洋蔥花梗愈傷誘導(dǎo)及再生體系的建立

惠林沖，陳微，李威亞，潘美紅，何林玉，王江英，陳振泰，繆美華，楊海峰

（連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 連云港 222000）

洋蔥愈傷組織的誘導(dǎo)、再生與外植體的選擇關(guān)系密切。研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥的種子［1］、成熟胚［2］、鱗莖盤［3］、胚根［4］等均可作為外植體誘導(dǎo)形成愈傷組織，但部分誘導(dǎo)出的愈傷組織不能形成再生苗。Valk等［5］認(rèn)為洋蔥愈傷組織誘導(dǎo)受基因型影響，因此，誘導(dǎo)時(shí)需要對(duì)多種材料進(jìn)行篩選，綜合考慮外植體類型、污染率、消毒操作難易程度等。

我國的經(jīng)濟(jì)正在進(jìn)入深化改革的階段，社會(huì)資源的供需矛盾正在加劇。最明顯的問題就是社會(huì)利益分配不均。由于法律制度存在滯后性，而我國的發(fā)展速度非?？?，造成了法律法規(guī)的建設(shè)無法跟上社會(huì)的發(fā)展速度。普遍存在的問題是對(duì)權(quán)利的監(jiān)督不完善，導(dǎo)致社會(huì)不公平的問題較多，影響青少年價(jià)值觀的形成。需要加快社會(huì)保障制度的完善，提高法律法規(guī)的規(guī)范化，做到有法可依和有法必依。

洋蔥種子易保存，但存在種子污染率較高、后期需要轉(zhuǎn)接胚以及操作繁瑣且不適宜大規(guī)模篩選操作等問題。目前，中國水仙［6］、石蒜［7］、桂花［8］、文心蘭［9］等花卉植物的花梗經(jīng)誘導(dǎo)均可形成愈傷組織，而洋蔥的小花梗多且易取，消毒方便、污染率低。因此，本試驗(yàn)選取8個(gè)洋蔥品種，用其花梗進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)及再生研究，以期為構(gòu)建洋蔥遺傳轉(zhuǎn)化體系和基因編輯技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

2012年8月31日第十一屆全國人民代表大會(huì)常務(wù)委員會(huì)第二十八次會(huì)議通過了《關(guān)于修改〈中華人民共和國民事訴訟法〉的決定》，該修改決定首次在簡易程序章節(jié)中以法律形式規(guī)定了我國的民事小額訴訟制度，其意義極為重大。然而，因?yàn)榱⒎▽?duì)小額訴訟制度只作了簡單的規(guī)定，所以導(dǎo)致不同人對(duì)小額訴訟有不同的解讀，小額訴訟制度的多義性在學(xué)理上有其合理性，但在實(shí)踐中卻不利于其統(tǒng)一實(shí)施。基于此，本文擬通過對(duì)小額訴訟程序性質(zhì)的解讀，為小額訴訟制度的具體規(guī)范提供一些前提性的資源。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)選用中日照洋蔥品種（表1），均種植于連云港市農(nóng)業(yè)科學(xué)院東辛試驗(yàn)基地。于洋蔥先期抽薹時(shí)取未開裂花苞，裝入密封袋中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 供試洋蔥品種詳細(xì)信息

1.2 花梗愈傷組織誘導(dǎo)

醫(yī)院要完善新醫(yī)改下的精細(xì)化管理工作，就需要有力的財(cái)經(jīng)管理部門作為支撐，按照《醫(yī)院財(cái)務(wù)制度》，實(shí)施全面預(yù)算管理，著力成本控制，有效防范風(fēng)險(xiǎn)，達(dá)成綜合績效目標(biāo)，使財(cái)務(wù)工作實(shí)現(xiàn)閉環(huán)式管理。通過建立管理會(huì)計(jì)制度，促進(jìn)醫(yī)院財(cái)務(wù)精細(xì)化，科學(xué)化管理，優(yōu)化流程，提升組織效率。但是，在這個(gè)階段，醫(yī)院財(cái)務(wù)人員的整體規(guī)模不足。這表明在推進(jìn)管理會(huì)計(jì)的過程中，管理型人才實(shí)力就更加緊缺。

1.3 愈傷組織繼代培養(yǎng)及再生苗誘導(dǎo)

將誘導(dǎo)出的洋蔥苗在再生培養(yǎng)基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）中生根，待基部鱗莖達(dá)0.5 cm，于4℃放置24 h。用清水清洗根部培養(yǎng)基（根部不離水）后移栽到花盆中，室內(nèi)（散射光照射）放置3 d后移至室外生長，期間防止陽光直射。

1.4 馴化移栽

將誘導(dǎo)得到的愈傷組織繼代培養(yǎng)基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D ＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）培養(yǎng)4周后轉(zhuǎn)接至無激素的培養(yǎng)基（MS＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）上，每品種轉(zhuǎn)接80瓶，每瓶5個(gè)愈傷。在光照強(qiáng)度為50μmol／（m2·s）、光周期16 h／d、25℃條件下培養(yǎng)120 d后，統(tǒng)計(jì)再生芽的數(shù)量，計(jì)算再生頻率。再生頻率＝再生苗數(shù)量／愈傷組織總數(shù)。

將花苞用自來水沖洗10 min，去除最外層花苞，同時(shí)去除花朵，只留花梗。用75%酒精浸泡花梗30 s，無菌水沖洗兩次，2%次氯酸鈉浸泡10 min，無菌水沖洗兩次，后用無菌濾紙吸干多余水分。將花梗切碎放入盛有25 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS＋1.8 mg／L 2，4-D＋2.0 mg／L甘氨酸＋700 mg／L脯氨酸＋1.0 g／L干酪素水解物＋30 g／L蔗糖＋8 g／L瓊脂）的培養(yǎng)皿（直徑為9 cm）中，每品種接種20皿，置于黑暗、25℃下培養(yǎng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 洋蔥花梗愈傷組織誘導(dǎo)分析

切碎的花梗培養(yǎng)3～4 d后，兩端開始形成愈傷組織并逐步生長變大，顏色呈淡黃色（圖1A）。待其長至米粒大小時(shí)轉(zhuǎn)入新培養(yǎng)基中進(jìn)行繼代培養(yǎng)，8個(gè)品種不受基因型影響，均能誘導(dǎo)出愈傷組織，誘導(dǎo)率為100%（圖1B）。

2.2 洋蔥愈傷組織再生苗誘導(dǎo)分析

由表2可以看出，8個(gè)品種中1803再生頻率最高，達(dá)30%，其它品種不足10%；1833、1864和1868的愈傷組織未誘導(dǎo)成苗，呈白灰色、發(fā)軟，未見新根誘導(dǎo)及生長跡象。因此，洋蔥再生頻率與愈傷組織外植體基因型有關(guān)。

經(jīng)誘導(dǎo)，洋蔥愈傷組織開始生根，但不同品種間生根快慢和多少存在差異。培養(yǎng)60 d后，大部分愈傷組織呈干枯狀（圖2A、2B）；較大的愈傷組織上綠色原基開始突出，慢慢長出畸形管狀葉（圖2B、2C），隨后萌發(fā)出多個(gè)管狀葉，形成植株（圖2D）。洋蔥苗于鱗莖基部生根，長苗和生根同步進(jìn)行，長出的根比原愈傷組織的粗壯、長且長速快（圖2E、2F）。

表2 洋蔥愈傷組織再生苗數(shù)統(tǒng)計(jì)

2.3 洋蔥愈傷組織再生苗移栽結(jié)果

誘導(dǎo)洋蔥苗移栽后的生長情況如圖3所示，移栽成活率為90%。但葉片過細(xì)和數(shù)量少時(shí)不宜移栽，可在組培瓶中多生長一段時(shí)間。

時(shí)值冬季，天氣逐漸寒冷，寶寶稍不注意“小肚子”就會(huì)著涼，尤其是年齡較小的寶寶，拉起肚子來往往讓寶媽們措手不及又心疼不已。

3 討論與結(jié)論

目前，國內(nèi)外少有采用洋蔥花梗作為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)的報(bào)道，大部分研究集中于種子、成熟胚、莖尖等外植體，而在園藝花卉植物中利用花梗進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)較為普遍。鐘瑞潔［10］對(duì)‘新發(fā)中秋花’萱草進(jìn)行組織培養(yǎng)研究發(fā)現(xiàn)，其幼嫩花梗分蘗結(jié)節(jié)處為最適宜外植體。張夢迪［11］以朱頂紅‘Blossom Peacock’和‘Royal Velvet’花梗為外植體進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其在光照、培養(yǎng)基為MS＋0.5 mg／L萘乙酸（NAA）＋2.0 mg／L噻苯?。═DZ）上的愈傷誘導(dǎo)率分別達(dá)到37.50%、29.17%。陳菁玨［12］認(rèn)為花梗是石蒜花愈傷誘導(dǎo)的最佳外植體。張杰等［13］也認(rèn)為百合花器官中花絲易誘導(dǎo)形成愈傷組織，花梗易誘導(dǎo)成不定芽。基于此，本研究對(duì)8個(gè)洋蔥品種花梗進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)其均能形成愈傷組織，誘導(dǎo)率高達(dá)100%。花梗為果實(shí)或種子提供營養(yǎng)的必經(jīng)通道，運(yùn)輸營養(yǎng)物質(zhì)和代謝激素，尤其是離體培養(yǎng)后相關(guān)基因調(diào)控激素代謝表達(dá)。Fu等［14］對(duì)番茄花梗脫落過程的研究發(fā)現(xiàn)，水解植物生長素結(jié)合物調(diào)節(jié)生長素濃度，SlILR1、5、6基因在花梗脫落中起關(guān)鍵作用。本試驗(yàn)認(rèn)為，將花梗放入培養(yǎng)基中培養(yǎng)，較長的花梗會(huì)在培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，且花梗中存在調(diào)控生長相關(guān)激素，能夠促進(jìn)愈傷萌發(fā)。

本研究中8個(gè)品種均能100%誘導(dǎo)形成愈傷組織，但3個(gè)品種未誘導(dǎo)成苗，僅1803品種再生頻率最高，為30%，其它4個(gè)品種的再生頻率非常低。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥其它外植體也能經(jīng)誘導(dǎo)形成愈傷，但在各種激素或無激素培養(yǎng)基上均未誘導(dǎo)成苗，且45 d后愈傷組織開始干枯、由淡黃變灰白色，50 d后枯死。本研究中愈傷組織生長較慢，因放假等原因超50 d未繼代處理，60 d后開始有綠色原基出現(xiàn)，2～3個(gè)月才有洋蔥苗長出，120 d后未誘導(dǎo)成苗的愈傷組織發(fā)軟或表面干枯。

研究發(fā)現(xiàn)，洋蔥胚芽（莖尖）誘導(dǎo)形成的愈傷組織在MS＋1.5 mg／L 6-BA＋2 mg／L甘氨酸和MS＋1 mg／L TDZ＋0.5 mg／L NAA＋7.5 mg／L AgNO3培 養(yǎng)基 上 再 生 頻 率 分 別 達(dá)78%［15］、82%［16］，在MS＋30 g／L蔗糖和BDS（改良B5培養(yǎng)基）＋30 g／L蔗糖培養(yǎng)基上再生頻率分別達(dá)到44%和80%［17，18］。本研究中洋蔥花梗愈傷組織在無激素培養(yǎng)基上能夠誘導(dǎo)再生苗，再生頻率為30%。另有研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理改變水稻花藥壁的多糖和蛋白質(zhì)組成，并增加花粉的繁殖力和愈傷組織的誘導(dǎo)率；低溫預(yù)培養(yǎng)提高了雪蓮愈傷組織的存活率和再生能力［19，20］。洋蔥苗生長發(fā)芽以及春化均需要較低的溫度，低溫可能會(huì)促進(jìn)其愈傷再生頻率，下一步將研究低溫處理是否有利于洋蔥再生頻率的提高。