響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取白簕多糖工藝研究

郭鑫磊，趙雨晴，徐 漢，楊 娜，王寶慶

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院 省預(yù)防治療老年病藥物研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 財(cái)政部中央與地方共建實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150076)

白簕學(xué)名(Acanthopanaxtrifoliatus(L.)Merr.)五加科五加屬藥食兩用植物.多糖為結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜的一種物質(zhì)[1]，它是一類重要天然資源，是食品中研究的主要對(duì)象之一，大量研究顯示多糖擁有很多生物功能，包括抗氧化、抗炎、降血糖等[2].植物多糖是由提取、分離、純化而獲得的一種具有活性的天然大分子物質(zhì)，其在植物體內(nèi)廣泛存在.人們開始了解到多糖擁有無毒、無害特點(diǎn)，同時(shí)具有多種多樣的生物學(xué)作用、來源途徑很廣、可以作為新興飼料的添加劑[3].目前，針對(duì)植物多糖的藥理作用探究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，已經(jīng)證實(shí)植物多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎癥等多種生物功能[4].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 新藝超聲設(shè)備有限公司，N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海愛朗儀器有限公司，LAMBDA 650紫外可見光分光光度計(jì) 珀金埃爾默公司，3K30低溫離心機(jī) SIGMA公司，循環(huán)水真空泵SHB-95 鄭州杜甫儀器廠

1.1.2 試劑與材料

實(shí)驗(yàn)試劑：氯仿、蒽酮、濃硫酸、酒石酸鉀鈉、乙醇、硫酸銅、葡萄糖等都是分析純.

實(shí)驗(yàn)材料：白簕(購自哈爾濱三棵樹藥材大市場)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

多糖的分析采用蒽酮-硫酸法,用葡萄糖作對(duì)照品，測定吸光度

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，置干燥試管中分別加水稀釋，冷水冷卻5 min，然后向其中放入新配制蒽酮-硫酸溶液4 mL，混勻，沸水浴升溫，室溫冷卻，在620 nm測吸光度，用質(zhì)量濃度對(duì)吸光度做標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=56.81C-0.0087，r=0.999 7[5].

1.2.2 超聲提取工藝流程

精準(zhǔn)稱量自然干燥的白簕粉(過40目篩)5.00 g，置于500 mL空瓶中，加提取試劑，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)進(jìn)行分離提取，收集提取液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至50 mL.以Savage方式去蛋白，在溶液里放正丁醇和氯仿(1∶4)，對(duì)溶液進(jìn)行搖晃，持續(xù)20 min，使其混和均勻，離心10 min(4 000 r/min)，水相進(jìn)行相同操作.對(duì)樣品離心10 min，棄上清，定容至250 mL.按蒽酮-硫酸法測樣品中多糖含量[6].

提取率(%)=(白簕莖皮中所含的多糖質(zhì)量/白簕的莖皮質(zhì)量).

1.2.3 白簕中多糖提取單因素考察

1)溶劑的選擇

精準(zhǔn)稱量5.00 g白簕粉，然后分別選擇水、乙醇、丙酮作為溶劑，按料液比1∶25(g/mL)，于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中，在100 W下提取30 min.以1.2.2項(xiàng)下流程得出提取率.

2)料液比的選擇

精準(zhǔn)稱量5.00 g白簕粉，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇作為提取溶液，按照料液比是1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)，在100 W下進(jìn)行提取25 min.以1.2.2項(xiàng)下流程得出提取率.

3)乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

精準(zhǔn)稱量5.00 g白簕粉，在料液比1∶25(g/mL)，超聲功率100 W、提取時(shí)間25 min的條件下，分別用體積分?jǐn)?shù)20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇于超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)中進(jìn)行提取.以1.2.2項(xiàng)下流程得出提取率.

4)提取時(shí)間的選擇

精準(zhǔn)稱量5.00 g白簕粉，用70%的乙醇在料液比1∶25(g/mL)、超聲功率100W的要求下，提取5、10、15、20、25、30、35、40 min.以1.2.2項(xiàng)下流程得出提取率.

5)超聲功率的選擇

準(zhǔn)確稱取5.00 g白簕粉，用70%的乙醇在料液比1∶25(g/mL)的條件下，分別于超聲功率為50、60、70、80、90、100、110、120 W，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)提取25 min.以1.2.2項(xiàng)下流程得出提取率[7].

1.2.4 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案

將料液比、溶劑乙醇體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、超聲功率這些條件作為自變量，進(jìn)行響應(yīng)面分析[8].實(shí)驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1.

表1 因素水平設(shè)計(jì)表

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同有機(jī)溶劑的選擇

為了選好的提取劑，分別以無水乙醇、丙酮、水作為多糖提取劑，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，提取率分別為5.93%，5.12%，4.26%.根據(jù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙醇作為溶劑所得的提取率最高，所以選擇溶劑是乙醇.

2.1.2 料液比的選擇

料液比分別為1∶5，1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35，1∶40(g/mL)時(shí)，相應(yīng)的多糖提取率見圖1.

圖1 料液比對(duì)提取率的影響

由圖1可知，料液比從1∶5到1∶20，提取率從5.46%上升到6.43%；料液比由1∶20到1∶40，提取率從6.43%下降到5.42%.原因可能是料液比太高，干擾白簕里多糖溶出；料液比過小，會(huì)減小提取劑的體積分?jǐn)?shù).最佳單因素是1∶20[9].

由表3可知，采用SNCR+PNCR聯(lián)合脫硝NOx控制在100 mg/m3時(shí)，20%氨水耗量為4.0 kg/t，PNCR還原劑耗量為2.0 kg/t，運(yùn)行成本為11.9元/t；根據(jù)現(xiàn)場運(yùn)行情況，NOx去除效率越高，PNCR藥劑所需噴量越大，氨逃逸越大，PNCR系統(tǒng)堵料概率越高，導(dǎo)致NOx排放值波動(dòng)越大。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇

乙醇體積分?jǐn)?shù)分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%時(shí)，相應(yīng)的多糖提取率見圖2.

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取率的影響

乙醇的體積分?jǐn)?shù)不斷升高，提取率開始增大后減小，達(dá)到80%，提取率最大.原因可能是多糖在不同體積分?jǐn)?shù)的溶劑中溶解效果不同，體積分?jǐn)?shù)≤80%，溶解度因體積分?jǐn)?shù)升高而升高；體積分?jǐn)?shù)>80%，溶解度隨體積分?jǐn)?shù)增加而下降.最佳單因素是80%[10].

2.1.4 提取時(shí)間的選擇

進(jìn)行提取的時(shí)間是5、10、15，20、25、30、35、40 min時(shí)，所得結(jié)果見圖3.

圖3 提取時(shí)間對(duì)提取率的影響

時(shí)間在20 min以前，隨著時(shí)間增加，提取率上升，時(shí)間到達(dá)20 min時(shí)，提取率最大，20 min以后開始下降.原因可能是多糖在20 min基本提取完成，達(dá)到最大的提取率；時(shí)間增加，一些多糖被降解成單糖溶解在乙醇里，在醇沉過程中會(huì)損失一部分，造成提取率減少.最佳單因素是20 min[11].

2.1.5 超聲波功率的選擇

進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的超聲功率分別是50、60、70、80、90、100、110、120 W，見圖4.

圖4 超聲功率對(duì)提取率的影響

由圖4可知，功率不斷增大，提取率先上升后下降，功率達(dá)到100 W，提取率最大.此結(jié)果可能是因?yàn)樘崛÷室蚬β噬叨仙?；但是功率過大則造成溫度太高，多糖被水解，提取率降低.最佳單因素是100 W[12].

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

對(duì)單因素實(shí)驗(yàn)得到提取工藝采取優(yōu)化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2.

將表2所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，回歸模型方差分析見表3.

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表3 二次項(xiàng)模型的線性系數(shù)及方差分析

運(yùn)用Design Expert 10.0軟件做多元二次擬合，所得提取率(Y)和料液比(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(B)、提取時(shí)間(C)、超聲波功率(D)回歸模型為：提取率=6.52+0.087A-0.027B-0.072C+0.089D-0.075AB-0.02AC+5.0AD+0.077BC+0.085BD-0.017CD-1.11A2-0.015B2+0.019C2+0.06D2

由表3可知，回歸模型顯著(P<0.000 1)，失擬項(xiàng)不顯著(P=0.595 1>0.05)，R2=0.993 3，證明可以使用該模型對(duì)白簕中多糖提取率進(jìn)行預(yù)測[13].由表3分析可以看出，一次項(xiàng)料液比及超聲功率對(duì)結(jié)果有很大作用，都是P<0.000 1；時(shí)間對(duì)結(jié)果作用其次，體積分?jǐn)?shù)對(duì)結(jié)果作用最小；干擾因素的效果是超聲功率>料液比>提取時(shí)間>乙醇體積分?jǐn)?shù).

由此對(duì)其回歸方程進(jìn)行優(yōu)化得新的二次回歸方程為：提取率=6.52+0.087A-0.027B-0.072C+0.089D-0.075AB+0.077BC+0.085BD-1.11A2+0.06D2

由回歸方程得出響應(yīng)面分析圖，見圖5～10.

圖5 料液比與乙醇體積分?jǐn)?shù)作用影響多糖提取率曲線

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)與提取時(shí)間作用影響多糖提取率曲線

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲功率作用影響多糖提取率曲線

圖8 料液比與提取時(shí)間作用影響多糖提取率曲線

圖9 料液比與超聲功率作用影響多糖提取率曲線

圖10 提取時(shí)間與超聲功率作用影響多糖提取率曲線

從圖5～10可以看出，不同因子交互作用對(duì)結(jié)果的干擾.通過查看6組圖，料液比與體積分?jǐn)?shù)、體積分?jǐn)?shù)與時(shí)間、體積分?jǐn)?shù)與功率間關(guān)系對(duì)結(jié)果影響較大[14]；時(shí)間與功率、料液比與時(shí)間及料液比與功率間關(guān)系對(duì)結(jié)果干擾很小.此結(jié)果和方差中二次項(xiàng)結(jié)果一致[15].

根據(jù)以上結(jié)果得出多糖最終提取方法是：料液比1∶20.318 209(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)71.490 62%、提取時(shí)間15.000 07 min、超聲功率99.999 85 W，這時(shí)白簕中多糖提取率可以得到的理論最大值是6.89%.為便于實(shí)際操作，修改為料液比1∶20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、提取時(shí)間15 min、超聲功率100 W，所得實(shí)際提取率為6.85%，數(shù)值接近.

3 結(jié) 語

本文以白簕粉末作為原材料，采用超聲波法對(duì)白簕中的多糖進(jìn)行提取，采用超聲波法對(duì)白簕中多糖提取的最優(yōu)條件為：料液比1∶20(g/mL)、乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、提取時(shí)間15 min、超聲功率100 W.結(jié)果表明，采用超聲波法提取白簕多糖，具有方法操作性好、結(jié)果好、快速準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，能夠?yàn)閷戆缀{的繼續(xù)深入研究做好基礎(chǔ)性工作，推動(dòng)白簕相關(guān)應(yīng)用研究的發(fā)展.