大腸桿菌鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域與F4 菌毛主要結(jié)構(gòu)亞單位FaeG 嵌合基因的構(gòu)建及其表達(dá)蛋白的功能研究

吳文文，龐勝美，丁雪燕，劉思國，王曉鈞，段強(qiáng)德*，朱國強(qiáng)*

（1. 揚(yáng)州大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇 揚(yáng)州 225009；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所 獸醫(yī)生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150069）

由FliC 基因編碼的鞭毛素蛋白是大腸桿菌鞭毛的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由高度保守的氨基端（N-terminal domain）、羧基端（C-terminal domain）和中間的可變區(qū)（Hypervariable region）3 個(gè)結(jié)構(gòu)域組成。鞭毛蛋白的N 端和C 端通過α螺旋結(jié)構(gòu)組成D0 和D1 區(qū)的高度保守區(qū)域，與鞭毛蛋白介導(dǎo)的促炎性信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)。鞭毛蛋白的可變區(qū)形成β折疊結(jié)構(gòu)，組成了位于鞭毛絲外表面的D2 和D3 結(jié)構(gòu)域，與鞭毛蛋白抗原多樣性相關(guān)[1-2]。鞭毛除了作為細(xì)菌的運(yùn)動(dòng)器官和一些病原菌的重要毒力因子外，鞭毛蛋白還具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性。鞭毛蛋白是一種重要的病原體相關(guān)分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），能激活細(xì)胞表面的TLR5 或者胞內(nèi)的NLRC4（NLR family CARD domain-containing protein 4）和NAIP5（NLR family，neuronal apoptosis inhibitory protein 5）信號(hào)通道，誘導(dǎo)機(jī)體促炎性因子的產(chǎn)生，激發(fā)機(jī)體的先天性免疫反應(yīng)，從而發(fā)揮其免疫佐劑活性的作用[3-6]。與傳統(tǒng)的鋁膠佐劑相比，鞭毛蛋白能同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和細(xì)胞免疫，并且副作用少。

近年來，鞭毛蛋白的免疫佐劑活性越來越受到國內(nèi)、外學(xué)者的關(guān)注，具有潛在的應(yīng)用前景。研究認(rèn)為鞭毛免疫佐劑活性的發(fā)揮主要是通過其N 端的保守區(qū)與TLR5 的結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的[7]，但是最新的研究發(fā)現(xiàn)將重組的HIV-1 p24 重組蛋白作為模型抗原，與沙門氏菌鞭毛蛋白FliC、FliC-L3A（缺乏NLRC4 活性）、FliCΔ90-97（缺乏TLR5 活性）和FliCΔ90-97:L3A（既無TLR5 活性，也無NLRC4 活性）混合免疫小鼠，研究結(jié)果表明無NLRC4 活性的FliC-L3A 反而具有更強(qiáng)的免疫佐劑活性，能誘導(dǎo)更高滴度的p24 特異性抗體[8]。因此，鞭毛蛋白最佳免疫活性的發(fā)揮是否需要鞭毛素整個(gè)完整的結(jié)構(gòu)域，以及不同結(jié)構(gòu)域在其中發(fā)揮多大的作用仍存在爭議。為了更好的認(rèn)識(shí)和充分發(fā)揮鞭毛素的免疫佐劑活性，本研究以產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）F4菌毛主要結(jié)構(gòu)亞基FaeG為模型抗原，分別構(gòu)建了鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域與其串聯(lián)表達(dá)的FliC-FaeG、FliCN-FaeG、FliCNV-FaeG 嵌合基因，并對(duì)其進(jìn)行原核表達(dá)、純化和鑒定，為下一步闡明深入鞭毛蛋白的免疫佐劑活性機(jī)制提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、菌株、細(xì)胞株與載體F4ac+ETEC 國內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)株（O8∶K87∶H19）、出血性大腸桿菌EDL933（O157∶H7）、大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）、原核表達(dá)載體pET-28a（+）和人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞Caco-2均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑T4 DNA 連接酶和Phusion High-Fidelity DNA 聚合酶購自Thermo Scientific 公司；限制性內(nèi)切酶BamHI 和SalI-HF（High fidelity enzyme）均購自NEB 公司；Protino?Ni-TED 2000 Packed Columns 純化試劑盒購自Macherey-Nagel 公司；抗FaeG 蛋白單克隆抗體（MAb）由本實(shí)驗(yàn)室制備；抗大腸桿菌FliCH7的多抗血清購自天津生物芯片技術(shù)有限公司；山羊抗兔IgG-HRP 和山羊抗鼠IgG-HRP 購自Sigma 公司；引物由南京擎科生物科技公司合成；IL-8 和TNF-α ELISA試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司。

1.3FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG嵌合基因的構(gòu)建根據(jù)GenBank 中已登錄的大腸桿菌O157∶H7 中FliC 基因（AY249992）及F4ac+ETEC 參考菌株的FaeG 基因序列（AJ616236.1），分別設(shè)計(jì)引物P1～P8（表1）。采用煮沸裂解法制備大腸桿菌O157∶H7和F4ac+ETEC DNA 模板，利用含有FaeG 同源臂的P1/P3 引物擴(kuò)增FliC 基因片段、含有FaeG 同源臂的P1/P5 引物擴(kuò)增FliCN 基因片段，含有FaeG 同源臂的P1/P7 引物擴(kuò)增FliCNV 基因片段，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃3 min，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃終止。其中利用含有和FliC、FliCN、FliCNV 基因同源臂的P2、P4、P6 引物分別與P8 引物擴(kuò)增FaeG 基因片段。反應(yīng)條件為：95 ℃3 min；94 ℃30 s、48 ℃30 s、72 ℃2 min，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃終止。將FliC、FliCN、FliCNV基因分別與FaeG 基因等比例混合作為模板，然后共同利用引物P1/P8 進(jìn)行重疊延伸PCR 擴(kuò)增獲得融合基因FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG，反應(yīng)條件為：95 ℃3 min；94 ℃30 s、51 ℃30 s、72 ℃3 min，45 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min，4 ℃終止。

表1 PCR 引物Table 1 Primers used in this study

1.4 各融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過Phyre 和Py-MOL[9]軟件對(duì)FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG融合蛋白進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，3 種嵌合基因中間用GPVDLinker[10]連接。

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定利用BamHⅠ和SalⅠ分別雙酶切FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG嵌合基因及原核表達(dá)載體pET-28a（+）后，用T4 DNA連接酶連接，構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)PCR 鑒定正確后，由南京擎科生物科技公司測(cè)序鑒定，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別命名為pET-FliC-FaeG、pET-FliCNFaeG、pET-FliCNV-FaeG。

1.6 重組蛋白的表達(dá)純化與鑒定將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒分別電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期（OD600nm=0.4～0.5 時(shí)），經(jīng)IPTG（終濃度1 mmol/L）誘導(dǎo)表達(dá)4 h 后離心收集細(xì)菌沉淀經(jīng)超聲破碎后，12 000 r/min 離心15 min，分別收集上清和沉淀。SDS-PAGE 檢測(cè)重組蛋白FliCFaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 的表達(dá)，將包涵體按照Ni2+螯合親和層析試劑盒說明書進(jìn)行純化與復(fù)性。純化的蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE 電泳后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上，以小鼠抗FaeG MAb（1∶1 000）為一抗，山羊抗鼠IgG-HRP（1∶5 000）為二抗，對(duì)重組蛋白FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 進(jìn)行western blot 鑒定，以大腸桿菌FliCH7 陽性血清（1∶7 500）為一抗，山羊抗兔IgG-HRP（1∶10 000）為二抗，western blot 檢 測(cè) 重 組 蛋 白FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 的反應(yīng)原性。

1.7 TLR5 生物活性檢測(cè)根據(jù)Huleatt 等的方法[11]，利用表達(dá)TLR5 的Caco-2 細(xì)胞檢測(cè)融合蛋白的TLR5受體活性：接種Caco-2 細(xì)胞至96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞形成80%單層時(shí)，加入終濃度為5 μg/mL 純化的FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 重組蛋白，其中，用未處理的Caco-2 細(xì)胞作為陰性對(duì)照，刺激Caco-2 細(xì)胞6 h 后，收集細(xì)胞上清液，采用IL-8 和TNF-α ELISA 試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析試驗(yàn)在同一批次細(xì)胞內(nèi)重復(fù)至少3次，數(shù)據(jù)采用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行t-test 檢驗(yàn)，p＜0.05 認(rèn)定為差異顯著，采用Graph-Pad Prism 軟件繪圖。

2 結(jié) 果

2.1FliC-FaeG、FliCN-FaeG和FliCNV-FaeG融合片段的構(gòu)建及重組質(zhì)粒的鑒定以大腸桿菌O157∶H7 基因組為模板，分別利用P1/P3、P1/P5、P1/P7 引物擴(kuò)增FliC、FliCN、FliCNV 基因片段，利用P8 引物與P2、P4、P6 引物擴(kuò)增FaeG 基因片段。結(jié)果顯示在約1 700 bp、500 bp、1 500 bp 和800 bp處出現(xiàn)各目的片段，與預(yù)期大小一致（圖1）。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收，將FliC、FliCN、FliCNV 基因分別與FaeG 基因等比例混合作為模板，利用P1/P8 引物經(jīng)PCR 擴(kuò)增融合片段，結(jié)果顯示分別在約2 600 bp、1 300 bp 和2 300 bp 出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期大小一致（圖1）。進(jìn)一步將融合片段產(chǎn)物克隆至pET-28a（+）載體中，經(jīng)PCR（圖2）和測(cè)序鑒定，結(jié)果表明各重組質(zhì)粒均構(gòu)建正確。

圖1 FliC-FaeG、FliCN-FaeG、FliCNV-FaeG 基因的融合PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 FliC-FaeG,FliCN-FaeG,FliCNV-FaeG fusion gene PCR amplification results

圖2 重組質(zhì)粒pET-FliC-FaeG、pET-FliCN-FaeG、pET-FliCNV-FaeG 的PCR 結(jié)果Fig. 2 PCR product of the recombinant plasmid pET-FliC-FaeG,pET-FliCN-FaeG and pET-FliCNV-FaeG

2.2 融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)通過PyMOL[9]對(duì)FliC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 融合蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示融合蛋白中FaeG 抗原（紅色）與鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域（綠色）緊密結(jié)合（圖3）。表明在融合蛋白中FaeG 和FliC 蛋白不同結(jié)構(gòu)域融合后仍能保持各自獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)。

圖3 融合蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)模型Fig.3 The secondary structure model of fusion proteins

2.3 重組蛋白的表達(dá)與純化各重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后經(jīng)SDS-PAGE 檢測(cè)，結(jié)果顯示分別在約90 ku、48 ku、80 ku 處出現(xiàn)目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖4A）。Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示包含F(xiàn)liCH7 鞭毛蛋白高變區(qū)的FliC-FaeG 和FliCNV-FaeG 融合蛋白能夠被抗FliCH7 的多克隆抗體識(shí)別，F(xiàn)liCN-FaeG 融合蛋白由于不含鞭毛蛋白中間的高變區(qū)，因此不能被識(shí)別（圖4B），表明融合后FliCH7 仍具有生物學(xué)活性。3 種融合蛋白均能夠被抗FaeG 的MAb 識(shí)別（圖4C），而pET-28a（+）/BL21 誘導(dǎo)后菌體蛋白（陰性對(duì)照）無此目的條帶。表明3 個(gè)融合蛋白均獲得了正確的表達(dá)，并且具有良好的反應(yīng)原性。

圖4 重組蛋白的SDS-PAGE檢測(cè)（A）及western blot鑒定（B和C）Fig.4 Analysis of purified FliC-FaeG,FliCN-FaeG,FliCNVFaeG protein by SDS-PAGE(A)and western blot(B and C)

2.4 TLR5 活性檢測(cè)為了評(píng)估FliC-FaeG、FliCNFaeG 和FliCNV-FaeG 重組蛋白的TLR5 受體活性，將Caco-2 細(xì)胞與5 μg/mL 濃度的蛋白質(zhì)一起孵育，測(cè)定6 h 后細(xì)胞上清中的IL-8 和TNF-α水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)liC-FaeG 組產(chǎn)生的IL-8 和TNF-α水平顯著高于對(duì)照組、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 組（p＜0.05）（圖5），F(xiàn)liCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 組無TLR5 受體活性，不能刺激IL-8 和TNF-α炎性因子的產(chǎn)生。表明完整的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)是其激活TLR5 受體活性所必需的。

圖5 融合蛋白TLR5 活性檢測(cè)Fig.5 Detection of TLR5 activity of fusion proteins

3 討 論

鞭毛蛋白具有很強(qiáng)的免疫佐劑活性，其發(fā)揮免疫佐劑活性的機(jī)制目前認(rèn)為是通過其保守結(jié)構(gòu)域與宿主細(xì)胞的TLR5 和NLRC4 受體結(jié)合[8]，激活機(jī)體先天性免疫反應(yīng)而發(fā)揮作用。但是目前對(duì)鞭毛蛋白免疫佐劑活性的充分發(fā)揮是否需要完整的結(jié)構(gòu)仍存在爭議[12-14]，另外對(duì)其免疫佐劑活性機(jī)制和應(yīng)用的研究都主要集中在鼠傷寒沙門氏菌的鞭毛蛋白[15-16]。為探討大腸桿菌鞭毛蛋白是否具有同樣的免疫佐劑活性，以及不同結(jié)構(gòu)域的免疫佐劑活性是否具有差異性，本研究以ETEC 表達(dá)的F4 菌毛的主要結(jié)構(gòu)亞單位FaeG 為模型抗原，構(gòu)建了大腸桿菌FliCH7 鞭毛蛋白的不同結(jié)構(gòu)域FliC、FliCN、FliCNV 與FaeG的融合蛋白。通過對(duì)融合蛋白的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，表明在融合蛋白中FaeG 和FliCH7 蛋白不同結(jié)構(gòu)域融合后仍能維持各自獨(dú)立的結(jié)構(gòu)。進(jìn)一步的western blot 鑒定結(jié)果證明，F(xiàn)liC-FaeG、FliCN-FaeG 和FliCNV-FaeG 均可被抗FaeG 的抗體識(shí)別，包含F(xiàn)liCH7 鞭毛蛋白高變區(qū)的FliC-FaeG 和FliCNV-FaeG 融合蛋白可被抗FliCH7 的抗體識(shí)別，這表明融合后FliCH7 和FaeG 仍具有生物學(xué)活性。Vida 等發(fā)現(xiàn)鞭毛蛋白C 末端D0 區(qū)與TLR5 胞外域進(jìn)行額外的相互作用，通過促進(jìn)受體二聚化在TLR5 激活中發(fā)揮作用，完整的鞭毛蛋白能更好的激活TLR5 受體，促進(jìn)IL-8 和TNF-α炎性因子的分泌[17]。本實(shí)驗(yàn)TLR5 受體活性檢測(cè)結(jié)果表明，僅FliC-FaeG 重組蛋白能激活TLR5，促進(jìn)IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子的產(chǎn)生，表明完整的鞭毛蛋白結(jié)構(gòu)是其激活TLR5 受體活性所必需的。

本研究為下一步研究鞭毛蛋白不同結(jié)構(gòu)域在免疫佐劑活性中的作用奠定了基礎(chǔ)。另外，鑒于鞭毛蛋白具有強(qiáng)的免疫佐劑活性，為下一步評(píng)估將鞭毛蛋白作為F4+ETEC 疫苗新型的免疫佐劑和融合蛋白作為預(yù)防F4+ETEC 引起斷奶仔豬腹瀉疫苗候選抗原提供了研究基礎(chǔ)。