陽和湯對兔膝骨關(guān)節(jié)炎木瓜蛋白酶模型IL-1、TNF-α 的影響

洪振強(qiáng)，高弘建，何俊君，黃澤靈

福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種以關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、功能受限甚至關(guān)節(jié)畸形、殘廢為主要表現(xiàn)的骨科常見病，目前中國已有超過 1 億 OA 患者［1］。藥物是治療骨關(guān)節(jié)炎的主要手段之一，臨床多采用非甾體抗炎藥（nonsteroidal antiinflammatory drugs，NSAIDs）等為主的西藥進(jìn)行治療，雖可暫時緩解關(guān)節(jié)疼痛、改善功能，但無法修復(fù)受損的關(guān)節(jié)軟骨、阻止OA 進(jìn)一步發(fā)展，長期服用此類藥物還會出現(xiàn)胃潰瘍、胃出血、肝腎損害等不良反應(yīng)。 中醫(yī)藥可以修復(fù)損傷的軟骨組織和細(xì)胞，從而保護(hù)關(guān)節(jié)軟骨，防治骨關(guān)節(jié)炎具有療效可靠、價格低廉、不良反應(yīng)少的特色與優(yōu)勢［2］。陽和湯源自清代王洪緒《外科證治全生集》，原為治療外科陰疽證的經(jīng)典方劑，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于內(nèi)科雜癥，特別是痹證，為攻補(bǔ)兼?zhèn)洹側(cè)嵯酀?jì)之治痹良方。 有研究表明，陽和湯治療膝骨關(guān)節(jié)炎的臨床療效明顯，可有效緩解膝關(guān)節(jié)疼痛，改善膝關(guān)節(jié)功能［3-6］。 但是，有關(guān)陽和湯防治骨關(guān)節(jié)炎具體作用機(jī)制的研究還較少，也不夠深入，值得進(jìn)一步探討。 因此，本研究通過建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎木瓜蛋白酶模型并予陽和湯灌胃，以探討陽和湯防治骨關(guān)節(jié)炎的作用及其作用機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

選擇健康新西蘭兔32 只，4～6 月齡，體質(zhì)量（2.25±0.25）kg，雌雄各半，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心代購并飼養(yǎng)［許可證號：SCXK（閩）2012-0001］。按照隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、陽和湯組、筋骨痛消丸組，每組8 只。 動物處理參照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》，并經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)動物倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 主要儀器、藥品及試劑

生物組織包埋機(jī)（湖北省宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司，BM-Ⅶ）；石蠟切片機(jī)（美國 Thermo 公司，HM315）；低溫高速離心機(jī)（美國BECKMAN 公司，64R）；酶聯(lián)免疫檢測儀（美國Biotek 公司，Elx808）；光學(xué)顯微鏡（日本 Olympus 公司，BX40）；酶標(biāo)儀（美國 Biotek 公司，Elx808）。

陽和湯由福建中醫(yī)藥大學(xué)國醫(yī)堂提供，采用清代王洪緒《外科證治全生集》原方（熟地黃30 g，鹿角膠 9 g，麻黃 2 g，白芥子 6 g，肉桂 3 g，姜炭 2 g，生甘草 3 g），煎煮后制成濃度 1 g／mL 的溶液，55 mL／劑；筋骨痛消丸（河南省洛正制藥廠，生產(chǎn)批號：Z10970117），由丹參、桂枝、香附、地黃、白芍、牛膝、秦艽等藥物組成，以蒸餾水配制成濃度1 g／mL的溶液，36 mL／盒；木瓜蛋白酶（美國 Sigma 公司，生產(chǎn)批號：107147）；兔白細(xì)胞介素-1（interleukin-1，IL-1）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：F20190）；兔腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（上海西唐生物科技有限公司，生產(chǎn)批號：F2041）；戊巴比妥鈉（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，生產(chǎn)批號：WS20060401）；0.9%NaCl 注射液（北京天壇生物制品股份有限公司）；4%多聚甲醛、EDTA 脫鈣液（上海國藥集團(tuán)）。

2 實驗方法

2.1 動物模型制備

新西蘭兔適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，除對照組外，其余各組膝關(guān)節(jié)腔注入木瓜蛋白酶造模。 選兔雙膝為手術(shù)部位，耳緣靜脈麻醉（戊巴比妥鈉，30 mg／kg）后仰臥固定，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾。 輕度彎曲兔膝關(guān)節(jié)，從關(guān)節(jié)的正中間或者關(guān)節(jié)的兩側(cè)進(jìn)針，手下出現(xiàn)落空感則表示針頭進(jìn)入了關(guān)節(jié)腔，隨后可往關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入0.5 mL 1.6 %木瓜蛋白酶生理鹽水溶液，每隔3 d 注射1 次，共注射3 次。每日定時分2 次于空曠場地驅(qū)趕，共強(qiáng)迫兔活動30 min，連續(xù)驅(qū)趕4 周。

2.2 干預(yù)方法

造模成功4 周后，參照“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”進(jìn)行換算。 筋骨痛消丸具有活血行氣、溫陽通經(jīng)、消腫止痛的作用，陽和湯與筋骨痛消丸均可有效緩解膝骨關(guān)節(jié)炎患者局部疼痛腫脹，疏利關(guān)節(jié)，臨床效果顯著。 因此本研究選擇筋骨消痛丸作為陽性對照。 陽和湯組按 6 g／（kg·d）的量給予陽和湯灌胃，筋骨痛消丸組按 6 g／（kg·d）的量給予筋骨痛消丸灌胃，以上2 組均給藥1 次／d，連續(xù)用藥5 周。 對照組、模型組常規(guī)飼養(yǎng)，無其他特殊處理。 停藥1 周后，經(jīng)腹腔麻醉后取材，耳緣靜脈空氣栓塞處死全部動物。

2.3 取材

2.3.1 取材前準(zhǔn)備 取材前12 h 動物禁食不禁水，麻醉后取材。

2.3.2 血清采集 采用腹主動脈采血法。 打開兔腹腔，分離腹主動脈，一次性采血針取血5 mL，待血液靜置分層后，低溫高速離心機(jī)（4 ℃，3 000 r／min）離心20 min，取血清，-80 ℃冰箱保存。

2.3.3 關(guān)節(jié)液采集 兔髕骨內(nèi)緣行縱行切口，由皮膚向下逐層分離至關(guān)節(jié)囊，反復(fù)屈伸關(guān)節(jié)將關(guān)節(jié)液擠壓至髕上囊內(nèi)側(cè)，輕輕劃開關(guān)節(jié)囊，注入1.5 mL生理鹽水反復(fù)抽吸后將關(guān)節(jié)液盡量抽出，低溫高速離心機(jī)（4 ℃，15 000 r／min）離心 15 min，取上清液，－80 ℃冰箱保存。

2.3.4 軟骨組織采集 切開兔膝關(guān)節(jié)囊，分離軟組織后快速切取股骨內(nèi)髁，粗修后于4%多聚甲醛中固定24 h，10% EDTA 脫鈣完全后修切，常規(guī)石蠟包埋后切片。

2.4 指標(biāo)及檢測方法

2.4.1 軟骨組織形態(tài)學(xué)觀察 取上述的軟骨組織石蠟切片，常規(guī)脫蠟后，分別進(jìn)行蘇木素-伊紅染色：蘇木素染液20 min，10%鹽酸酒精分色3 s，自來水返藍(lán)20 min，0.5%伊紅染液5 s。 染色完成后均采用95%乙醇、無水乙醇脫水，二甲苯透明，光學(xué)樹脂固封。 光鏡下對組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察及圖像采集。

2.4.2 軟骨損傷程度評價 采用 Mankin's 評分標(biāo)準(zhǔn)［7-8］評價軟骨的損傷程度。 見表 1。

表1 Mankin's 評分標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Mankin's score

2.4.3 血清及關(guān)節(jié)液中白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α 含量檢測 運用酶聯(lián)免疫吸附法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清及關(guān)節(jié)液中 IL-1、TNF-α 含量。 方法及步驟如下：按照ELISA 試劑盒的操作步驟依次操作，以酶標(biāo)儀（波長450 nm）讀取A 值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算各樣品的 IL-1、TNF-α 濃度。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié) 果

3.1 4 組實驗情況

實驗期間各給藥組新西蘭兔精神狀態(tài)好，排便、體溫和皮毛等未見異常，其體質(zhì)量、進(jìn)食量與對照組基本一致。 實驗過程動物無死亡。

3.2 4 組軟骨組織形態(tài)學(xué)比較

3.2.1 4 組軟骨組織肉眼觀察 ① 對照組：股骨內(nèi)側(cè)髁關(guān)節(jié)軟骨色澤鮮紅，表面光滑，無軟骨破壞和骨贅形成。②模型組：股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨無光澤，局部凹凸不平，可見軟骨缺損及骨贅形成。③陽和湯組：股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨表面欠光滑，可見輕微軟骨缺損和骨贅形成，其程度明顯較模型組輕。 ④筋骨痛消丸組：股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨表面欠光澤，缺損和骨贅較模型組輕。 見圖1。

圖1 肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)Figure 1 Observation of articular cartilage structure with naked eyes

3.2.2 4 組軟骨組織光鏡觀察 ① 對照組：軟骨表面光滑、完整，軟骨組織的4 層結(jié)構(gòu)（表淺層、移行層、輻射層、鈣化層）分層清晰，軟骨細(xì)胞成柱狀排列，分布均勻，潮線清晰完整。 ② 模型組：軟骨表面不光滑，出現(xiàn)多個裂隙及缺損，軟骨結(jié)構(gòu)分層不清，且細(xì)胞數(shù)量減少、分布不均勻，可見細(xì)胞簇集，潮線紊亂消失。③陽和湯組：軟骨表面較光滑，軟骨細(xì)胞比模型組排列整齊，軟骨細(xì)胞增多，可見少量軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線較模型組清晰、完整。④筋骨痛消丸組：軟骨表面光滑，細(xì)胞排列尚整齊，可見軟骨細(xì)胞簇集現(xiàn)象，潮線清晰、完整程度較模型組好。

圖2 光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨病理顯微結(jié)構(gòu)（石蠟切片-HE 染色）（×100）Figure 2 Observation of pathological microstructure of articular cartilage by light microscopy（Paraffin-HE staining）（×100）

3.3 4 組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變Mankin’s 評分比較

見表2。

3.4 4 組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α比較

見表3。

4 討 論

4.1 陽和湯能有效修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷

骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、活動受限甚至關(guān)節(jié)畸形為臨床癥狀，以關(guān)節(jié)軟骨退變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為病理特點。 木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)內(nèi)注射動物模型與人類骨關(guān)節(jié)炎類似［9］，呈現(xiàn)出早期骨關(guān)節(jié)炎的病理改變。 本研究運用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)內(nèi)注射法建立兔骨關(guān)節(jié)炎模型，采用蘇木素-伊紅染色方法在光鏡下觀察軟骨組織，軟骨形態(tài)學(xué)及Mankin's 評分結(jié)果顯示，模型組的軟骨表面出現(xiàn)多個裂隙及缺損，軟骨結(jié)構(gòu)分層不清，且細(xì)胞數(shù)量減少、分布不均勻，可見細(xì)胞簇集，潮線紊亂消失，與對照組比較Mankin's評分明顯升高。 而經(jīng)過陽和湯干預(yù)后，兔膝關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)及Mankin's 評分均明顯改善，這表明陽和湯能有效修復(fù)骨關(guān)節(jié)炎的軟骨損傷。

表2 4 組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變Mankin's 評分比較（）Table 2 Comparison of Mankin's score in morphological change of articular cartilage in four groups （）

表2 4 組關(guān)節(jié)軟骨形態(tài)學(xué)改變Mankin's 評分比較（）Table 2 Comparison of Mankin's score in morphological change of articular cartilage in four groups （）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

Mankin's 評分0.47±0.03 8.41±0.071）5.38±0.062）5.43±0.052）組別對照組模型組筋骨痛消丸組陽和湯組n 8 8 8 8

表 3 4 組血清及關(guān)節(jié)液中 IL-1、TNF-α 比較（）Table 3 Comparison of IL-1 and TNF-α in serum and articular fluid in four groups（）

表 3 4 組血清及關(guān)節(jié)液中 IL-1、TNF-α 比較（）Table 3 Comparison of IL-1 and TNF-α in serum and articular fluid in four groups（）

注：與對照組比較，1） P＜0.05；與模型組比較，2） P＜0.05。Note: Compared with the control group, 1) P＜0.05; Compared with the model group, 2) P＜0.05.

血清 關(guān)節(jié)液IL-1 55.06±1.02 86.27±1.271）67.30±1.482）64.67±1.072）組別對照組模型組筋骨痛消丸組陽和湯組n 8 8 8 8 TNF-α 71.22±0.68 92.39±0.611）66.29±0.712）69.26±0.392）IL-1 5.86±0.34 31.71±1.011）19.03±0.272）19.59±0.592）TNF-α 3.93±0.17 49.07±1.341）31.10±0.442）30.35±0.602）

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇，“本”乃肝腎虧虛、正氣不足，“標(biāo)”乃風(fēng)、寒、濕邪、血虛寒凝［10］。 因此，骨關(guān)節(jié)炎的治療應(yīng)遵循“急則治痹痛，緩則補(bǔ)肝腎、益氣血”的原則，并隨風(fēng)寒濕痰隨證加減［11］。 陽和湯方中熟地黃溫補(bǔ)營血，鹿角膠溫陽、益精血，二藥合用，溫陽補(bǔ)血；姜炭、肉桂藥性辛熱，共奏溫陽散寒、溫通血脈之功；白芥子辛溫，可達(dá)皮里膜外，溫化寒痰，通絡(luò)散結(jié)；麻黃辛溫達(dá)衛(wèi)，宣通毛竅，開腠理，散寒凝；甘草解毒而調(diào)和諸藥。 可見，陽和湯堪為攻補(bǔ)兼?zhèn)洹側(cè)嵯酀?jì)之治痹良方。

4.2 陽和湯能有效調(diào)控IL-1、TNF-α等炎性因子

骨關(guān)節(jié)炎以關(guān)節(jié)軟骨破壞和骨重建為特征，其發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究發(fā)現(xiàn)涉及多因素、多機(jī)制、多環(huán)節(jié)。其中，有研究顯示IL-1、TNF-α 與骨關(guān)節(jié)炎關(guān)系密切［12-13］，這些炎性因子在骨關(guān)節(jié)炎患者中明顯升高［14-15］，與骨關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)［16-17］，是骨關(guān)節(jié)炎重要的致病因素，可多方位介導(dǎo)關(guān)節(jié)軟骨退變，導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨破壞［18-19］。

本研究運用ELISA 法檢測血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α 含量，結(jié)果表明模型組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α 的表達(dá)與對照組比較明顯升高，而陽和湯組血清及關(guān)節(jié)液中IL-1、TNF-α 的表達(dá)較模型組比較明顯降低，這提示陽和湯能夠調(diào)控IL-1、TNF-α 等炎性因子，促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎患者損傷的軟骨組織修復(fù)。

5 小 結(jié)

陽和湯可促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)，延緩關(guān)節(jié)軟骨退變，其作用機(jī)制可能與抑制IL-1、TNF-α 這些炎性因子的表達(dá)有關(guān)。