基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路研究調(diào)心方對(duì)APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性的影響

王曉雯 ，錢 紅 ，沈春娟 ，李燕軍 ，袁海新 *，王 健

1 上海市第五康復(fù)醫(yī)院，上海 201699；2 上海中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，上海201203

阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種不可逆轉(zhuǎn)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。 目前，全世界范圍內(nèi)有超過5 000 萬AD 患者，到2050 年，預(yù)計(jì)將有 15 000 萬 AD 患者［1］。 AD 的主要發(fā)病人群為60 歲以上的老年人，其患病率隨人口老齡化日益增加。在我國60 歲以上人群的患病率為0.53%～5.67%，85 歲以上為 20%～50%［2］。 AD 的臨床特征是隱匿起病，早期主要出現(xiàn)近期記憶力減退，隨著病情的發(fā)展，視空間、計(jì)算力、語言、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)功能均可出現(xiàn)障礙，在后期甚至出現(xiàn)妄想、錯(cuò)覺、焦慮、抑郁等精神癥狀，不僅對(duì)老年人的日常生活能力造成了嚴(yán)重的影響，也給照料者和社會(huì)帶來了沉重的負(fù)擔(dān)［3］。 目前有許多研究進(jìn)行 AD 治療藥物研發(fā)，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)正在研發(fā)／已研發(fā)的藥物有200 多種，但其中99%藥物因中期結(jié)果無效或副作用不能耐受等原因?qū)е率。?］，僅有極少數(shù)藥物被批準(zhǔn)用于治療AD，而這些藥物只能控制癥狀，并無法改變疾病的進(jìn)程。 如多奈哌齊就是臨床上治療輕中度AD 的常用藥物［5］，它是一種可逆性的乙酰膽堿酶抑制劑，能有效改善認(rèn)知功能。

近年來，隨著中醫(yī)學(xué)對(duì)AD 防治的深入研究，發(fā)現(xiàn)中醫(yī)藥在AD 的防治方面有著明顯的優(yōu)勢(shì)。 林水淼教授［6］結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)提出輕中度AD 患者以心氣虛證為主，治療宜從心入手，研究發(fā)現(xiàn)調(diào)心方能有效改善氧化損傷型類AD 大鼠空間記憶能力和神經(jīng)元鈣穩(wěn)態(tài)［7］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過調(diào)心方治療后，APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的學(xué)習(xí)獲取能力和空間記憶保持能力均明顯提高［8］。 但有關(guān)于其具體的作用機(jī)制還未明確。 APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠能夠模仿AD 的病理變化，常被用于AD 和神經(jīng)退行性病變的神經(jīng)生物學(xué)研究［9］。 αCaMKⅡ-CREBBDNF 信號(hào)通路是形成及維持空間學(xué)習(xí)記憶能力和長時(shí)程增強(qiáng)（long-term potentiation，LTP）的重要信號(hào)通路之一［10］。 本研究基于 αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路探討調(diào)心方改善AD 學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性的具體作用機(jī)制，選擇采用3 月齡APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD 病理模型，通過電生理技術(shù)誘導(dǎo)小鼠海馬CA1 區(qū)LTP，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng) （real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)α 鈣／鈣調(diào)素依賴激Ⅱ（alpha calcium ／calmodulin-dependent protein kinaseⅡ，αCaMKⅡ）、環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（cyclic AMP response element binding protein，CREB）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、突觸后致密物 95（postsynaptic density protein-95，PSD-95）mRNA 表達(dá)；采用 Western blot 法檢測(cè) p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF、PSD-95 蛋白表達(dá)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取 SPF 級(jí) 3 月齡 APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠 54 只，體質(zhì)量（25.22±1.71）g，按照隨機(jī)數(shù)字表法將APP／PS1 雄性小鼠分為模型組、多奈哌齊組、調(diào)心方組。另設(shè)同月齡同品系同月齡C57／BL6 雄性野生型小鼠 18 只為正常組，體質(zhì)量（30.49±1.59）g。以上實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均由南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所提供，品系編號(hào)為 D00268，許可證號(hào)：SCXK（蘇）2015-0001。 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)過程中動(dòng)物飼養(yǎng)和操作嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)準(zhǔn)則。

1.2 主要儀器與試劑

超薄切片機(jī)（德國Leica 公司）；全波長酶標(biāo)儀、梯度PCR 儀（美國Thermo 公司）；伯樂電泳儀、伯樂寬式水平電泳槽、轉(zhuǎn)印電泳槽（美國BIO RAD 公司）；水浴鍋、隔水式恒溫培養(yǎng)箱（上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司）；化學(xué)發(fā)光成像儀（上海天能公司）。 Trizol、隨機(jī)引物（美國 Invitrogen 公司）；RIPA、PMSF、BCA試劑盒、PBS、SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒、5Xloadingbuffer、SDS-PAGE 電泳液、Western 轉(zhuǎn)膜液（上海碧云天生物技術(shù)公司）；BDNF 抗體、p-CREB（S133）抗體、p-αCaMKⅡ（T286）抗體、GAPDH 抗體、PSD95抗體（英國 Abcam 公司）；αCaMKⅡ-α、CREB、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（H＋L）（美國CST 公司）。

1.3 主要藥物

調(diào)心方顆粒（江蘇江陰天江藥業(yè)有限公司），其成分主要包括黨參、石菖蒲、桂枝、甘草、白芍、龍骨、遠(yuǎn)志等；鹽酸多奈哌齊（江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：H20030472）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 干預(yù)方法

參照藥理試驗(yàn)中動(dòng)物與人體間的等效劑量換算標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行折算，多奈哌齊組和調(diào)心方組均按照人的等效劑量（體質(zhì)量：60 kg）折算出藥物劑量。 正常組和模型組給予等量生理鹽水 10 mL／（kg·d）；多奈哌齊組給予鹽酸多奈哌齊灌胃，劑量為 0.05 mg／（kg·d）；調(diào)心方組給予調(diào)心方顆粒灌胃，劑量為0.057 g／（kg·d）［11］；4 組小鼠于 3 月齡時(shí)進(jìn)行灌胃給藥處理，1 次 ／d，連續(xù)灌胃 3 個(gè)月。

2.2 取材

2.2.1 腦片制備 4 組各隨機(jī)選取5 只小鼠，于小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速斷頭，取出腦組織移至95%O2＋5%CO2混合氣飽和的人工腦脊液（artificial cerebrospinal fluid，ACSF）中，ACSF 溶液溫度為 0 ℃，放置 1 min。 去除前腦和小腦，用膠水將剩余腦組織塊粘在切片臺(tái)上。 用振動(dòng)切片機(jī)冠狀切取海馬腦片，海馬腦片大小為400 μm，放入34 ℃的孵育槽中孵育0.5 h，然后放在（25±1） ℃持續(xù)通入 95%O2＋5%CO2混合氣飽和的 ACSF溶液中2～8 h。

2.2.2 腦組織樣本制備 4 組各隨機(jī)選取7 只小鼠，將小鼠腹腔注射20%的水合氯醛，待小鼠麻醉后，快速斷頭，取出腦組織移置-20 ℃的冰盒上，迅速剝離左右兩側(cè)海馬置于EP 管中，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱內(nèi)，以待RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)備用。

2.3 指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 離體海馬CA1 區(qū)LTP 誘導(dǎo) 待腦片孵育結(jié)束后，在顯微鏡下將腦片移進(jìn)記錄槽中，使用32～34 ℃的 95%O2＋5%CO2混合氣飽和的 ACSF 溶液持續(xù)灌流，速度為3 mL／min，在海馬CA1 區(qū)記錄興奮性突觸后電位。 具體步驟如下：①確定海馬CA1區(qū)：顯微鏡下確定海馬的CA1 區(qū)。②準(zhǔn)備刺激電極、記錄電極：選擇1 個(gè)單級(jí)鎢絲的微電極刺激作為刺激電極，尖端直徑1～2 μm，尖端暴露長度為15～40 μm；記錄電極為玻璃管記錄電極，ACSF 溶液充滿玻璃管，電阻1～5 MΩ，將其放在CA1 區(qū)的同一層。③ 刺激海馬CA1 區(qū)：將刺激電極放在海馬CA1區(qū) stratum radium 層，刺激 Shaffer collateral 纖維，以0.033 Hz 頻率，100 μs 波寬，每隔 30 s 給 1 個(gè)刺激，刺激強(qiáng)度為0.1～0.7 mA。 ④ 記錄場(chǎng)興奮性突觸后電位：每給1 個(gè)刺激記錄1 個(gè)場(chǎng)興奮性突觸后電位（field excitatory postsynaptic potential，fEPSP），以 30%fEPSP 最大刺激強(qiáng)度為基線，記錄30 min；在前30 min 基礎(chǔ) fEPSP 曲線保持穩(wěn)定后，LTP 應(yīng)用100 Hz 高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）誘導(dǎo)1 s，LTP 誘發(fā)成功后持續(xù)記錄 60 min，選擇其中的第50～60 min 的fEPSP 平均斜率觀察LTP 水平。LTP 是在強(qiáng)直剌激下誘發(fā)的突觸傳遞功能長時(shí)間增強(qiáng)現(xiàn)象，反映了突觸傳遞效能的持久變化［12］。⑤繪制刺激強(qiáng)度-反應(yīng)曲線：以刺激強(qiáng)度為橫坐標(biāo)，fEPSP斜率為縱坐標(biāo)，繪制刺激強(qiáng)度-反應(yīng)曲線（input-output curve，I／O），I／O 曲線能夠反映神經(jīng)環(huán)路的基本突觸傳遞特性。 ⑥觀察短時(shí)程突觸可塑性：在海馬Schaffer 側(cè)枝CA1 區(qū)的突觸通路上，從20～250 ms 雙脈沖刺激間隔的雙脈沖易化（paired pulse facilitation，PPF）即短時(shí)程的突觸可塑性。 在 30%fEPSP 最大刺激強(qiáng)度的刺激下，一般會(huì)產(chǎn)生前后2 個(gè)突觸后興奮電位，后1 個(gè)fEPSP 斜率／前1 個(gè)fEPSP斜率就是PPF 值。 它可通過觀察突觸后的反應(yīng)來推測(cè)突觸前神經(jīng)遞質(zhì)的釋放情況。 以上數(shù)據(jù)采用Clampfit 軟件進(jìn)行分析。

2.3.2 海馬 CA1 區(qū) αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 含量檢測(cè) 采用RT-qPCR 法檢測(cè)海馬αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95mRNA 的含量。4 組小鼠各隨機(jī)選取4 個(gè)海馬組織，采用Trizol 法提取總 RNA， 使用酶標(biāo)儀檢測(cè)總RNA 的濃度和純度，光密度（optical density，OD）比值可以判斷RNA純度，OD260／OD280在 1.8～2.0 之間，表示 RNA 純度較好。 RNA 純度測(cè)定后，利用 cDNA 合成試劑盒將2 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA。PCR 擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性 2 min，需執(zhí)行 1 個(gè)循環(huán)。 先 95 ℃變性 5 s，后60 ℃退火10 s，需執(zhí)行45 個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后緩慢升溫，生成各基因的熔解曲線。 采用GAPDH 作為內(nèi)參基因，利用熒光定量 PCR 儀對(duì)目的基因αCaMKⅡ、BDNF、CREB、PSD-95 進(jìn)行定量檢測(cè)。 使用 PCR系統(tǒng)軟件，觀察熔解和擴(kuò)增曲線，記錄各組目的基因的 Ct 值，相對(duì)定量采用 2-△△Ct法。 引物由 NCBI Primer-blast 設(shè)計(jì)，序列參照Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中的基因序列，由蘇州金唯智公司合成。 序列為：①BDNF：上游 5’-GGTATCCAAAGGCCAACTGA-3’；下游 5’-CTTATGAATCGCCAGCCAAT-3’。 ② CREB：上游 5’-CAGACAACCAGCAGAGTGGA-3’，下游5’-GGGCTAATGTGGCAATCTGT-3’。 ③ GADPH：上游 5’-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游5’-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3’。 ④ PSD-95：上游 5’-CTATGAGACGGTGACGCAGA-3’，下游5’-CGGGAGGAGACAAAGTGGTA-3’。⑤αCaMKⅡ：上游 5’-CAGCCACTGTATCCAGCAGA-3’，下游5’-GAGGCCAGCAACAGATTCTC-3’。

2.3.3 海馬 CA1 區(qū) p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF和PSD-95 蛋白含量檢測(cè) 采用Western blot 法檢測(cè)海馬 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 的蛋白含量。 4 組隨機(jī)選取3 個(gè)在-80 ℃冰箱中儲(chǔ)存的海馬組織，按蛋白提取試劑盒上操作要求提取蛋白，使用BCA 法測(cè)定各組蛋白濃度。 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出4 組樣本的蛋白濃度，使用RIPA 裂解液將各組蛋白定容至等體積，濃度為1 μg／μL，在100 ℃水浴鍋中煮沸10 min，置于-20 ℃冰箱中備用。 經(jīng)過SDS-PAGE 凝膠配制、凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡后，進(jìn)行圖像分析。 所有條帶均采用Al-Phaview SA 軟件進(jìn)行處理分析。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。 計(jì)量資料用（）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且方差齊時(shí)，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)；方差不齊用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。 重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)用重復(fù)測(cè)量方差分析。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 4 組小鼠海馬 CA1 區(qū) LTP 比較

見圖1。

圖 1 4 組海馬 CA1 區(qū) LTP 圖Figure 1 LTP figure of hippocampal CA1 in four groups

3.2 4 組小鼠海馬區(qū) αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和PSD-95 mRNA 表達(dá)比較

見表 1、圖 2。

表 1 4 組海馬 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表達(dá)比較（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

表 1 4 組海馬 αCaMKⅡ、CREB、BDNF、PSD-95 mRNA 表達(dá)比較（）Table 1 Comparison of αCaMKⅡ, CREB, BDNF, PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups （）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.34 0.62±0.051）1.00±0.072）0.94±0.112）組別正常組模型組多奈哌齊組調(diào)心方組n 4 4 4 4 αCaMKⅡ1.00±0.22 0.58±0.071）0.93±0.082）0.91±0.072）CREB 1.00±0.29 0.63±0.001）0.88±0.19 0.96±0.092）BDNF 1.00±0.20 0.51±0.111）0.91±0.272）0.94±0.032）

圖 2 4 組小鼠海馬區(qū) αCaMKⅡ、CREB、BDNF 和 PSD-95 mRNA 表達(dá)比較Figure 2 Comparison of αCaMKⅡ，CREB，BDNF and PSD-95 mRNA expression in the hippocampus in four groups

3.3 4 組小鼠 海馬 區(qū) p-αCaMK Ⅱ、p-CREB、BDNF和PSD-95 的蛋白表達(dá)比較

見表 2、圖 3、圖 4。

表 2 4 組海馬區(qū) p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表達(dá)比較（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

表 2 4 組海馬區(qū) p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 和 PSD-95 蛋白表達(dá)比較（）Table 2 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression in the hippocampus in four groups （）

注：與正常組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the normal group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

PSD-95 1.00±0.12 0.58±0.081）0.85±0.072）0.92±0.092）組別正常組模型組多奈哌齊組調(diào)心方組n 3 3 3 3 p-αCaMKII 1.00±0.20 0.47±0.061）0.46±0.06 0.86±0.142）p-CREB 1.00±0.10 0.66±0.081）0.90±0.032）0.95±0.112）BDNF 1.00±0.05 0.65±0.091）0.86±0.092）0.90±0.092）

4 討 論

中醫(yī)學(xué)將AD 歸于“呆病”“郁證”“癲證”等范疇，對(duì)于AD 不同階段的病機(jī)、治則、治法尚未達(dá)成共識(shí)。AD 主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知功能障礙，有研究發(fā)現(xiàn)AD 的基本病機(jī)為：心氣虛衰，氣不生神，為本虛；痰滯瘀阻，蒙蔽神竅為標(biāo)實(shí)。 根據(jù)“緩則治其本”“治病必求于本”的原則，從“心”入手，調(diào)心氣可以治療AD。 調(diào)心方中黨參功擅補(bǔ)心氣，安神增智為君；桂枝溫通血脈，振奮心陽為臣；石菖蒲安神益智，開竅為佐；遠(yuǎn)志通竅豁痰，增智為使。 諸藥配伍具有益心氣化痰開竅之功效［13］。 有臨床研究顯示，調(diào)心方能夠改善輕、中、重度AD 患者的認(rèn)知功能和日常生活能力，通過提高后扣帶回與腦功能區(qū)的連接，從而達(dá)到改善腦功能的作用［14］。 有基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)心方可以抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡、乙酰膽堿的水解、膠質(zhì)細(xì)胞激活、Tau 蛋白的過度磷酸化、Aβ 寡聚體的生成，減輕神經(jīng)炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激等多個(gè)靶點(diǎn)和途徑，從而達(dá)到改善AD 發(fā)生、發(fā)展的作用。 但有關(guān)于調(diào)心方是如何改善AD 患者學(xué)習(xí)記憶能力的具體作用機(jī)制還不夠明確，因此本研究嘗試基于αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路探討調(diào)心方對(duì)APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶和突觸可塑性的影響，以期為探討調(diào)心方改善AD 患者學(xué)習(xí)記憶能力的具體作用機(jī)制提供依據(jù)。

圖 3 4 組海馬區(qū) p-αCaMKⅡ，p-CREB，BDNF 和PSD-95 的蛋白條帶顯影Figure 3 Protein band development on p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

4.1 調(diào)心方能夠改善APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠海馬突觸可塑性

LTP、PPF、I／O 是突觸功能可塑性的 3 個(gè)重要電生理指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，4 組分組效應(yīng)和刺激強(qiáng)度效應(yīng)均無明顯區(qū)別；分組和刺激時(shí)間因素?zé)o明顯的交互作用；在0.1～0.7 mA 刺激強(qiáng)度下，4 組小鼠海馬 I／O 曲線斜率無明顯區(qū)別；在 50、100、200、250 ms的不同刺激間隔下，4 組PPF 易化無明顯區(qū)別。 這說明APP／PS1 小鼠海馬LTP 的損傷與基本突觸傳遞和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放無關(guān)，APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠的基本突觸傳遞效能無發(fā)生障礙，這提示6 月齡的APP／PS1 小鼠海馬LTP 的損傷與基本突觸傳遞和突觸前神經(jīng)遞質(zhì)釋放無關(guān)。 第50～60 min 的海馬fEPSP 斜率組間比較結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組小鼠fEPSP 斜率明顯降低，提示模型組小鼠海馬LTP 受損。 與模型組比較，調(diào)心方組fEPSP 斜率均明顯提高。這說明調(diào)心方可改善APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠LTP 的抑制，改善其突觸傳遞效能，從而提高突觸可塑性，改善學(xué)習(xí)記憶能力。 這與ROLLAND 等［15］發(fā)現(xiàn)突觸可塑性與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、損傷、修復(fù)及學(xué)習(xí)記憶等密切相關(guān)的研究結(jié)果一致。

圖 4 4 組海馬區(qū) p-αCaMKII，p-CREB，BDNF 和 PSD-95 的蛋白表達(dá)比較Figure 4 Comparison of p-αCaMKⅡ, p-CREB, BDNF and PSD-95 protein expression of the hippocampus in four groups

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，6 月齡的APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因 AD 小鼠海馬 PSD-95 蛋白和mRNA 表達(dá)明顯降低；與模型組比較，調(diào)心方組小鼠海馬區(qū)的PSD-95 mRNA 和蛋白表達(dá)明顯提高。這說明APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠腦內(nèi)有突觸可塑性受損的現(xiàn)象，LTP 受到抑制；經(jīng)過調(diào)心方治療后PSD-95 的蛋白活性和基因表達(dá)明顯提高，LTP 抑制得到改善，突觸可塑性提高，從而改善學(xué)習(xí)和記憶能力。 突觸后致密物在突觸可塑性中具有重要作用，PSD-95 蛋白通過與突觸后致密區(qū)多種蛋白分子的相互作用，起到了調(diào)節(jié)突觸可塑性的功能，它在LTP 的形成及維持過程、突觸可塑性、學(xué)習(xí)記憶等方面具有關(guān)鍵性的作用［16］。APP ／PS1 雙轉(zhuǎn)基因 AD小鼠海馬PSD-95 蛋白活性明顯降低，PSD-95 異常表達(dá)會(huì)導(dǎo)致LTP 受到抑制，進(jìn)而誘發(fā)突觸可塑性發(fā)生改變，使AD 小鼠出現(xiàn)依賴海馬的學(xué)習(xí)記憶功能的缺陷，這與魏鵬［17］的研究結(jié)果一致。

4.2 調(diào)心方能夠調(diào)節(jié)APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路水平

αCaMKⅡ通過Thr286 位點(diǎn)自身磷酸化成為活化狀態(tài)，它的激活是其突觸功能調(diào)節(jié)及學(xué)習(xí)記憶的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［18］，是 LTP 形成的重要介質(zhì)，對(duì)實(shí)現(xiàn)信息的儲(chǔ)存具有重要作用。 Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與CaM 結(jié)合形成Ca2+-CaM，能夠活化CaMKI，磷酸化后的αCaMKⅡ可以直接活化 CREB［19］。 CREB 是 LTP 產(chǎn)生的重要調(diào)節(jié)因子，CREB 缺失會(huì)導(dǎo)致LTP 出現(xiàn)明顯損傷［20］，它位于 133 位點(diǎn)的絲氨酸殘基（Ser133）的磷酸化對(duì)多種與學(xué)習(xí)記憶相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄起著重要作用。BDNF 是CREB 的經(jīng)典下游靶基因，其基因啟動(dòng)子區(qū)域含有CRE 序列，CREB 可與CRE 序列結(jié)合，引起 BDNF 的轉(zhuǎn)錄增加［21］，BDNF 是 LTP 和突觸傳遞重要的調(diào)節(jié)器之一，在突觸可塑性、長時(shí)記憶的形成等方面起到重要作用。

本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組海馬p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF 蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和BDNF mRNA 明顯降低，這與模型組PSD-95 表達(dá)、LTP 受到抑制的結(jié)果相互印證；與模型組比較，調(diào)心方組海馬 p-αCaMKⅡ、p-CREB、BDNF蛋白水平和 αCaMKⅡ、CREB 和 BDNF mRNA 表達(dá)明顯提高。 這提示，調(diào)心方組能有效改善APP／PS1雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路水平。 調(diào)心方可能通過激活αCaMKⅡ，上調(diào)了αCaMKⅡ的磷酸化蛋白水平及αCaMKⅡmRNA表達(dá)，進(jìn)而激活其下游的CREB，使得CREB 磷酸化水平及CREB mRNA 表達(dá)增加，促進(jìn)其下游BDNF的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成，提高 BDNF mRNA 和BDNF 蛋白表達(dá)；BDNF 表達(dá)增加可在αCaMKⅡ的翻譯過程中上調(diào)PSD-95 磷酸化水平，引起TrkB 對(duì)BDNF 的敏感性增加，從而激活 CREB-BDNF 信號(hào)通路，使突觸可塑性發(fā)生改變，提高LTP，從而改善突觸可塑性及學(xué)習(xí)記憶能力。 這與ESCOBAR 等［22-23］等研究結(jié)果一致。

5 小 結(jié)

調(diào)心方能夠改善APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠海馬CA1 區(qū) LTP、提高PSD-95 mRNA 和蛋白的表達(dá)，從而改善APP／PS1 雙轉(zhuǎn)基因AD 小鼠學(xué)習(xí)記憶功能和突觸可塑性，其作用機(jī)制可能與其上調(diào)海馬αCaMKⅡ-CREB-BDNF 信號(hào)通路水平有關(guān)。