基于生物阻抗譜的細胞電學特性研究*

姚佳烽 萬建芬 楊璐 劉凱 陳柏 吳洪濤

(南京航空航天大學機電學院, 南京 210016)

1 引 言

免疫細胞化學法[1]、流式細胞術(shù)[2]以及核酸檢測法[3]是細胞生理、病理分析中常用的方式, 但是這些方法存在檢測速度慢、需要標記等問題. 生物阻抗譜(biological impedance spectroscopy, BIS)方法是一種利用生物組織的電阻抗特性提取相應生理、病理信息的檢測技術(shù)[4], 該方法通過對被測物體施加幅值較小的交流激勵, 使用掃頻的方式測量每種頻率下檢測目標對應的阻抗值[5]. BIS 技術(shù)通過交流電阻抗技術(shù)檢測生物細胞的電導率和介電常數(shù), 并引入電介質(zhì)物理模型的數(shù)值計算, 獲得細胞外液、細胞膜和細胞質(zhì)的電學信息, 由此來區(qū)分不同種類的細胞[6]. 生物細胞作為非均勻結(jié)構(gòu)(細胞外、細胞膜和細胞質(zhì)), 其電學特性具有異質(zhì)性. 當交流電場作用于細胞時, 細胞的介電響應出現(xiàn)a 色散和b 色散的弛豫現(xiàn)象[7], 可以利用該弛豫現(xiàn)象對細胞的不同結(jié)構(gòu)特征進行檢測識別. 因此,BIS 成為研究細胞結(jié)構(gòu)特性及細胞分類識別的一種新方式.

BIS 方法具有操作簡單、信息豐富等特點, 國內(nèi)外已經(jīng)有大量學者在BIS 的細胞檢測方面做了大量研究. 1989 年Hodgkin 和Huxley[8]根據(jù)細胞膜選擇通透性的特點, 提出了細胞膜等效電路模型, 而后1983 年Kanai 等[9]結(jié)合細胞膜、細胞質(zhì)、細胞外液等特性建立起單細胞等效電路模型.2014 年寧波大學方云等[10]建立了細胞單殼模型,對肝癌細胞電阻抗特性的頻響特性進行分析, 采用生物阻抗譜、Bode 圖和Nyquist 圖觀察了細胞體積分數(shù)對肝癌細胞電阻抗特性的影響. 2010 年空軍軍醫(yī)大學王威等[11]根據(jù)相關文獻建立橢圓細胞模型, 用于COMSOL 仿真來研究細胞變形引起的阻抗變化. 2016 年Nahin Amin 等[12]通過建立細胞模型以及等效電路得出細胞尺寸、膜厚以及內(nèi)部細胞核的大小和細胞質(zhì)的密度對阻抗的影響, 同時提出采用混合電極法以消除測量時接觸阻抗的影響. 2010 年Sun 等[13]建立了細胞的單殼模型, 通過調(diào)整細胞膜及細胞質(zhì)等結(jié)構(gòu)的變化參數(shù)對單細胞的生物阻抗譜進行了數(shù)值分析, 探索了細胞在不同生長階段的電學特性規(guī)律. 2015 年Guo 等[14]提出一款可降低接觸阻抗的微流控芯片用以單細胞阻抗測量, 而后通過對該芯片獲得阻抗數(shù)據(jù)分析獲取細胞的電學特性. 2016 年東南大學Zhu 等[15]利用有限元建模方式研究微流控BIS 的幾何相關傳感特性.

目前大多數(shù)學者普遍采用建立等效電路模型擬合的方式獲得所測物體的各個成分的電學特性(導電率、介電常數(shù)), 這種方式獲得細胞的電學特性是可行的, 但在解釋細胞結(jié)構(gòu)所引起的電阻抗變化的內(nèi)在機理方面仍然存在局限性. 因此, 本文采用數(shù)值仿真的方法對細胞引起的電阻抗變化的內(nèi)在機理進行分析, 研究細胞內(nèi)在結(jié)構(gòu)與其電學特性之間的關系. 首先, 建立雙殼模型(two shell model, TS)[16,17]、單殼模型(single shell model, SS)[18]以及無殼模型, 作為細胞的仿真模型. 其次, 基于電學仿真理論, 研究細胞各組成成分結(jié)構(gòu)的變化對其電阻抗的影響. 最后, 使用20%不同活性的酵母菌進行實驗, 對仿真結(jié)果進行驗證.

2 仿真模型與理論

2.1 仿真模型

為研究細胞各結(jié)構(gòu)對阻抗譜的影響, 建立多種不同結(jié)構(gòu)、尺寸的細胞模型. 包括TS 模型(圖1(a))、SS 模 型(圖1(b))、“無 殼 模 型(no shell model,NS)”(圖1(c)). 由于大部分細胞內(nèi)部都具有細胞核, TS 模型即是考慮細胞核的情況下建立的細胞模型; 成熟的紅細胞(內(nèi)部無細胞器、細胞核)這類細胞則不需考慮細胞核的影響而建立起SS 模型,通過建立的TS, SS 模型的比較, 還可以很好地反映出細胞核的大小對生物阻抗的影響; NS 模型則是為了與SS 模型進行比較以研究細胞膜對生物阻抗譜的影響而建立的細胞模型.

采用不同細胞半徑(正常B 細胞R1= 3.3 μm,癌B 細胞R1= 5.2 μm)[19]以及細胞核半徑(正常B 細胞R2= 2.8 μm, 癌B 細胞R2= 4.4 μm)的方式模擬正常細胞和癌細胞兩種類別. 基于SS 模型將膜的雙層框架改為單層以模擬“無膜”狀態(tài), 并將此模型與SS 模型進行對比以分析細胞膜對阻抗譜的影響. 細胞核的半徑分別定為R2= 2.8, 1.9,1.5 μm 以及R2= 0 以探索細胞核對電阻抗的影響. 本文設定仿真區(qū)域(L×L= 20 μm × 20 μm),其中測量電極(l= 4 μm)對稱地放置在仿真邊界的兩側(cè), 如圖1(d)和圖1(e)所示.

2.2 仿真理論

本文基于Maxwell 理論進行有限元仿真, 忽略電極與細胞外液間的界面極化以及外界噪聲和電磁影響, 仿真中滿足如下公式[20,21]:

式中J(A/m2)為全電流密度,E(V/m)為場強,j(V)為 電 勢,σ(S/m)為 導 電 率,,ω(Hz)為角頻率,D(C/m2)為電位移矢量. 根據(jù)Maxwell-Wager 理論, 細胞的復介電常數(shù)按如下公式表示[22]:

圖1 仿真模型 (a)?(c)細胞模型; (d), (e)仿真區(qū)域模型Fig. 1. Simulation model (a)?(c) Model of cell; (d), (e) model of simulation area.

根據(jù)(4)式—(7)式, 在仿真過程中選定細胞各結(jié)構(gòu)電學特性參數(shù), 如表1 所列. 根據(jù)BIS 測量原理, 在有限元仿真中還需選定相應的掃描頻率及掃描點來完成對細胞的仿真檢測. 本研究中使用的激勵源賦值為1 mA, 頻域范圍f為4 Hz—1 GHz.

表1 正常B 細胞及病變B 細胞的仿真參數(shù)Table 1. Simulation parameters of normal and malignant (farage) onsillar B-cells[19].

3 仿真結(jié)果

3.1 細胞種類與細胞電學特性

目前典型的三類細胞有: 正常細胞(有細胞核、細胞器)、成熟紅細胞(無細胞核、無細胞器)和腫瘤細胞(尺寸較大、表面粗糙). 為研究不同種類細胞的電學特性差異, 本文以B 細胞各結(jié)構(gòu)成分為研究基礎, 建立無核細胞(圖1(b))、帶核細胞(圖1(a))以及細胞半徑、細胞核半徑有所增大的癌細胞模型進行仿真研究, 通過研究這三類細胞電學特性參數(shù)對生物阻抗譜的影響, 獲得細胞類別與其電學特性之間的內(nèi)在機理.

由于在低頻時細胞膜呈現(xiàn)高阻值狀態(tài), 因此從圖2(a) (1-1), (2-1), (3-1)可看出在f= 10.5 kHz時, 電場線均繞過細胞從細胞外液中流過. 由圖2(a)可看出細胞內(nèi)的電勢隨頻率的增加而升高. 頻率f= 3 MHz 時, 圖2(a)中的(1-2), (2-2), (3-2)中細胞內(nèi)有大量的電場線流過, 細胞內(nèi)同位置的電勢j1-2

圖2 不同細胞的仿真結(jié)果及Cole-Cole Plot (a)不同細胞在不同頻率下的仿真結(jié)果; (b)不同細胞的Cole-Cole PlotFig. 2. Simulation results of different cells and Cole-Cole Plot: (a) Simulation results of different frequencies of different cells; (b) Cole-Cole Plot of different cells.

由圖2(b)可看出這三類細胞Cole-Cole Plot都有兩個半圓弧. 但是在低頻段(4 Hz—3 MHz)有較大的區(qū)別: 癌細胞在該頻段的圓弧面積明顯大于無核細胞與有核細胞的圓弧面積, 并且在該頻段癌細胞的馳豫頻率f1 C= 7.08545 × 105Hz, 無核與帶核的馳豫頻率f1N= f1W= 1.251258 × 106Hz.高頻段(3 MHz—1 GHz)三類細胞的圓弧曲線基本重合, 細胞的馳豫頻域f2N= f2W= f2C= 1.3687× 108Hz.

由此可得出以下結(jié)論: 1)細胞半徑越大(正常細胞R1= 3.3 μm, 癌細胞R1= 5.2 μm)則低頻段的馳豫頻率越低; 2)細胞膜導電率越高(正常細胞導電率s = 5.6 × 10–5S/m, 癌細胞s = 9.1 ×10–6S/m)則低頻段的Cole-Cole Plot 的面積越小.因此, 細胞結(jié)構(gòu)尺寸的變化引起細胞電學特性的改變, 依據(jù)細胞電學特性能夠準確地進行細胞分類.

3.2 細胞膜對細胞電學特性的影響

由圖2(b)中Cole-Cole 圖可看出三類細胞在都呈現(xiàn)出兩個半圓弧, 這也就意味著細胞產(chǎn)生了兩種介電弛豫. 因此為了探索這兩種介電弛豫產(chǎn)生的內(nèi)在機理, 本文基于SS 模型, 對其進行仿真分析.

圖3(a)細胞內(nèi)的電勢隨頻率的升高逐漸增大,由于細胞膜具有低頻高阻抗性, 因此在頻率f =10.5 kHz 時, 圖3(a) (1-1)細胞內(nèi)基本無電場線穿過, 而(2-1) 細胞內(nèi)已經(jīng)有大量的電場線穿過; f =3 MHz 時, 細胞膜的阻抗降低, 圖3(a) (1-2) 細胞內(nèi)有電場線通過, 且細胞內(nèi)同位置的電勢與圖3(a)(2-2)近似相等. f = 1 GHz 時, 細胞已經(jīng)完全被擊穿, 此時的細胞已經(jīng)處于完全導通狀態(tài). 圖3(b)中SS 模型有無膜在Cole-Cole Plot 已經(jīng)有很大的區(qū)分: 有膜的SS 細胞模型依舊在Cole-Cole 圖上呈現(xiàn)出高頻低頻兩個半圓弧, 而無膜的SS 細胞模型在Cole-Cole 圖上只剩下一個大半圓弧且與有膜狀態(tài)下的大半圓弧重合.

由于“無膜”狀態(tài)下的SS 細胞模型內(nèi)部只有細胞質(zhì)的存在, 因此, 得出以下結(jié)論: 1)無核無膜下Cole-Cole 圖中的高頻圓弧為細胞質(zhì)與細胞外液的離子極化引起的; 2)有膜無核細胞較無膜細胞多出的小半圓弧為細胞外液與細胞膜的界面極化引起的.

圖3 無核細胞在有無膜下的仿真結(jié)果 (a)不同頻率下無核細胞的仿真結(jié)果; (b)仿真結(jié)果對應的Cole-Cole PlotFig. 3. Simulation results of no-nuclear cells with or without membrane: (a) Simulation results of non-nucleated cells with different frequencies; (b) the Cole-Cole Plot corresponding to the simulation results.

3.3 細胞核對細胞電學特性的影響

如2.1 節(jié)所述, 目前大多數(shù)研究者普遍認同只考慮細胞膜結(jié)構(gòu)的SS 模型, 這說明細胞核及其他細胞器對阻抗譜分析無影響. 但是在圖2(b)中可看出無核細胞模型與帶核細胞模型在低頻處的小半圓弧還是有所差距, 這說明細胞內(nèi)部的細胞核會對細胞的阻抗造成影響. 因此, 為了探索細胞核的影響, 本文采用TS 模型探索其影響因素.

仿真采用的TS 細胞模型的核徑分別為R2=2.8 μm, R2= 1.9 μm, R2= 1.5 μm, R2= 0 (即無核). 首先在它們都帶有細胞膜的情況下對其進行仿真分析, 而后去膜仿真加以驗證.

圖4 不同核徑細胞的仿真結(jié)果 (a)不同頻率下的仿真結(jié)果; (b), (c)相應的Cole-Cole 圖Fig. 4. Simulation results of cells with different nuclear radius: (a) Simulation results of cells at different frequencies; (b), (c) Cole-Cole Plot of different nuclear radius.

頻率f = 10.5 KHz 時, 由于在該頻率下細胞膜呈現(xiàn)出高阻態(tài), 電流未進入細胞內(nèi), 因此圖4(a)中的(1-1), (2-1), (3-1), (4-1)無明顯區(qū)別, 細胞核對其無影響. 在相同頻率下, 圖4(a)無膜狀態(tài)下的(1-4), (2-4), (3-4), (4-4)呈現(xiàn)較大的不同, 細胞內(nèi)同一位置的電勢隨細胞核半徑的減小而逐漸增加, 這表明細胞在無膜狀態(tài)下核半徑越大阻值越大. 在f= 3 MHz 時, 雖然圖4(a)中(1-2), (2-2),(3-2), (4-2)中已經(jīng)有電場線通過, 但是在細胞內(nèi)同位置的電勢j1-2

圖4(b)顯示, 在低頻處的小半圓弧在不同細胞核半徑下, 先是基本重和而后出現(xiàn)核徑R2= 2.8 μm時阻抗值 大于R2= 1.9 μm 的阻抗值, 并且后者的阻抗值與R2= 1.5 μm 和R2= 0 時近似相同.在圖4(c)中不考慮細胞膜的影響時, 同樣在低頻處R2= 2.8 μm,R2= 1.9 μm,R2= 1.5 μm,R2= 0 對應的小半圓弧先分散而后逐漸與高頻處的大圓弧基本重合. 由此, 可判斷并驗證在低頻小半圓弧出現(xiàn)的分散是由細胞核半徑大小引起.

此外, 由圖4(b)和圖4(c)可看出, 在細胞核半徑R2= 1.9 μm,R2=1.5 μm,R2= 0 時的阻抗基本相等, 由此看出當細胞核半徑R2≤ 1.9 μm時可將細胞核的影響忽略. 細胞核質(zhì)比計算公式為:

其中Vn為細胞核的體積,Vcell為細胞體積,Vc為細胞質(zhì)體積. 計算可知此時細胞核質(zhì)比約為1∶4,且當細胞的核質(zhì)比小于0.25 時可忽略其影響. 正常細胞的核質(zhì)比為1∶4—6, 因此學者普遍將細胞內(nèi)核以及其他細胞器忽略視為單殼模型(SS).

4 實驗與驗證

4.1 實驗設備

本實驗以酵母懸液為被測對象. 圖5 給出了實驗設備原理圖: 一臺PC 機、一臺阻抗分析儀(IM7581)、一個四端開爾文卡子、一個降噪屏蔽和一個小試管. 試管是一個方柱狀容器, 長dc=10 mm, 寬wc= 2 mm, 高hc= 20 mm. 測量電極由對側(cè)平行的一對金屬板組成, 面積為A=20 mm×10 mm. 將小試管置于降噪罩中進行測量,隔離環(huán)境中的電磁干擾. 小試管通過一個四端開爾文卡子連接到阻抗分析儀上. 阻抗分析儀捕獲探頭發(fā)出的信號后, 將測量數(shù)據(jù)傳輸給PC 機進行后續(xù)的擬合. 測量頻率范圍為f= 100 kHz—300 MHz,測量點數(shù)量為1500 個. 提取20%體積分數(shù)的死活酵母懸浮液的阻抗信息, 并作出相應的Cole-Cole 圖.

4.2 實驗結(jié)果

圖6(a)給出了實驗中酵母的顯微結(jié)構(gòu)及模型圖. 其中將酵母菌粉置于37 ℃ ± 2 ℃的溫水中浸泡30 min, 獲得活酵母菌, 死酵母菌則在70 ℃± 2 ℃的熱水中浸泡30 min 獲取. 可以看出, 活酵母菌的細胞膜光滑平整, 而死酵母菌的細胞膜出現(xiàn)收縮皺裂, 由此可知酵母菌經(jīng)熱水處理后細胞膜已完全被破壞, 處于“無膜”狀態(tài). 由圖6(b)可看出, 20%活酵母菌在Cole-Cole 圖中顯示出大小兩個半圓弧, 而經(jīng)過熱水處理后的同體積分數(shù)的酵母菌在Cole-Cole 圖只有一個半圓弧, 且該半圓弧處于高頻段. 圖6(b)中兩個樣品的Cole-Cole 圖對應比較, 可推斷出死酵母菌(無膜)在此時呈現(xiàn)的圓弧即為細胞質(zhì)與細胞外液形成的介電馳豫, 而活酵母菌低頻段出現(xiàn)的小圓弧正是細胞膜與細胞外液間極化形成的介電馳豫. 在忽略阻抗值大小后, 可看出圖6(b)中 Cole-Cole 圖的基本趨勢與圖3 (b)無核細胞的有無膜的Cole-Cole 圖基本趨勢一致.因此, 20%體積分數(shù)的酵母菌實驗驗證了3.2 節(jié)中的仿真內(nèi)容.

圖5 實驗設備Fig. 5. Experimental set-up.

圖6 實驗圖 (a)死活酵母菌實物與模型圖; (b)20%死活酵母菌Cole-Cole 圖Fig. 6. Experiment: (a) Object and model of dead and alive yeast; (b) Cole-Cole Plot of 20% dead and alive yeast.

圖3 (b)阻抗數(shù)值比圖6(b)中的數(shù)值小是由以下原因造成的: 1)實驗中使用的細胞外液為純水導電率s0e= 5.5 × 10–6S/m, 而仿真中使用的導電率s0i= 0.6 S/m, 這將導致仿真中所獲得的數(shù)據(jù)遠低于實驗的阻抗值; 2)實驗中的電極尺寸與待測區(qū)域的比值de為

其中l(wèi)為電極長,L為 測 量區(qū)域的邊長. 實驗中de= 14.14/550 = 0.026, 而仿真的de= 4/20 =0.2.de越小則壓降越嚴重, 這將會使得所測的阻抗數(shù)值偏大.

此外圖3(b)中無膜狀態(tài)下的大圓弧與有膜下的大圓弧基本重合, 而圖6(b)中的死酵母菌對應的圓弧與活酵母并未重合. 這是由于仿真中無膜細胞區(qū)域與外界區(qū)域已經(jīng)被劃開, 兩者之間不產(chǎn)生離子的流動(即導電率較為穩(wěn)定). 而實驗中, 酵母菌一旦失去活性, 細胞膜破裂, 細胞內(nèi)的離子無障礙地流向細胞外液中, 如圖6(a)所示, 從而導致細胞外液的導電率升高, 阻抗較低.

5 結(jié) 論

本文采用數(shù)值仿真的方式研究了單細胞電學特性與其結(jié)構(gòu)之間的關系, 并通過實驗進行驗證,得出以下四個結(jié)論.

1) 細胞結(jié)構(gòu)尺寸的變化引起細胞電學特性的改變, 依據(jù)細胞電學特性能夠準確進行細胞分類;

2) Cole-Cole 圖上高頻與低頻的兩個半圓弧分別是由細胞質(zhì)與細胞外液的離子極化、細胞膜與細胞外液之間的界面極化引起的;

3) 細胞核大小對測量阻抗的影響主要在低頻段, 是由細胞核與細胞內(nèi)液的界面極化引起的, 但當細胞核質(zhì)比小于0.25 時可忽略其影響;

4) 對20%不同活性的酵母菌進行實驗, 實驗結(jié)果和仿真結(jié)果一致, 驗證了Cole-Cole 圖中高頻與低頻兩個圓弧分別是由細胞質(zhì)或細胞外液的離子極化、細胞膜與細胞外液之間的界面極化引起的.

感謝西安理工大學劉夏移博士和日本千葉大學武居昌宏教授提供的技術(shù)支持.