普魯卡因通過抑制JAK2/STAT3通路緩解神經(jīng)病理性疼痛

李東華 田英剛 段 勇

濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 山東 濱州 256603

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain，NPP)是由軀體感覺系統(tǒng)的病變所引起的，常常伴有外周神經(jīng)功能和中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的變化[1]。目前發(fā)現(xiàn)，NPP多發(fā)于中老年人和癌癥患者，已經(jīng)成為全球的負擔[2]。NPP包括陰性和陽性感覺癥狀。前者表現(xiàn)為不同體表感覺的缺失，如感覺遲鈍，麻木和振動感喪失；后者表現(xiàn)為痛覺過敏，陣發(fā)性疼痛和持續(xù)性表面疼痛等[3]。據(jù)報道， NPP的治療效果較差，嚴重影響了患者的生活質(zhì)量，是導致慢性疼痛的主要因素。近年來，醫(yī)學界對NPP的分子學治療的研究逐漸深入[4]，這對治療NPP具有十分重要的意義。

普魯卡因是臨床工作中廣泛使用的一種酯類局部麻醉藥。近年來，有研究證實普魯卡因具有治療疾病的作用，例如，在正中神經(jīng)周圍注射4 mL 1%的普魯卡因可改善腕管綜合征患者的電生理指標和臨床癥狀[5]。亦有研究證實，普魯卡因能通過調(diào)節(jié)各種細胞凋亡途徑，進而來治療膀胱癌，因此可作為治療膀胱癌的潛在藥物[6]。其新功能引起了醫(yī)學界的關注。因此，本實驗旨在研究普魯卡因是否具有緩解NPP的作用。

1 材料與方法

1.1 材料 熱輻射刺痛儀、電子觸覺測量儀購于美國。質(zhì)粒載體pcDNA3.1、TRIzol總RNA抽提試劑購于美國。第一鏈cDNA合成試劑盒購于大連TaKaRa公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 隨機把18只體質(zhì)量為180～210 g的SD雌性大鼠分為對照組、CCI組和CCI+普魯卡因組，平均每組6只，其中對照組不做雙側(cè)大鼠坐骨神經(jīng)壓迫模型(chronic constriction，CCI)手術(shù)，CCI組和CCI+普魯卡因組大鼠均需做CCI手術(shù)。分別在手術(shù)前3天，手術(shù)1天和手術(shù)前為CCI +普魯卡因組大鼠鞘內(nèi)注射2%的鹽酸普魯卡因，劑量均為10 μL/kg，溶劑為DSMO。注射時間均為上午9時。而對照組和CCI組大鼠則鞘內(nèi)給予等容量DSMO。

1.2.2 動物模型的建立 參照Bennet等[7]的方法建立CCI大鼠模型。所有大鼠給予戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔內(nèi)注射麻醉，然后消毒、鋪巾，用4.0鉻腸線在大鼠坐骨神經(jīng)起始部上方2 mm處進行結(jié)扎。對側(cè)同樣操作。

1.2.3 疼痛行為學觀察 術(shù)后第0、5、10、15、20天(20∶00)分別對三組大鼠進行監(jiān)測，觀察其對熱刺激、機械刺激及冷刺激的疼痛行為學評分。

1.2.3.1 測定機械刺激縮足反射閾值 參靠Vivancos等[8]的辦法，用von Frey電子測痛儀測量大鼠機械刺激縮足反射閾值。用金屬探針垂直刺激大鼠雙側(cè)后足跟，使其3秒鐘內(nèi)出現(xiàn)快速縮足或舔足等反應。每只大鼠被重復檢測3次。取其平均數(shù)，將之定為機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawal threshold,MWT),三組均于普魯卡因預處理前進行測定。

1.2.3.2 測定熱刺激縮足反射潛伏期 參考Hargreaves等[9]的辦法，用輻射熱測痛儀垂直照射大鼠兩后足底 ,大鼠出現(xiàn)快速退縮或舔足等動作時停止,將持續(xù)照射的時間稱為縮足反射潛伏期 。每側(cè)測3次，取平均值，定之為熱刺激縮足反射潛伏期(paw withdrawal thermal latency,PWTL)。三組均在普魯卡因預處理前測定。

1.2.3.3 測定冷刺激縮足反射閾值 參考Datta等[10]的辦法，在大鼠后足跟處滴丙酮0.1 mL，如其出現(xiàn)快速縮足或舔足等反應表示陽性，每側(cè)測3次。記錄每分鐘出現(xiàn)陽性反應的次數(shù)，取平均值將之定為冷刺激縮足反射閾值。

1.2.4 取材 術(shù)后20天行為學檢查后，將大鼠腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉(40 mg/kg)實施麻醉，然后處死。取其L4-L6脊髓背角，并在液氮中迅速冷凍后提取RNA和蛋白質(zhì)。

1.2.5 qRT-PCR檢測JAK2和STAT3的mRNA表達 參照說明書，由TRIzol從組織中提取總RNA。用DNase I純化RNA以除去DNA污染物。 在Quant-Studio 6 Flex實時PCR系統(tǒng)上進行qRT-PCR(每個反應系統(tǒng)包含20 ng cDNA和大鼠Jak2和Stat3的特異性引物)。數(shù)據(jù)通過Gapdh和Rv標準化，并用2-ΔΔCt方法分析。

1.2.6 western blot檢測JAK2和STAT3的表達 參照說明書，通過RIPA裂解緩沖液從組織中提取蛋白質(zhì)樣品。在凝膠電泳上分離相同量的每種樣品的蛋白質(zhì)，然后轉(zhuǎn)膜。于室溫下將膜在5%脫脂乳中封閉2 h，并在4℃下在JAK2，STAT3和GAPDH的特異性抗體中孵育過夜，GAPDH被用作內(nèi)參。然后將膜在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌2次，并在辣根過氧化物酶綴合的二次抗體中在室溫下孵育1 h。使用ECL Plus Western Blotting底物開發(fā)信號，并用ImageJ 1.49分析條帶密度。

2 結(jié)果

2.1 坐骨神經(jīng)壓迫損傷和普魯卡因?qū)Υ笫筇弁丛u分的影響 CCI術(shù)前，本實驗檢測到各組動物兩側(cè)后足的PWTL、MWT及冷刺激縮足反射閾值比較，差異無統(tǒng)計學意義。因此本研究對其平均值進行分析。結(jié)果顯示：從術(shù)后第10天開始，CCI組與對照組大鼠的MWT差異有統(tǒng)計學意義，P<0.05；CCI組大鼠在術(shù)后第10、15天的MWT低于CCI+普魯卡因組大鼠，P<0.05(圖1A)；CCI組大鼠在術(shù)后第15天的PWTL最低，在術(shù)后第5天開始低于對照組，P<0.01；CCI組大鼠PWTL在術(shù)后第15、20天均低于CCI+普魯卡因組大鼠，P<0.01(圖1B)；在CCI術(shù)后的第5、10、15天，CCI組大鼠冷刺激陽性反應次數(shù)均明顯高于對照組，P<0.01，在第5天最明顯；相比于CCI組，CCI+普魯卡因組大鼠在CCI術(shù)后第15天的冷刺激縮足反射閾值均有明顯降低，P<0.05(圖1C)。

2.2 坐骨神經(jīng)壓迫損傷和普魯卡因?qū)Υ笫竽康幕蚝偷鞍椎挠绊?/p>

2.2.1 qRT-PCR結(jié)果

2.2.1.1 總RNA的質(zhì)量鑒定結(jié)果 分別提取三組大鼠的脊髓背角總RNA，進行測定OD260/OD280，其結(jié)果均為1.8～2.0，電泳結(jié)果顯示：18和28 s處 RNA條帶清晰，且18 s處的條帶亮度約為28 s處條帶亮度的2倍(圖2)，由此說明提取的總RNA較為完整，可以進行qRT-PCR。

2.2.1.2 目的基因熔解曲線 將 GAPDH 作內(nèi)參來進行qRT-PCR的擴增，而后檢測各個樣品孔熔解曲線。檢測結(jié)果顯示每個產(chǎn)物曲線均呈特異性單峰，表示無其他特異性產(chǎn)物。

2.2.2 坐骨神經(jīng)壓迫損傷和普魯卡因?qū)Υ笫竽康幕虻挠绊?CCI術(shù)后第20天對各組大鼠分別進行取材，測JAK2 mRNA和STAT3 mRNA，其結(jié)果顯示：與對照組比較，CCI組大鼠均明顯較高，P<0.05或<0.01；同樣，與CCI+普魯卡因組比較，CCI組測得的JAK2 mRNA和STAT3 mRNA亦明顯較高，P<0.05，見圖3、4。

2.2.3 坐骨神經(jīng)壓迫損傷及普魯卡因?qū)Υ笫竽康牡鞍妆磉_的影響 CCI術(shù)后20天對各組大鼠分別進行取材，測得JAK2和STAT3的蛋白濃度，結(jié)果顯示：CCI組大鼠的JAK2和STAT3的蛋白濃度明顯高于對照組，P<0.01；而CCI+普魯卡因組亦同樣低于CCI組，P<0.01，見圖5。

3 討論

本研究中，CCI組大鼠表現(xiàn)出了比對照組更為敏感的疼痛行為學反應，同時測得其脊髓背角的JAK2以及STAT3的mRNA和蛋白水平均升高，這提示了在CCI誘發(fā)大鼠NPP的過程中激活了JAK2/STAT3信號通路，這也是產(chǎn)生NPP的原因。JAK/STAT信號通路和MAPK傳導系統(tǒng)是神經(jīng)細胞因子如白細胞介素-6的重要信號轉(zhuǎn)導途徑，并且?guī)缀跛凶饔肑AK的細胞因子均可激活JAK2/STAT3信號通路[11]。外周神經(jīng)損傷引起了STAT3的磷酸化，導致了JAK2/STAT3信號通路被激活，進而引起了NPP[12]。對脊髓損傷大鼠的研究，發(fā)現(xiàn)JAK/STAT3抑制劑可誘導脊髓背角星形膠質(zhì)細胞少量增生，并可促進觸覺性異常性疼痛的恢復[13]。此外，有研究證實脊髓IL-33/ST2信號可通過激活JAK2/STAT3信號通路使NPP加劇[14]。 WP1066是STAT3的信號傳導抑制劑，其可緩解CCI大鼠的疼痛行為，因此可做為治療NPP的藥物[15]?；谶@些參考文獻，我們可以看出JAK2/STAT3信號通路在外周和脊髓神經(jīng)損傷中均能被激活，而抑制其信號傳導則可減輕NPP。

普魯卡因可抑制鈉離子通道的開放，阻滯鈉離子內(nèi)流，從而阻斷了疼痛信號的傳遞。同時，它還可以抑制Ca2+通道的開放，這也是其產(chǎn)生局部麻醉的機制[16]。其緩解疼痛的作用激發(fā)了我們對普魯卡因是否可以治療NPP的設想。本實驗結(jié)果表明：CCI誘導的NPP模型大鼠用普魯卡因預處理可以緩解其機械、熱和冷刺激下的疼痛行為。CCI手術(shù)誘導周圍神經(jīng)損傷，并且在脊髓水平上可檢測到其影響結(jié)果，如JAK2和STAT3在基因水平及蛋白水平均有明顯升高。在此基礎上，鞘內(nèi)注射普魯卡因可緩解大鼠的疼痛行為，降低了JAK2和STAT3的水平，說明抑制了JAK2/STAT3的信號傳導，提示普魯卡因可有效緩解NPP。

綜上所述，本研究揭示了普魯卡因在CCI誘導的NPP模型大鼠中有減輕NPP的新作用，表明普魯卡因是治療NPP的潛在藥物。普魯卡因的這種新作用可能與抑制了JAK2/STAT3的信號傳導有關，但是其詳細機制仍有待于進一步的研究。