基于單分子成像技術(shù)研究l-DNA 分子穿越微米通道端口的電動(dòng)力學(xué)特性*

王瓊 王凱歌 孟康康 孫聃 韓仝雨 高愛華

1) (西北大學(xué)光子學(xué)與光子技術(shù)研究所, 國(guó)家級(jí)光電技術(shù)與納米功能材料和應(yīng)用國(guó)際研究中心, 省部共建國(guó)家光電技術(shù)與功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 陜西省光電子技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 西安 710069)

2) (西北大學(xué)物理學(xué)院, 西安 710069)

1 引 言

微/納流控、微/納液滴等技術(shù)集合了物理、化學(xué)、生物、計(jì)算機(jī)及納米等前沿技術(shù), 用于生化分析與檢測(cè)[1?3]、醫(yī)療診斷[4,5]和食品安全[6]等重要領(lǐng)域, 能夠?qū)ξ⒘繕悠诽匦赃M(jìn)行精準(zhǔn)檢測(cè)分析. 將微納技術(shù)與可視化技術(shù)相結(jié)合, 在仿生環(huán)境中, 可對(duì)單個(gè)DNA 分子靈活操控、實(shí)時(shí)觀測(cè)研究其動(dòng)力學(xué)特性, 不但有助于揭示生命現(xiàn)象的基本規(guī)律, 而且在分子相互作用、納米孔基因測(cè)序、藥物輸運(yùn)及靶向治療等方面具有廣泛的應(yīng)用前景[7?9].

操控單個(gè)DNA 分子, 將其有效導(dǎo)入、引導(dǎo)其穿越微納通道是實(shí)現(xiàn)DNA 生物芯片眾多功能的必備條件. 通常, 將DNA 分子順利導(dǎo)入微通道的方法有: 流體力學(xué)進(jìn)樣[10](虹吸進(jìn)樣法、微通道端加壓法、微通道末端抽真空法)、擴(kuò)散進(jìn)樣[11]、電動(dòng)力進(jìn)樣以及電滲驅(qū)動(dòng)的流體進(jìn)樣[12]等方法. 流體力學(xué)進(jìn)樣法對(duì)所用設(shè)備有嚴(yán)格要求、裝置復(fù)雜、設(shè)備體積大、成本高, 同時(shí)不利于分析黏度較大的樣品; 擴(kuò)散進(jìn)樣法引導(dǎo)樣品進(jìn)入通道內(nèi)是被動(dòng)的、且難以控制; 而電動(dòng)力進(jìn)樣法相對(duì)容易控制,附加設(shè)備少、成本低, 在毛細(xì)管電泳分析中普遍采用.

目前, 電動(dòng)力進(jìn)樣法將DNA 分子導(dǎo)入微納通道仍存在尚未解決的關(guān)鍵問題. 例如, 隨著外加電場(chǎng)強(qiáng)度的改變, DNA 分子在管口附近的動(dòng)力學(xué)特性、速度分布以及DNA 本身的構(gòu)象變化等不明確[13,14]; 而且, 電場(chǎng)力引導(dǎo)DNA 分子進(jìn)入微納通道時(shí), 不斷有新現(xiàn)象、新問題被發(fā)現(xiàn).

Wang 等[15]曾利用可視化技術(shù)研究DNA 分子在微米通道內(nèi)的電動(dòng)力學(xué)特性, 發(fā)現(xiàn)DNA 分子從trans 端口進(jìn)入內(nèi)徑為30 μm 通道時(shí), 存在閾值電場(chǎng)強(qiáng)度.Yang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)DNA 分子在外電場(chǎng)力作用下穿越5 和10 μm 的通道時(shí), 其運(yùn)動(dòng)方向會(huì)發(fā)生反轉(zhuǎn), 并且, 微米通道管徑越小, DNA 分子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生反轉(zhuǎn)時(shí)的閾值電場(chǎng)強(qiáng)度越大. 最近, Jones 等[17]發(fā)明了一種微管收縮分選DNA 分子的裝置, 采用電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)DNA 分子運(yùn)動(dòng), 通過改變電壓的大小與頻率調(diào)控DNA 分子在通道出口處的偏轉(zhuǎn)方向, 成功實(shí)現(xiàn)了不同大小DNA 分子的篩選; 但是, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)一部分分離后的DNA 分子吸附在通道的管壁上, 非常不利于芯片的持久運(yùn)行.

本文利用單分子熒光成像可視化技術(shù), 實(shí)時(shí)觀察研究了l-DNA 分子在外加電場(chǎng)力作用下進(jìn)/出微米通道端口的電動(dòng)力學(xué)特性, 并基于微流體電動(dòng)力學(xué)理論, 對(duì)DNA 分子在進(jìn)入通道端口時(shí)的不同運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的物理機(jī)制進(jìn)行了初步分析.

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置如圖1 所示, 主要包括: 倒置熒光顯微 鏡(IX-70, 奧 林 巴 斯, 日 本); EMCCD 相 機(jī)(iXon+885, Andor, 美國(guó)); 石英玻璃圓形微米通道(邯鄲市鑫諾光纖色譜有限公司), 長(zhǎng)度為5 mm,直徑為50 μm; 鉑絲電極(上海捷昱電子科技有限公司); 外接高壓電源(PS 8000 2U, EPS, 德國(guó)).實(shí)驗(yàn)中, 電壓調(diào)節(jié)范圍為: 0—100 V. 圖像數(shù)據(jù)采集、分析處理均用Image 軟件(http://rsbweb.nih.gov/ij/). 整個(gè)實(shí)驗(yàn)在暗室中完成, 實(shí)驗(yàn)室溫度控制為25 ℃.

圖1 實(shí)驗(yàn)裝置示意圖Fig. 1. Schematic diagram of experimental set-up.

圖1所示為實(shí)驗(yàn)的裝置示意圖. 實(shí)驗(yàn)具體步驟: 1) 導(dǎo)入緩沖液, 在cis 端口處滴入10 μl 的緩沖液, 2 s 左右緩沖液將充滿整個(gè)微米通道; 2) 導(dǎo)入DNA 分 子, 將10 μl 濃 度 為0.455 mg/L 的DNA/YOYO-1 樣品溶液滴在trans 端口, 樣品通過毛細(xì)力作用進(jìn)入微通道內(nèi); 3) 待溶液處于穩(wěn)定狀態(tài), 調(diào)整電壓, 確定電場(chǎng)強(qiáng)度大小與方向.

實(shí)驗(yàn)中, EMCCD 實(shí)時(shí)記錄DNA 樣品進(jìn)入端口以及在微通道內(nèi)運(yùn)動(dòng)情況, 其曝光時(shí)間設(shè)定為100 ms, 拍攝間隔為100 ms, 每次連續(xù)拍攝持續(xù)為5 min; EMCCD一次可以連續(xù)拍 攝1000 張照片.

2.2 樣品液、微芯片的制備

實(shí)驗(yàn)使用的是l-DNA 分子(富酶泰斯生物技術(shù)公司, 深圳,中國(guó)), 用染料YOYO-1 分子進(jìn)行標(biāo)記. 為了保證最好的熒光效率, YOYO-1 染料分子插入l-DNA 分子的配置比例為DNA 堿基對(duì):YOYO-1 分子 = 10 : 1.

樣品溶液的制備過程如下所述: 1) 用移液槍移取100 μl 的Bis-tris (pH=8) 和1000 μl 的Tris-Hcl (pH = 8), 分別滴入標(biāo)記為A 和B 的牛角管中; 2) 取0.411 μl 的DNA 原 液 和0.1 μl 的YOYO-1 原液分別加入A 和B 中, 搖勻A 和B 中的兩種溶液使其充分混合, 置于暗室孵育30 min;3) 從B 中取200 μl 的YOYO-1 稀釋液加入A 中充分混合, 在暗 室 中 孵 育30 min. 最終得到DNA/YOYO-1的混合溶液,DNA濃度為0.455 mg/L, 儲(chǔ)藏在暗室中備用.

微通道芯片核心部分的制備, 簡(jiǎn)述如下: 1) 將經(jīng)過PLL(20)-g(3.6)-PEG 溶液改性后的實(shí)驗(yàn)用微米通道烘干; 2) 將聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)顆粒與氯仿溶液按照1∶1 進(jìn)行充分混合, 制備2 個(gè)樣品池, 10 mm × 10 mm × 3 mm, 它們中間通過微米通道進(jìn)行連接; 鉑絲電極正對(duì)微通道端口處;3) 將聚酰胺樹脂與環(huán)氧樹脂按1∶1 混合后均勻涂抹在樣品池的外圍, 以加固結(jié)構(gòu); 將芯片系統(tǒng)放入烤箱, 溫度60 ℃下烘烤兩小時(shí). 實(shí)驗(yàn)研究中, 為了避免DNA 分子被通道內(nèi)壁表面吸附, 采用改性液PLL(20)-PEG(2)-PEG(3.4)對(duì)微米通道內(nèi)壁進(jìn)行改性處理. 本文所涉及的緩沖液pH 值都大于3,當(dāng)溶液與二氧化硅通道壁面接觸時(shí), 其表面的硅烷醇(Si—OH)基團(tuán)因去質(zhì)子化而產(chǎn)生負(fù)電荷, 帶正電的PLL(多聚賴氨酸)通過靜電作用與去質(zhì)子化的硅烷醇基團(tuán)相結(jié)合, 吸附在通道壁面; 不帶電的親水性聚合物PEG(乙二醇), 有效阻止生物分子非特異性吸附到管道內(nèi)壁上[18], 從而可以有效減小管壁對(duì)DNA 吸附. 實(shí)驗(yàn)所用改性混合液PLL 與PEG 的質(zhì)量比 PLL∶PEG = 1∶3.6.

3 結(jié)果與分析

電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)DNA 分子進(jìn)入并穿越微米通道,影響DNA 分子在端口附近電動(dòng)力學(xué)特性的主要因素有: 電場(chǎng)強(qiáng)度的大小、DNA 分子大小、DNA分子在微通道端口的位置、微米通道的性質(zhì)、緩沖液的性質(zhì)(濃度/PH)以及實(shí)驗(yàn)溫度等條件. 本文主要研究電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)l-DNA 分子在50 μm通道端口處的電動(dòng)力學(xué)特性的影響.

3.1 DNA 分子順利穿越微米通道的電場(chǎng)強(qiáng)度閾值

微米通道兩端施加電壓, 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn): 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E < 1.875 × 103V·m–1時(shí), 距離trans 端口大約為100 μm 范圍內(nèi)的樣品池內(nèi)未捕捉到DNA 分子, 表明DNA 分子很難靠近trans 端口; 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E = 1.875 × 103V·m–1時(shí), 樣品池內(nèi)的DNA分子開始緩慢靠近trans 端口, 但未進(jìn)入trans 端口; 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度增大到E = 2.5 × 103V·m–1時(shí),DNA 分子開始進(jìn)入trans 端口; 隨后, 逐漸增大電場(chǎng)強(qiáng)度, DNA 分子能夠進(jìn)入trans 端口并順利穿越通道, 并從cis 端口順利離開; 當(dāng)E > 7.5 ×103V·m–1時(shí), 從trans 端口進(jìn)入通道的DNA 分子遷移至cis 端口附近時(shí), 部分DNA 分子發(fā)生反轉(zhuǎn)運(yùn) 動(dòng), 即, DNA 分 子 的 運(yùn) 動(dòng) 方 向 發(fā) 生 逆 轉(zhuǎn), 由cis 端向trans 端運(yùn)動(dòng), 不能夠從cis 端口穿出. 可見, DNA 分子能夠從trans 端口進(jìn)入并且順利穿越微通道, 電場(chǎng)強(qiáng)度大小有合適范圍, 存在閾值:Emin= 2.5 × 103V·m–1, Emax= 7.5 × 103V·m–1.

如圖2 所示, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E = 3.75 × 103V·m–1時(shí), DNA 分子從trans 端口進(jìn)入微米通道并在管內(nèi)的遷移.

圖2 DNA 分子從trans 端口進(jìn)入微米通道并在內(nèi)部遷移(E = 3.75 × 103 V·m–1) (a) 不同時(shí)間下的CCD 照片;(b) DNA 分子位置隨時(shí)間的變化曲線Fig. 2. DNA molecules enter the microchannel from the trans port and migrate inside (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a)CCD photographs; (b) DNA molecular position.

由圖2(a)可見, 當(dāng)外加電場(chǎng)在閾值電場(chǎng)強(qiáng)度內(nèi), DNA 分子能夠順利進(jìn)入trans 端口, 其中有2 個(gè)DNA 分子進(jìn)入觀察視野范圍內(nèi), 分別用虛線橢圓和虛線菱形標(biāo)識(shí); A1~D1和A2~B2分別對(duì)應(yīng)DNA1和DNA2分子在不同時(shí)刻出現(xiàn)在微米通道內(nèi)的位置, 可以發(fā)現(xiàn): 1) DNA 分子在通道內(nèi)運(yùn)動(dòng)時(shí), DNA1和DNA2分子到微米通道中心軸向的距離L1< L2, 其大小基本不變; 2) DNA1分子在trans 端口附近運(yùn)動(dòng)時(shí)(從A1位置到B1位置), 進(jìn)入trans 端口之前是糾纏蜷縮的(A1位置), 進(jìn)入通道內(nèi), 漸漸被拉伸, 長(zhǎng)度增大, 但在微米通道內(nèi)拉伸長(zhǎng)度變化不大; 3) 圖2(b)是DNA 分子在通道內(nèi)遷移時(shí)位置的改變, DNA1分子在0—0.5 s 內(nèi)移動(dòng)距離為65.5 μm, 0.5—1.0 s 內(nèi)移動(dòng)距 離為94.0 μm, 1.0—1.5 s 內(nèi)移動(dòng)距離為153.0 μm, 其平均速度逐漸增大; 而DNA2分子在被捕捉時(shí)已經(jīng)進(jìn)入到微通道內(nèi), 0—0.5 s 內(nèi)移動(dòng)距離為70.0 μm,與DNA1分子剛進(jìn)入端口時(shí)運(yùn)動(dòng)的距離幾乎相同.

實(shí)驗(yàn)中, 還觀察到DNA 分子進(jìn)入trans 端口后, 其速度會(huì)逐漸增大, 而DNA 分子穿出cis 端口時(shí)的速度逐漸減小等現(xiàn)象. 圖3 所示為DNA 分子進(jìn)入trans 端口和穿出cis 端口時(shí)的速度隨時(shí)間的變化曲線.

圖3(a)為DNA 分子進(jìn)入trans 端口的速度隨時(shí)間的變化. 其中DNA1, DNA2和DNA3分子分別表示距離中心軸線不等的三個(gè)DNA 分子, 距中心軸線的距離為L(zhǎng)1< L2< L3, 速度關(guān)系為v1>v2> v3. 可見, DNA 分子從樣品池進(jìn)入trans 端口之前的速度較小, 一旦進(jìn)入trans 端口開始加速,進(jìn)入微米通道中部后速度比較平穩(wěn); 軸線附近的DNA 分子速度大于管壁附近的DNA 分子速度.圖3(b)為DNA 分子流出cis 端口時(shí)的速度隨時(shí)間的變化特性, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)是從DNA 分子距離cis 端口大約為100 μm 的位置處開始記錄的,DNA 分子距離中心軸線的距離為L(zhǎng)4< L5< L6 v5> v6> v7.

對(duì)比圖3(a)和圖3(b), DNA 分子進(jìn)入trans端口與DNA 分子流出cis 端口的速度變化幾乎是兩個(gè)反對(duì)稱的過程. 在通道端口附近的同一橫截面處, 中心軸線附近的DNA 分子速度變化快, 而管壁附近的DNA 分子速度變化慢. DNA 分子進(jìn)入trans 端口時(shí), 速度逐漸增大, 最后保持不變; 穿出cis 端口時(shí), 速度逐漸減小, 最終進(jìn)入樣品池中的速度大小基本相同, 其主要原因是DNA 分子在樣品池中的運(yùn)動(dòng)主要受布朗運(yùn)動(dòng)的影響.

圖3(c)為DNA 分子在進(jìn)入端口和離開端口處的速度隨著外加電場(chǎng)變化的曲線圖, 規(guī)定DNA 分子逆著電場(chǎng)方向的運(yùn)動(dòng)為正方向. 圖3(c)所示是在不同的電場(chǎng)強(qiáng)度下, 分別對(duì)通道進(jìn)/出端口隨機(jī)捕捉的30—50 個(gè)DNA 分子的平均速度,DNA 分子距離中心軸線的范圍為0—14 μm. 其中, 黑色曲線為DNA 分子剛好進(jìn)入端口的平均速度隨著外加電場(chǎng)強(qiáng)度的變化關(guān)系, 紅色曲線為DNA 分子剛好離開端口處的平均速度隨著外加電場(chǎng)強(qiáng)度的變化關(guān)系. 由圖3(c)可知, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度2.5 × 103V·m–1< E ≤ 7 × 103V·m–1時(shí), DNA在入端口速度小于出端口速度; 當(dāng)外加電場(chǎng)強(qiáng)為7 × 103V·m–1< E ≤ 1 × 104V·m–1時(shí), DNA 在入端口的速度大于出端口速度.

圖3 DNA 分子進(jìn)出端口的速度隨時(shí)間的變化(E = 3.75 ×104 V·m–1) (a) 進(jìn)入trans 端口; (b) 穿出cis 端口; (c) 速度隨外加電場(chǎng)強(qiáng)度的變化關(guān)系Fig. 3. The velocity of DNA molecules entering and leaving the port (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a) Entering the trans port; (b) leaving the cis port; and (c) velocity versus electric intensity.

3.2 DNA 分子的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)

繼續(xù)增大電場(chǎng)強(qiáng)度, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E > 7.5 ×103V·m–1時(shí), 發(fā)現(xiàn)DNA 分子從trans 端口進(jìn)入微米通道內(nèi), 運(yùn)動(dòng)至cis 端口附近時(shí)將出現(xiàn)部分DNA 分子反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 即, 運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變, 如圖4所示.

圖4 DNA 分子在微通道內(nèi)的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng) (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) 不同電場(chǎng) 強(qiáng) 度下, 在cis 端口不同區(qū)域內(nèi)的DNA 分子反轉(zhuǎn)數(shù)占總數(shù)的百分比Fig. 4. Reversed motion of DNA molecules within micro channel under different electric intensity: (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) percentage of DNA molecules with reversal motion direction in different regions of the cis port under different electric intensity.

圖4 所示為DNA 分子在不同電場(chǎng)力作用下穿越微米通道時(shí), 其運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生反向的情況. 如圖4(a)所示, 當(dāng)外加電場(chǎng)強(qiáng)度E = 8.125 × 103V·m–1時(shí), DNA 分子首先在通道內(nèi)沿trans→cis 方向運(yùn)動(dòng)(0—0.4 s 內(nèi)), 速度逐漸減小; 當(dāng)DNA 分子運(yùn)動(dòng)至cis 端口處時(shí), 將在徑向上遷移, 而在軸向上近似靜止(0.4—0.6 s 內(nèi)); 最后, DNA 分子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生反轉(zhuǎn), 沿cis→trans 方向運(yùn)動(dòng)(0.6—1.0 s內(nèi)), 速度逐漸增大. 如圖4(b)所示, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度繼續(xù)增大至E = 9.375 × 103V·m–1, DNA 分子未到達(dá)cis 端口的邊界處就開始反轉(zhuǎn), 即, 在0—0.5 s內(nèi), DNA 分子沿trans→cis 方向運(yùn)動(dòng), 逆著電場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng); 0.5—1.2 s 內(nèi), DNA 分子沿cis→trans 方向運(yùn)動(dòng), 順著電場(chǎng)方向運(yùn)動(dòng).

為了詳細(xì)研究在不同的電場(chǎng)強(qiáng)度下DNA 分子的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)沿管徑方向的變化, 對(duì)微通道進(jìn)行了劃分, r 為距離中心軸線的距離, C 區(qū)域?yàn)? ≤r1< 14 μm, S1區(qū) 域 為14 μm ≤ r3< 20 μm,S2區(qū)域?yàn)?0 μm ≤ r2≤ 25 μm. 同一電場(chǎng)強(qiáng)度下, 當(dāng)DNA 分子運(yùn)動(dòng)穩(wěn)定后統(tǒng)計(jì)10 min. 在不同外加電場(chǎng)強(qiáng)度下重復(fù)實(shí)驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)每次實(shí)驗(yàn)捕捉到的各個(gè)分區(qū)域內(nèi)DNA 分子數(shù)目占DNA 分子總數(shù)的百分比分布基本相同, 例如, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度為7.5 ×103V·m–1時(shí), DNA 分子分布在C, S1 和S2 各區(qū)域內(nèi)的平均百分比分別約為68%, 23%和9%.圖4(c)所示是隨機(jī)的3 次實(shí)驗(yàn), 外加不同電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí), 發(fā)生在不同區(qū)域的反轉(zhuǎn)DNA 分子數(shù)占所捕捉的DNA 分子總數(shù)的百分比. 由圖4(c)可知, 在不同的外電場(chǎng)強(qiáng)度下, DNA 分子流出端口不同區(qū)域的反轉(zhuǎn)數(shù)占流出總數(shù)的百分比不同. 隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大, DNA 分子反轉(zhuǎn)的幾率增大, 在相同的電場(chǎng)強(qiáng)度下, C 區(qū)域內(nèi)DNA 分子的反轉(zhuǎn)概率最小,其次是S1 區(qū)域, S2 區(qū)域內(nèi)DNA 分子的反轉(zhuǎn)概率最大.

隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的繼續(xù)增大, DNA 分子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生反轉(zhuǎn)的位置距離cis 端口越來越遠(yuǎn), 離trans 端口越來越近; 當(dāng)E = 1 × 104V·m–1時(shí), 通道trans 端口附近的內(nèi)壁上會(huì)吸附DNA 分子; 當(dāng)E > 1 × 104V·m–1時(shí), 部分DNA 分子剛進(jìn)入trans 端口內(nèi)就發(fā)生反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 返回到trans 端的樣品池中, 或者被吸附到管壁上.

DNA 分子的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)方式可以分為基本的兩種類型: 1) DNA 分子首先逆著電場(chǎng)的方向運(yùn)動(dòng)至cis 端口; 然后, DNA 分子在反轉(zhuǎn)點(diǎn)的位置徑向遷移, 軸向上靜止; 最后, DNA 分子開始反轉(zhuǎn), 朝向trans 端口運(yùn)動(dòng); 2) DNA 分子首先逆著電場(chǎng)的方向運(yùn)動(dòng), 在未到達(dá)cis 端口時(shí)收縮成一個(gè)緊湊的小球, 似乎停止在通道中; 最后, DNA 分子直接反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng). 其中, 距離中心軸線較遠(yuǎn)的DNA 分子容易發(fā)生第一種類型的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng); 而中心軸線附近、或者管壁附近的DNA 分子, 或者當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度大于9.375 × 103V/m 時(shí), DNA 分子容易發(fā)生第二種類型的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng).

3.3 DNA 分子的往復(fù)運(yùn)動(dòng)以及旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)

當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度增大至E > 9.375 × 103V·m–1時(shí), 在trans 端口附近, 發(fā)現(xiàn)DNA 分子具有周期性往復(fù)運(yùn)動(dòng)的現(xiàn)象.

如圖5(a)所示, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E > 9.375 ×103V·m–1時(shí), 在trans 端口附近, 單個(gè)DNA 分子在一個(gè)周期內(nèi)的往復(fù)運(yùn)動(dòng), 周期約為3.0 s, 其中,紅色箭頭表示DNA 分子的運(yùn)動(dòng)方向.

圖5 DNA 分子在trans 端口附近沿軸向的運(yùn)動(dòng) (a) 往復(fù)運(yùn)動(dòng); (b) 旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)Fig. 5. The motion of DNA molecules near the trans port:(a) Reciprocating along the axis; (b) rotating.

如圖5(b)所示, 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E = 1×104V/m時(shí), 捕捉到多個(gè)DNA 分子的往復(fù)運(yùn)動(dòng), 分別用圓形虛線、菱形虛線標(biāo)記. 其中, 黃色箭頭表示單個(gè)DNA 分子(圓形虛線標(biāo)記)在軸向上往復(fù)運(yùn)動(dòng)的方向, A1—A5表示DNA 分子在不同時(shí)刻的位置,它在軸向上的運(yùn)動(dòng)距離較大, 自身無旋轉(zhuǎn); 紅色箭頭表示團(tuán)聚在一起的多個(gè)DNA 分子(菱形虛線標(biāo)記)繞著自身旋轉(zhuǎn)的方向, 其方向指向管壁(順時(shí)針旋轉(zhuǎn)), B1—B5表示DNA 分子在不同時(shí)刻的位置, 團(tuán)聚的DNA 分子在軸向上往復(fù)運(yùn)動(dòng)的距離較小, 藍(lán)色虛線表示DNA 做往復(fù)運(yùn)動(dòng)時(shí)的平衡位置.

圖6 是圖5(b)中團(tuán)聚的DNA 分子在10 s 內(nèi)往復(fù)運(yùn)動(dòng)的軌跡. 其中, 藍(lán)色曲線為DNA 分子運(yùn)動(dòng)的軌跡, 紅色虛線為DNA 分子在運(yùn)動(dòng)過程中平衡位置的擬合曲線, 圖中兩點(diǎn)之間的時(shí)間間隔為0.1 s.

圖7 所示為通道trans 端口附近的內(nèi)壁上吸附DNA 分子的情形, 圖7(a)和圖7(b)的電場(chǎng)強(qiáng)度分別為7.5 × 103和1 × 104V·m–1, 由圖7 可知, 隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的增大, 吸附在內(nèi)管壁的DNA 分子數(shù)量增多.

圖6 DNA 分子在trans 端口附近的往復(fù)運(yùn)動(dòng)(E = 9.375 ×103 V·m–1)Fig. 6. The track of DNA molecules reciprocating near the trans port (E = 9.375 × 103 V·m–1).

圖7 不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的trans 端口附近通道內(nèi)壁團(tuán)聚有DNA 分子 (a) E = 7.5 × 103 V·m–1; (b) E = 1 × 104 V·m–1Fig. 7. Aggregates of DNA molecules on the wall of microchannel near the trans port; (a) E = 7.5 × 103 V·m–1;(b) E = 1 × 104 V·m–1.

3.4 DNA 分子進(jìn)/出微通道端口機(jī)制

圖8 所示是流體在通道內(nèi)的速度分布以及DNA分子的受力和運(yùn)動(dòng)示意圖. 由于微米通道端口處存在反壓差, 通道內(nèi)流體速度是電滲流和反壓差流的疊加, 流體的流速不再是理想的塞狀分布[19].

圖8 中, 灰色帶箭頭的線段表示流體的速度分布, 流體在通道trans/cis 端口的速度是順著電場(chǎng)方向的電滲流流速與逆著電場(chǎng)方向的泊肅葉(Poiseuille)拋物線流速的疊加. 流體在徑向上存在速度梯度; 另外, 由于端口處存在明顯的反壓差作用以及可能存在的污染、管口不平整等因素, 緩沖液沿軸向也存在速度梯度.

圖8 緩沖液在微米通道內(nèi)的流速分布以及DNA 受力和速度示意圖 (a)受力; (b)速度Fig. 8. Schematic diagram of buffer velocity distribution in microfluidic channel and the infromation of DNA: (a) Force;(b) velocity.

如圖8(a)所示, DNA 分子在trans/cis端口處沿軸向的受力為

沿徑向的受力為

DNA 分子在微通道內(nèi)部只受到沿軸向的作用力, 其大小為

圖8 中,f1=f電泳力=qE;f2,f3分 別 為 軸向流體阻力和徑向流體阻力, 其大小為f流體阻力=6πaμ(vf?vp) , 其方向與速度矢量差的方向相同;, 反壓差力也是由壓強(qiáng)梯度引起的; 薩夫曼力的大小為fs=Kμ(vf?vp)a2|G/υ|1/2. 式中,q為DNA 分子的帶電量,E為電場(chǎng)強(qiáng)度,a為DNA 分子的半徑,vf,vp分別為流體的速度和DNA 分子的速度,μ表示流體黏度,u為流體運(yùn)動(dòng)黏度,G為局部流體速度梯度,?p/?x為軸向的壓強(qiáng)梯度.

當(dāng)DNA 分子與壁面之間的距離很近時(shí)存在靜電作用, 其大小為[20]

其 中k?1為德拜長(zhǎng)度;kB玻爾茲曼常量;y1為DNA 分子到管壁的距離;zwall和zDNA分別為壁面Zate 電勢(shì)和DNA 的表面電勢(shì), 與DNA 的帶電量和緩沖液的PH 有關(guān).

由(1)式和(2)式可知, DNA 分子所受合力的大小與外加電場(chǎng)強(qiáng)度、緩沖液速度、DNA 分子大小、DNA 電泳速度、管徑大小等因素有關(guān).

圖8(b)是流體和DNA 分子在通道中的運(yùn)動(dòng)示意圖. 實(shí)驗(yàn)中使用的緩沖液pH > 3, 與管壁接觸時(shí)管壁帶負(fù)電; 當(dāng)微米通道兩端施加電場(chǎng)時(shí), 微通道內(nèi)的緩沖液將形成電滲流, 其移動(dòng)方向?yàn)閏is→trans; 由于DNA 分子顯負(fù)電性, DNA 分子電泳的方向與電滲流方向相反, 為trans→cis. 理想狀態(tài)下, DNA 分子等帶電粒子在微米通道中運(yùn)動(dòng)的速度是電泳[21,22]和電滲流[23,24]的疊加. 規(guī)定DNA 分子電泳速度方向?yàn)檎? 則DNA 分子在微通道中運(yùn)動(dòng)的有效速度veff為

當(dāng)微米通道長(zhǎng)度為無限長(zhǎng)的理想情況時(shí), 流體在微通道中的速度可以用電滲流速度來表示, 即,vf=εζwallE/4πμ. 然而, 實(shí)際的微米通道為有限長(zhǎng),通道端口流體的速度是電滲流和反壓差流動(dòng)速度的疊加, 即[20,25]:

其中e是溶液的介電常數(shù);ψ(y2) 為距離中心線為y2處的電勢(shì);h為通道的半徑.

實(shí)驗(yàn)中, 樣品池的邊長(zhǎng)(L= 10000 μm)相對(duì)于微通道的內(nèi)徑(D= 50 μm)以及DNA 分子的回轉(zhuǎn)半徑(Rg= 0.7 μm), 幾乎是一個(gè)三維無限大的儲(chǔ)液池. DNA 分子在樣品池內(nèi)將處于糾纏狀態(tài),當(dāng)其從trans端口進(jìn)入通道, 是逆著流體流動(dòng)的方向遷移, DNA 分子進(jìn)入以及穿越微米通道的過程中始終受到一個(gè)逆向流體的作用力[26].

研究發(fā)現(xiàn)[15], 電場(chǎng)力驅(qū)動(dòng)DNA 分子從trans端進(jìn)入并順利穿越內(nèi)徑為30 μm 的通道時(shí), 最小閾值電場(chǎng)強(qiáng)度為Emin= 7 × 103V·m–1. 本研究發(fā)現(xiàn), DNA 分子從trans端口進(jìn)入并順利穿越內(nèi)徑為50 μm 通道時(shí)的最小閾值電場(chǎng)強(qiáng)度Emin= 2.5 ×103V·m–1. 即, 通道內(nèi)徑越小, 電場(chǎng)強(qiáng)度閾值越大.這種現(xiàn)象符合電滲流壓力同濕周長(zhǎng)度C與通道截面積A的比值成正比的規(guī)律[27].

由(6)式與(7)式可得, DNA 分子在微米通道內(nèi)同一橫截面上的有效速度:

(8)式等號(hào)左側(cè)的第二項(xiàng)為定值, 因此,DNA 分子的有效速度與徑向距離y2的關(guān)系是開口向下的拋物線, DNA 分子沿軸向的有效速度在中心軸線處將最大.

圖9 所示是DNA 分子在流出端口同一截面不同位置處沿軸向速度的實(shí)測(cè)數(shù)值與理論計(jì)算值.其中, 橫坐標(biāo)為DNA 分子距離中心軸線的距離,dp/dx= 0.04 Pa/m,μ= 1.011 × 10–3Pa·s,y2=4.5, 13.5, 22.5 μm,藍(lán)色曲線為理論DNA 分子速度, 紅色曲線為實(shí)測(cè)速度. 從圖9 可以明顯看出, 隨著DNA 分子距離中心軸線越遠(yuǎn), 其軸向有效速度越小; 理論與實(shí)驗(yàn)相吻合.

圖9 DNA 分子在端口同一截面不同位置的實(shí)測(cè)速度與理論速度Fig. 9. Measured and theoretical velocities of DNA molecules at different positions on the same cross section of near the microchannel port.

外加電場(chǎng)不同, DNA 分子在通道內(nèi)出現(xiàn)不同的運(yùn)動(dòng)狀態(tài), DNA 的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)主要出現(xiàn)在cis端口, 往復(fù)運(yùn)動(dòng)和旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)出現(xiàn)在trans端口.

圖10 所示為DNA 分子從trans端口進(jìn)入微米通道, 并隨著電場(chǎng)強(qiáng)度的改變, 在端口附近其反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)發(fā)生位置點(diǎn)變化示意圖. 圖10(a)和圖10(b)為DNA 分子在不同電場(chǎng)強(qiáng)度下的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)過程.其中, 圖10(a)的電場(chǎng)強(qiáng)度范圍為7.5 × 103V·m–1≤E≤ 1 × 104V·m–1, 圖10(b)的電場(chǎng)強(qiáng)度范圍為E> 1 × 104V·m–1.

圖10 DNA 分子在微米通道內(nèi)端口附近處的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)示意圖 (a) DNA 分子在cis 端口處反轉(zhuǎn), 反 轉(zhuǎn)后的DNA 分子容易吸附在微米通道內(nèi)管壁上, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤1 × 104 V·m–1; (b) DNA 分子在trans 端口附近的反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), E > 1 × 104 V·m–1Fig. 10. Schematic diagram of DNA molecules moving near the port of microchannel: (a) reversing near the cis port,and the reversed DNA molecule is easy to be adsorbed onto the inner wall, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤ 1 × 104 V·m–1; (b)reversing near the trans port, E > 1 × 104 V·m–1.

由圖10(a)可知, DNA 分子是逆著流速靠近c(diǎn)is端口. DNA 靠近c(diǎn)is端口, 其電泳力和電滲流阻力幾乎不變, 流體的阻力雖然逐漸減小, 但壓強(qiáng)梯度力卻逐漸增大, 導(dǎo)致DNA 分子的運(yùn)動(dòng)速度逐漸減小. 圖10(a)中用虛線圓標(biāo)記了一個(gè)在cis端口將要反轉(zhuǎn)的DNA 分子所處的位置, 此時(shí), 壓強(qiáng)梯度力與DNA 分子表面的電滲流阻力之和大于DNA 分子所受電泳力, 使得DNA 開始反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng).

電場(chǎng)強(qiáng)度的大小能夠影響DNA 分子反轉(zhuǎn)點(diǎn)的位置. 當(dāng)外電場(chǎng)達(dá)到反轉(zhuǎn)電場(chǎng)強(qiáng)度時(shí), 電場(chǎng)強(qiáng)度越大, DNA 分子速度減小越快, 反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)之前沿trans→cis方向運(yùn)動(dòng)的距離越小, 距離cis端口處越遠(yuǎn). 如圖10(b)所示, 外加電場(chǎng)強(qiáng)度E> 1 ×104V·m–1,菱 形 標(biāo) 記 的 一 個(gè)DNA 分 子 靠 近trans端口, 此時(shí), DNA 分子受力滿足條件:f電泳力+f壓強(qiáng)梯度力+f反壓差力>f軸向流體阻力+f電滲流阻力, 因此它能夠進(jìn)入trans端口. 當(dāng)DNA 分子進(jìn)入通道內(nèi)部, 運(yùn)動(dòng)到圓虛線標(biāo)記的位置時(shí), 反壓差力和壓強(qiáng)梯度力很小, 甚至消失, 電泳力不足以主導(dǎo)DNA 分子繼續(xù)遷移, 此時(shí)DNA 分子在電滲流阻力的主導(dǎo)下反轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 沿cis→trans的方向運(yùn)動(dòng).需要說明的一點(diǎn)是, 外加電場(chǎng)的增大會(huì)產(chǎn)生焦耳熱, 進(jìn)而引起緩沖液的黏度減小; 而且, 在散熱的過程中, 微米通道沿徑向有溫度梯度, 將影響微通道內(nèi)部流體的速度分布, 對(duì)DNA 分子的運(yùn)動(dòng)也會(huì)產(chǎn)生影響.

另外, 電場(chǎng)強(qiáng)度越大對(duì)DNA 分子構(gòu)象的影響較明顯, 使其表面電荷分布發(fā)生改變. 如圖5(a)所示, DNA 分子在構(gòu)象上高度壓縮, 其表面電荷密度將發(fā)生改變; 圖5(b)所示, 電場(chǎng)強(qiáng)度超過1 ×104V/m, DNA 分子收縮成一個(gè)相當(dāng)緊湊的小球,導(dǎo)致DNA 分子表面電荷密度分布發(fā)生改變, 各向同性增強(qiáng)[28], 表面電勢(shì)(zDNA)發(fā)生變化將導(dǎo)致DNA 分子電泳力發(fā)生改變[29]. 圖5(a)中, DNA 分子逆著流體的方向進(jìn)入通道, 在1.0 s 時(shí)刻, DNA分子未到達(dá)cis端口, 但是其有效速度已減小為零.由于在該電場(chǎng)強(qiáng)度下, DNA 分子的電滲流淌度大于電泳淌度, 使得DNA 分子不能保持靜止?fàn)顟B(tài),因此下一刻DNA 分子的運(yùn)動(dòng)方向開始反轉(zhuǎn), 轉(zhuǎn)向cis→trans運(yùn)動(dòng). 當(dāng)?shù)竭_(dá)trans端口附近時(shí), 有效速度再次減小為零(2.0 s 時(shí)刻), 此時(shí)DNA 分子的受力 為f電泳力+f壓強(qiáng)梯度力+f反壓差力>f電滲流阻力, 導(dǎo)致DNA 分子不能流出trans端口, 在此位置再一次進(jìn)行反轉(zhuǎn), 轉(zhuǎn)向trans→cis運(yùn)動(dòng), 形成一次往復(fù)運(yùn)動(dòng).

電場(chǎng)強(qiáng)度繼續(xù)增大, 并不能促使DNA 分子在電泳的主導(dǎo)下向著cis端管口遷移, 反而加快DNA 分子往復(fù)運(yùn)動(dòng)的頻率. DNA 分子在往復(fù)運(yùn)動(dòng)的過程中, 偏向管壁運(yùn)動(dòng)時(shí)速度減小. 由圖6 可以看出, DNA 分子在往復(fù)運(yùn)動(dòng)的過程中逐漸地靠近管壁, 同時(shí)DNA 分子往復(fù)運(yùn)動(dòng)的軸向距離逐漸減小. 當(dāng)電場(chǎng)強(qiáng)度E> 7.5 × 103V·m–1時(shí), DNA 分子明顯偏向管壁運(yùn)動(dòng), 主要原因是在trans端口附近, 反壓差的作用使得DNA 分子周圍的流體存在速度梯度, 受到薩夫曼力的作用[30], 方向指向管壁.關(guān)于DNA 分子的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng), 則主要是由于DNA 分子周圍的緩沖液在徑向和軸向上都存在速度梯度. 當(dāng)團(tuán)聚的DNA 分子質(zhì)量較大時(shí), 就有可能出現(xiàn)徑向位置變化較小的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng). 如圖5(b)所示, 中心軸線右側(cè)團(tuán)聚的DNA 分子周圍的流體存在速度梯度, 距離中心軸線越近流體速度越小,此時(shí)DNA 分子向著管壁處旋轉(zhuǎn); 當(dāng)DNA 分子的旋轉(zhuǎn)角速度矢量與運(yùn)動(dòng)的速度矢量不重合時(shí), 在與旋轉(zhuǎn)角速度矢量和平動(dòng)速度矢量組成的平面相垂直的方向上將產(chǎn)生一個(gè)徑向力, 即, 馬格努斯力[31].薩夫曼力和馬格努斯力之間存在互動(dòng)性; DNA 分子將在以上多種力的共同作用下做復(fù)雜的旋轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng).

4 結(jié) 論

本論文利用單分子熒光顯微成像方法比較系統(tǒng)地研究了l-DNA 分子在外電場(chǎng)力作用下進(jìn)入、穿越內(nèi)徑為50 μm 的圓形通道的電動(dòng)力學(xué)特性.研究結(jié)果表明: DNA 分子能夠進(jìn)入微米通道trans端口并順利穿越微通道存在最小閾值電場(chǎng)強(qiáng)度Emin= 2.5 × 103V·m–1和最大閾值電場(chǎng)強(qiáng)度Emax= 7.5 × 103V·m–1. 只有當(dāng)外電場(chǎng)強(qiáng)度滿足2.5 × 103V·m–1≤E≤ 7.5 × 103V·m–1時(shí), 才能夠引導(dǎo)DNA 分子從trans端口進(jìn)入通道, 并順利從cis端口穿越. 當(dāng)外電場(chǎng)小于Emin時(shí), DNA 分子只能靠近trans端口, 但不能通過trans端口進(jìn)入通道; 外加電場(chǎng)強(qiáng)度7.5 × 103V·m–1 1× 104V·m–1時(shí), DNA 分子在樣品池內(nèi)很難靠近trans端口. 在外電場(chǎng)力作用下, DNA 分子從容積較大的樣品池內(nèi)進(jìn)入微米通道, 在通道內(nèi)沿軸向主要受電泳力、壓強(qiáng)梯度力、反壓差力、流體阻力以及電滲流阻力等的作用; 電場(chǎng)強(qiáng)度的改變, 將引起緩沖液的流速以及DNA 分子受力情況的改變, 進(jìn)一步影響其動(dòng)力學(xué)特性. 本研究結(jié)果對(duì)研制基于微納通道系統(tǒng)的DNA 分子傳感器和芯片實(shí)驗(yàn)室等具有一定的指導(dǎo)意義.