高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法測(cè)定茵陳蒿散中的梔子苷

林仙軍，王 彬，陳曉林

(浙江省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江 杭州 311101)

茵陳蒿散由茵陳、梔子和大黃通過(guò)粉碎、過(guò)篩、混合制得，處方的量分別是茵陳120 g、梔子60 g和大黃45 g。該散劑為淺棕黃色的粉末，氣微香，味微苦。具有清熱利尿[1]、解毒退黃[2]、清肝利膽[3]的作用，臨床主要用于治療濕熱黃疸[4-5]。該品種質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國(guó)獸藥典》2015年版二部[6]，采用顯微法對(duì)茵陳、梔子和大黃進(jìn)行鑒別。采用薄層色譜法分別鑒別大黃和梔子[7]，用到乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、丙酮、甲酸乙酯等溶劑，環(huán)境污染嚴(yán)重，操作繁瑣。梔子是茵陳蒿散的臣藥，梔子苷是梔子的主要有效成分之一，具有瀉火除濕、清熱利尿[8]、涼血解毒[9]、保肝利膽[10]、抗氧化[11]、抗炎鎮(zhèn)痛、降血壓等作用[12]。采用標(biāo)準(zhǔn)未對(duì)梔子苷進(jìn)行定量檢測(cè)，不能全面評(píng)價(jià)藥物，質(zhì)量控制方法不完善。

高效液相色譜法快捷、準(zhǔn)確、靈敏度高，定性和定量均準(zhǔn)確。尤以高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-DAD)結(jié)合了光譜掃描和數(shù)據(jù)庫(kù)功能，定性更準(zhǔn)確，在獸藥檢驗(yàn)中將發(fā)揮越來(lái)越大的作用。本試驗(yàn)采用HPLC-DAD法對(duì)茵陳蒿散中的梔子苷檢測(cè)的方法進(jìn)行了研究，為茵陳蒿散質(zhì)量控制提供數(shù)據(jù)。

1 儀器與材料

1.1儀器 高效液相色譜儀，Agilent 1260，配Agilent 1260 Infinity G4212A型DAD檢測(cè)器；XS205電子天平(Mettler公司)；DELTA320 pH計(jì)(Mettler公司)；KQ-500E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試劑與材料 乙腈為色譜純，甲醇、磷酸、鹽酸、氫氧化鈉、30%雙氧水均為分析純;實(shí)驗(yàn)用水為milli-Q超純水。梔子苷對(duì)照品，來(lái)源中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)110749-201115，含量99.7%。茵陳蒿散，來(lái)源浙江博信藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為20181001、20181002和20181003；來(lái)源杭州愛(ài)力邁動(dòng)物藥業(yè)有限公司，批號(hào)為T(mén)191001、T191002和T191003。

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的配制 取梔子苷對(duì)照品7.00 mg，置50 mL量瓶中，加水適量，超聲處理使溶解并稀釋至刻度，搖勻制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.2供試品溶液的配制 精密稱(chēng)取供試品約0.5 g于100 mL量瓶中，水適量，超聲處理20 min，用水稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm濾膜濾過(guò)，作為供試品溶液。

2.3色譜條件 采用Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相：0.05%磷酸溶液(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速為1.0 mL/min，用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行掃描，掃描范圍為200～400 nm，記錄240 nm波長(zhǎng)處的色譜圖。該色譜條件下梔子苷色譜峰良好。對(duì)照品溶液色譜圖見(jiàn)圖1，對(duì)照品溶液光譜圖見(jiàn)圖2；供試品溶液(T191101)色譜圖見(jiàn)圖3，供試品溶液(T191101)中梔子苷光譜圖見(jiàn)圖4。

圖1 梔子苷對(duì)照品溶液色譜圖

圖2 梔子苷對(duì)照品溶液光譜圖

圖3 茵陳蒿散(T191101)色譜圖

圖4 茵陳蒿散(T191101)中梔子苷光譜圖

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序表

2.4方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍考察 精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用水稀釋2倍、5倍、10倍、20倍和50倍。制成相應(yīng)濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，從低濃度到高濃度依次進(jìn)樣分析，以濃度(X)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程和相關(guān)系數(shù)，2.790～139.6 μg/mL，Y=11.55526X-10.36225，相關(guān)系數(shù)為0.99989。

2.4.2精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為T(mén)191101茵陳蒿散供試品溶液，按上述色譜條件重復(fù)連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)得梔子苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%。表明此方法的儀器精密度符合要求。

2.4.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為T(mén)191101茵陳蒿散供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、6 h、12 h和24 h進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得梔子苷峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.7%。表明供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.4.4方法專(zhuān)屬性 取T191101茵陳蒿散各0.5 g，置10 mL量瓶中，分別加1 mol/L鹽酸溶液、1 mol/L氫氧化鈉溶液和5%過(guò)氧化氫溶液各1 mL，放置1 h，用50%甲醇溶液定容，依法測(cè)定。梔子苷在鹽酸溶液和過(guò)氧化氫溶液均穩(wěn)定，峰面積減少在3%以內(nèi)；在氫氧化鈉溶液中，峰面積減少約50%。

2.4.5加樣回收率試驗(yàn) 取梔子苷適量，加甲醇1 mg，配制成約每毫升的加樣回收率試驗(yàn)溶液。另取批號(hào)為T(mén)191101的茵陳蒿散樣品6份，各0.25 g，分別精密加入加樣回收率試驗(yàn)溶液各2.5 mL，置100 mL量瓶中，按照2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下條件檢測(cè)，結(jié)果扣除茵陳蒿散樣品原有梔子苷的量，計(jì)算平均回收率為98.9%，RSD為1.2%。

2.4.6實(shí)際樣品的測(cè)定 取批號(hào)為T(mén)191101、T191102、T191103、20181001、20181002和20181003的茵陳蒿散3個(gè)平行，各0.5 g，按照2.2項(xiàng)下方法配制供試品溶液，依法檢測(cè)，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算梔子苷含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品中含量測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1提取溶劑的選擇 梔子苷易溶于水，溶于乙醇、甲醇，不溶于石油醚。本試驗(yàn)選擇了水、甲醇、50%甲醇、50%乙醇和50%乙腈超聲20 min超聲提取，結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中序號(hào)1、2、3、4、5分別對(duì)應(yīng)以上5種提取溶劑，梔子苷在50%甲醇、水、50%乙醇和50%乙腈中提取效率均較好，在純甲醇中提取效率較差。50%乙腈提取后，峰型較差。50%乙醇和50%甲醇提取雜質(zhì)稍微多一些。因此，綜合考慮，選擇水作為茵陳蒿散供試品的提取溶劑。在這基礎(chǔ)上，進(jìn)行超聲時(shí)間的確認(rèn)，試驗(yàn)分別超聲5 min、10 min、15 min和20 min，結(jié)果檢測(cè)出梔子苷的含量分別是12.25 mg/g、12.28 mg/g、12.35 mg/g和12.37 mg/g，表明梔子苷在水中超聲非常容易溶解，5 min以后無(wú)顯著差異。因此，為了確保提取充分，選擇超聲時(shí)間為10 min。

圖5 提取溶劑對(duì)含量的影響

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 本試驗(yàn)采用二極管陳列檢測(cè)器對(duì)梔子苷進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梔子苷在240 nm波長(zhǎng)有最大吸收，綜合考慮，梔子苷的響應(yīng)及雜質(zhì)干擾因素，選擇240 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相的選擇 考察了乙腈與0.01%磷酸溶液、0.05%磷酸溶液、0.2%磷酸溶液和0.4%磷酸溶液作為流動(dòng)相，各流動(dòng)相保留時(shí)間和峰形一致，而乙腈-0.4%磷酸溶液pH值為1.5，乙腈-0.2%磷酸溶液pH值為1.7，pH值小于2.0對(duì)色譜柱損害較大；而乙腈-0.05%磷酸溶液pH值為2.3左右。因此，選擇0.05%磷酸溶液-乙腈作為流動(dòng)相，調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例，梔子苷和其他組分分離度達(dá)到1.5，保留時(shí)間比較合適，確定梯度洗脫程序。

3.4定性定量 供試品溶液色譜圖中如出現(xiàn)和梔子苷對(duì)照品溶液色譜圖中保留時(shí)間一致的色譜峰，保留時(shí)間差異不大于±5%，且為單一物質(zhì)峰；在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，兩者紫外光譜圖匹配，且最大吸收波長(zhǎng)一致，差異不大于±2 nm，則判定為檢出梔子苷。

3.5小結(jié) 本文采用HPLC-DAD法對(duì)茵陳蒿散中梔子苷進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)提取溶劑、提取方式、檢測(cè)波長(zhǎng)、專(zhuān)屬性和色譜條件等進(jìn)行研究，方法定性定量準(zhǔn)確，適用于茵陳蒿散中梔子苷的含量檢測(cè)。