阿爾茨海默病外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量及功能的研究

李海員?徐雪?劉敏?韋伶郁?古釬林?宋漢聰?陳秋蕾?徐嘉

【摘要】目的 觀察內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）在阿爾茨海默?。ˋD）外周血中的數(shù)量及功能，探討AD潛在的血管機(jī)制。方法 選擇58例AD患者分為輕度癡呆組19例、中度癡呆組21例和重度癡呆組18例，并以18名無癡呆者作為對(duì)照組，采集外周血，分離及培養(yǎng)EPC，采用熒光標(biāo)記方法評(píng)估體外培養(yǎng)EPC數(shù)量，同時(shí)檢測(cè)EPC的遷移和黏附功能，分別進(jìn)行組間EPC數(shù)量、遷移和黏附功能的對(duì)比。結(jié)果 4組外周血EPC數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。中度癡呆組和重度癡呆組的外周血 EPC的遷移和黏附功能均低于輕度癡呆組和無癡呆組（P均< 0.05）。結(jié)論 AD患者的EPC功能下降，導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞修復(fù)功能降低，這可能與AD的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】阿爾茨海默病;內(nèi)皮祖細(xì)胞;血管機(jī)制

Study of quantity and function of endothelial progenitor cells in peripheral blood of patients with Alzheimers disease Li Haiyuan， Xu Xue， Liu Min， Wei Lingyu， Gu Xianlin， Song Hancong， Chen Qiulei， Xu Jia. Care Center for the Elderly with Dementia， Home for the Aged Guangzhou， Guangzhou 510550， China

Corresponding author， Xu Jia， E-mail： 2828stone@ sina. com

【Abstract】Objective To observe the quantity and function of endothelial progenitor cells （EPCs） in the peripheral blood of patients with Alzheimers disease， and to explore the potential vascular mechanism of Alzheimers disease. Methods Fifty-eight patients with Alzheimers disease were divided into the mild （n = 19）， moderate （n = 21） and severe groups （n = 18）， and 18 normal control were assigned into the control group. The EPCs were isolated from the peripheral blood and cultured in vitro. The quantity of EPCs was evaluated by AC-LDL/lectin fluorescent labeling method， and the migration and adhesion ability of EPCs were detected. The number， migration and adhesion function of EPCs among four groups were statistically compared. Results The number of circulating EPCs did not significantly differ among four groups （all P > 0.05）. The migration and adhesion function of circulating EPCs in the moderate and severe groups were significantly lower than those in the mild and control groups （all P < 0.05）. Conclusions Patients with Alzheimers disease present with decreased EPCs function. The decline in repair function of endothelial cells caused by the vascular mechanism is probably involved in the incidence and development of Alzheimers disease.

【Key words】Alzheimers disease;Endothelial progenitor cell;Vascular mechanism

阿爾茨海默?。ˋD）是最常見的老年期癡呆類型，其所致的漸進(jìn)性記憶障礙、日常生活能力下降及精神行為異常給社會(huì)及家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，是人類所面臨的最大的全球公共衛(wèi)生事件[1]。目前AD的病因仍不明確，盡管神經(jīng)變性機(jī)制是最被公認(rèn)的機(jī)制之一，但仍存在不能通過變性機(jī)制可以解釋的地方，例如AD患者合并血管相關(guān)基礎(chǔ)疾病的比例更高，而發(fā)生過血管病變患者的AD進(jìn)展會(huì)更快[2-3]。血管學(xué)說在AD的致病機(jī)制中的作用越來越受到重視，對(duì)AD機(jī)制的研究可為AD的預(yù)防和治療提供更多的線索依據(jù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPC）能直接反映血管內(nèi)皮功能的指標(biāo)，其數(shù)量和功能的減低提示血管內(nèi)皮功能失調(diào)及血管修復(fù)能力下降[4]。本研究旨在分析EPC在不同嚴(yán)重程度AD患者外周血中的表達(dá)，以探討AD潛在的發(fā)病機(jī)制。

對(duì)象與方法

一、研究對(duì)象

選擇2018年10月至2019年12月廣州市老人院失智老人照顧中心及中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院神經(jīng)內(nèi)科收治的58例AD患者（研究組），均符合2011年美國國立老化研究所和AD協(xié)會(huì)（NIA-AA）提出的很可能AD診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。另選擇同期在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院東院因其他原因住院、經(jīng)癡呆分級(jí)評(píng)定量表（CDR）判定為無癡呆的18名志愿者為正常對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：①近3個(gè)月內(nèi)有新發(fā)心肌梗死、外周血管栓塞、外傷、手術(shù)事件者;②未獲控制的內(nèi)科疾病如中樞或外周感染、嚴(yán)重高血壓病、全身代謝紊亂等;③腦梗死、抑郁癥、藥物濫用所致的認(rèn)知功能下降。本研究已經(jīng)征得入組者及其家屬或代理者的知情同意。

二、研究方法

1. 臨床資料的收集

收集所有受試者的病歷資料，記錄性別、年齡，是否合并高血壓病、糖尿病、冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟?。ü谛牟。⒏咧Y，以及頭顱影像學(xué)等資料，并采集受試者空腹血糖、總膽固醇、LDL-C等血液學(xué)檢查資料。符合入組標(biāo)準(zhǔn)的受試者以肝素抗凝管于清晨空腹采集外周靜脈血15 ml用于EPC的相關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。

2. 量表評(píng)價(jià)

采用CDR對(duì)受試者本人及其照料知情者進(jìn)行訪談[6-7]。采集其關(guān)于記憶、定向、判斷解決問題能力、社會(huì)事務(wù)、家務(wù)及業(yè)余愛好、個(gè)人自理6個(gè)方面的資料，將受試者分為無癡呆、輕度癡呆、中度癡呆、重度癡呆共4組。量表評(píng)估均由經(jīng)過癡呆相關(guān)量表培訓(xùn)且有多年癡呆診治經(jīng)驗(yàn)的神經(jīng)內(nèi)科醫(yī)師完成。

3. 人外周血 EPC 的分離和培養(yǎng)

Ficoll密度梯度離心法提取外周血單個(gè)核細(xì)胞：取外周靜脈血，用等體積磷酸鹽緩沖液（PBS）稀釋后，小心加入至含人淋巴細(xì)胞分離液的離心管上層，2000轉(zhuǎn)/分離心15 min，用玻璃吸管小心吸取中層白色霧狀的單個(gè)核細(xì)胞層，PBS 洗滌2次后，離心10 min 獲取單核細(xì)胞，將單核細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的 EPC 全培養(yǎng)基，置37℃，每 4 d換液1次，培養(yǎng)1周。

4. 流式細(xì)胞儀測(cè)定外周血 EPC 數(shù)量

取200 ?l外周血，依次加入胎肝激酶-1（FLK-1）流式細(xì)胞熒光抗體一抗、FLK-1二抗、CD34流式細(xì)胞熒光抗體分別進(jìn)行孵育各20 min。加入2 ml紅細(xì)胞裂解液，梯度離心5 min，棄上清后再次離

心4 min，剩余細(xì)胞以2%多聚甲醛固定，以流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34/KDR雙陽性細(xì)胞即EPC的數(shù)量。

5. EPC遷移功能檢測(cè)

在避光培養(yǎng)的EPC板中加入10 μl活細(xì)胞染色劑 CM-Dil及2.5 ml EBM-2內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱中放置5 min后，棄EBM-2，加入 0.25%胰蛋白酶消化6 min，棄上清，PBS清洗2次;加入EBM-2 400 μl重懸已染CM-Dil的EPC，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，統(tǒng)一數(shù)量為1×104/ml;將其加入Transwell 上室，懸浮在500 μl DMEM培養(yǎng)液的下室之上，培養(yǎng)24 h后，輕擦掉上室膜上未遷移的細(xì)胞，隨機(jī)選取5個(gè)顯微鏡200倍視野，計(jì)數(shù)遷移的細(xì)胞并取平均值。

6. EPC黏附功能檢測(cè)

將EPC傳代于6孔板48 h后，棄培養(yǎng)基，以PBS洗2次，加入500 μl DAPI熒光染料孵育5 min，棄DAPI，PBS清洗2次后，將CM-Dil標(biāo)記的同等數(shù)目 2 ml EPC懸液加入其中，37℃孵育3 h，然后吸去培養(yǎng)液，以2 ml 4% PFA固定液處理10 min，采集5個(gè)顯微鏡200倍視野，計(jì)數(shù)貼壁細(xì)胞并取平均值。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)均使用SPSS 19.0處理。對(duì)計(jì)量資料先行正態(tài)性（K-S）檢驗(yàn)，正態(tài)分布計(jì)量資料用描述，多組比較用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。α= 0.05。

結(jié)果

一、無癡呆組、輕度癡呆組、中度癡呆組和重度癡呆組的一般資料比較

4組的年齡、性別構(gòu)成、BMI、血壓、血糖 、血脂等比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05），見表1。

二、無癡呆組、輕度癡呆組、中度癡呆組和重度癡呆組的外周血EPC數(shù)量比較

4組外周血EPC數(shù)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 2.163，P > 0.05），見圖1。

三、無癡呆組、輕度癡呆組、中度癡呆組和重度癡呆組的外周血EPC遷移功能比較

4組外周血EPC遷移功能比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 17.220，P < 0.001）。其中，輕度癡呆組EPC遷移功能低于無癡呆組，中度癡呆組外周血EPC遷移功能低于無癡呆組及輕度癡呆組，重度癡呆組外周血EPC遷移功能低于無癡呆組及輕度癡呆組（P均< 0.05），中度癡呆組與重度癡呆組外周血EPC遷移功能比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見圖2。

四、無癡呆組、輕度癡呆組、中度癡呆組和重度癡呆組的外周血EPC黏附功能比較

4組間外周血EPC黏附功能比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F = 11.869，P < 0.001）。重度癡呆組EPC黏附功能低于其他3組，中度癡呆組高于重度癡呆組但低于無癡呆組和輕度癡呆組（P均< 0.05）;無癡呆組與輕度癡呆組間外周血EPC黏附功能比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），見圖3。

討論

AD是一種以老年斑形成、神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理表現(xiàn)的神經(jīng)變性疾病。近年越來越多的研究支持血管機(jī)制在AD發(fā)生發(fā)展中的重要作用，且血管機(jī)制與變性機(jī)制、遺傳背景等交錯(cuò)可能促進(jìn)了AD的發(fā)生發(fā)展。流行病學(xué)和病理學(xué)研究表明，腦血管病變?nèi)鐒?dòng)脈粥樣硬化和AD之間存在著一定的聯(lián)系和重疊，例如嚴(yán)重動(dòng)脈粥樣硬化患者發(fā)生AD或血管性癡呆的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加[9]。神經(jīng)病理學(xué)研究表明，高達(dá)80%的AD患者有血管病變，如腦動(dòng)脈的微梗死和動(dòng)脈粥樣硬化，AD患者存在腦血流量和腦血管反應(yīng)性的降低[10]。有學(xué)者在AD患者的組織切片中觀察到ApoE-C1q復(fù)合物，并指出動(dòng)脈粥樣硬化可能損害腦血流和神經(jīng)-血管偶合導(dǎo)致腦血管功能障礙，從而導(dǎo)致認(rèn)知功能下降[11]。探討AD的血管機(jī)制以及其可能存在的保護(hù)因素有助于尋找新的預(yù)防及治療策略，延緩AD的進(jìn)展。

骨髓來源的EPC在病理狀態(tài)下，參與內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)，在組織修復(fù)和血管新生中發(fā)揮著重要的作用[12]。本研究顯示，無癡呆組、輕度癡呆組、中度癡呆組和重度癡呆組的EPC數(shù)量相近。Breining等[13]對(duì)癡呆患者內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行研究，同樣也沒有發(fā)現(xiàn)EPC數(shù)量上的差異，與本研究類似。但也有研究曾發(fā)現(xiàn)AD患者EPC數(shù)量的下降，其研究結(jié)果不一致，一方面可能是源于受試者年齡的差異（本研究平均年齡較大），另一方面單純EPC的數(shù)量可能的確并不能作為預(yù)測(cè)癡呆發(fā)生或其嚴(yán)重程度的指標(biāo)，因EPC由骨髓細(xì)胞分泌至外周血后需要?dú)w巢至受損內(nèi)皮細(xì)胞或血管外組織進(jìn)一步分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞等才可發(fā)揮作用[14-15]。因此EPC功能學(xué)上的研究可能比單純數(shù)量上的研究更有意義，因此本研究進(jìn)一步在EPC的功能學(xué)差異上進(jìn)行了探討。

進(jìn)一步研究顯示，中度癡呆組和重度癡呆組外周血EPC遷移和黏附功能均較無癡呆組及輕度癡呆組下降，提示中重度癡呆患者血管內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，且血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的下降可能參與了癡呆的發(fā)生發(fā)展。EPC功能下降導(dǎo)致腦血管內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力下降，腦血管內(nèi)皮細(xì)胞可調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境中淀粉樣蛋白的水平，內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙可影響血腦屏障的通透性，導(dǎo)致淀粉樣蛋白等物質(zhì)向腦的滲透性增加，造成神經(jīng)元毒性損傷，從而加重了AD的發(fā)生、發(fā)展。EPC可抑制海馬淀粉樣β蛋白（Aβ）、淀粉樣前體蛋白的升高，減輕淀粉樣斑塊的沉積和相關(guān)的組織病理學(xué)改變，有助改善記憶缺陷和AD樣病理功能障礙[16]。Zhang等[17]研究顯示，上調(diào)EPC功能可改善小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能，EPC可以升高緊密連接蛋白的表達(dá)，修復(fù)血腦緊密連接功能，刺激血管生成，促進(jìn)Aβ清除，減少神經(jīng)元丟失，最終改善認(rèn)知功能。

本研究尚存在需進(jìn)一步探討之處，譬如是何原因?qū)е虏煌潭劝V呆患者EPC功能的不一致性，其潛在的誘導(dǎo)或趨化因子的差異在何處。對(duì)于AD治療領(lǐng)域，單純提高EPC水平可能無法帶來下游的獲益，如何改善EPC的功能才是關(guān)鍵所在，這對(duì)于目前AD血管機(jī)制研究以及干預(yù)策略制定帶來了新的啟發(fā)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2020-03-03）

（本文編輯：林燕薇）