸(C15:0)、棕櫚酸(C16:0)和硬脂酸(C18:0)以及不飽和脂肪酸棕櫚油酸(C16:1)和油酸(C18:1)組成。在自發(fā)酸脅迫條件下,與原始菌株相比,進化菌株的細胞膜中飽和脂肪酸(C14:0、C15:0、C16:0和C18:0)相對含量下降;而不飽和脂肪酸(C16:1和C18:1)相對含量增加,其中增加最明顯的為C16:1,進化菌株AE56的C16:1相對含量是原始菌株T17的6.04 倍。因此,進化菌株細胞膜脂肪酸具有更高的不飽和度(圖5),從而增加細胞膜的流動性,更加有利于細胞膜的物質(zhì)運輸以及能量代謝等功能的發(fā)揮,以保證細胞在酸脅迫條件下的生存與功能行使。由圖4可知,C16:0和C16:1在原始菌株和進化菌株的脂肪酸組成中所占比例較大,在自發(fā)酸脅迫條件下,雖然進化菌株中C16:0相對含量明顯減少,C16:1相對含量明顯增加,但是進化菌株的細胞膜脂肪酸的鏈長與原始菌株相比沒有顯著變化(圖5)。

    圖4 自發(fā)酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株細胞膜脂肪酸成分的變化Fig. 4 Comparison of contents of membrane fatty acids between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

    圖5 自發(fā)酸脅迫條件下原始菌株與進化菌株細胞膜脂肪酸不飽和度和平均鏈長的變化Fig. 5 Comparison of ratio of unsaturated/saturated fatty acids and mean chain length between the original and evolutionary strains under spontaneous acidic stress conditions

    3 結(jié) 論

    與原始菌株相比,酸性適應(yīng)性進化得到的進化菌株在自發(fā)酸脅迫條件下能夠在胞內(nèi)保持更高的ATP含量和

    H+-ATPase活性,積累更多的天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、賴氨酸、甘氨酸以及脯氨酸,從而使pHi值維持在較高水平;同時,進化菌株中細胞膜脂肪酸的不飽和度升高,從而增強了細胞膜的流動性。這些變化減輕了自發(fā)酸脅迫對菌體的損傷。此外,進化菌株中較高的pHi值、胞內(nèi)ATP、天冬氨酸、谷氨酸以及賴氨酸濃度也有利于ε-PL的合成。目前,其他研究者只注意到ε-PL的合成需要依賴酸性pH值環(huán)境[4],而忽略了這種酸性環(huán)境對產(chǎn)生菌而言是一種脅迫環(huán)境,本研究有利于充實革蘭氏陽性菌對酸脅迫的響應(yīng)機制,同時也為揭示ε-PL在酸性環(huán)境中合成的生理意義提供參考。

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