高良姜素對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制

李 程， 張惠文， 容鵬飛

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院 放射科， 長(zhǎng)沙 410013

肝細(xì)胞癌(以下簡(jiǎn)稱(chēng)肝癌)是全球范圍內(nèi)常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，居全部惡性腫瘤死亡率第4位[1]。其治療手段包括手術(shù)切除及肝移植、肝動(dòng)脈化療栓塞術(shù)、放療、靶向治療和免疫檢查點(diǎn)抑制劑等，然而迄今為止每種方法的療效均有局限性且預(yù)后欠佳，因此，臨床上有必要尋找治療肝癌的新方法，以提高患者治療后的生存率，克服現(xiàn)有肝癌的臨床治療瓶頸。

高良姜素是姜科植物高良姜根中的提取物，其主要化學(xué)成分為黃酮，是一種多元酚化合物[2]。相關(guān)研究[3-5]證實(shí)，高良姜素能夠在一定程度上抑制腫瘤細(xì)胞的活性，對(duì)機(jī)體形成保護(hù)，修復(fù)相關(guān)致癌因素所導(dǎo)致的細(xì)胞損傷，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移。近期研究表明，其對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制作用較好。其機(jī)制主要與抑制增殖[6-8]、促進(jìn)凋亡[9-16]、誘導(dǎo)自噬[17-21]和抑制轉(zhuǎn)移[22-23]有關(guān)。在此，簡(jiǎn)要回顧已證實(shí)的高良姜素對(duì)肝癌細(xì)胞抑制作用的機(jī)制(圖1)，并對(duì)未來(lái)可能的研究方向作出展望。

1 抑制肝癌細(xì)胞增殖

糖酵解對(duì)肝癌細(xì)胞的代謝和增殖作用至關(guān)重要。在氧氣充足的情況下，正常細(xì)胞的糖酵解活性被抑制，而腫瘤細(xì)胞的糖酵解仍活躍，這種有氧糖酵解的代謝特征稱(chēng)為Warburg效應(yīng)，在此過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞更多的攝取葡萄糖，并將其轉(zhuǎn)化為乳酸。Warburg效應(yīng)能夠幫助肝癌細(xì)胞適應(yīng)腫瘤代謝中增高的能量需求，有利于肝癌細(xì)胞在血供相對(duì)不足的狀態(tài)下繼續(xù)生存并促進(jìn)局部的肝癌細(xì)胞增殖[6]。有文獻(xiàn)[7]報(bào)道，高良姜素在65、130和260 μmol/L濃度下分別抑制HepG2、HepB3和PLC/PRF/5肝癌細(xì)胞的增殖，其是通過(guò)逆轉(zhuǎn)Warburg效應(yīng)所實(shí)現(xiàn)。丙酮酸激酶是糖酵解最后一步的關(guān)鍵酶，它不可逆地催化磷酸烯醇丙酮酸生成烯醇式丙酮酸，其包括兩種亞型，即丙酮酸激酶同工酶M1(PKM1)和M2 (PKM2)。PKM2通常在癌細(xì)胞中表達(dá)，參與糖酵解和細(xì)胞增殖，幫助腫瘤適應(yīng)營(yíng)養(yǎng)環(huán)境的變化。PKM2有高酶活性和低酶活性?xún)煞N狀態(tài)，低活性者在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化時(shí)升高，致乳酸產(chǎn)量增多、耗氧量減少。在高良姜素處理的肝癌細(xì)胞中，丙酮酸激酶活性顯著增加，PKM2表達(dá)下調(diào)，而PKM1表達(dá)上調(diào)，同時(shí)乳酸產(chǎn)量降低，耗氧量增加，糖酵解受到抑制。

β-catenin是一種細(xì)胞間黏附蛋白，它在細(xì)胞形態(tài)和分化、運(yùn)動(dòng)和遷移、增殖和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用。β-catenin參與人體軸向發(fā)育以及各器官的成熟過(guò)程。2011年Gwak等[8]發(fā)現(xiàn)高良姜素通過(guò)促進(jìn)β-catenin降解，使肝癌細(xì)胞停滯在細(xì)胞周期的G0/G1期，從而抑制了細(xì)胞增殖，該研究報(bào)道進(jìn)一步證實(shí)了高良姜素通過(guò)促進(jìn)肝癌細(xì)胞內(nèi)β-catenin蛋白降解而產(chǎn)生了抑癌作用。

2 促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡是指細(xì)胞發(fā)生自身程序性死亡的過(guò)程，其主要特征有線粒體發(fā)生功能性障礙、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激以及細(xì)胞周期阻滯等，其形態(tài)學(xué)特征為膜泡化、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核收縮、染色質(zhì)凝結(jié)、DNA片段化和凋亡體形成[9]。而高良姜素誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡的主要機(jī)制可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體依賴(lài)凋亡途徑等因素有關(guān)。

2.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是一個(gè)游離鈣離子(Ca2+)池，是蛋白質(zhì)折疊和組裝的特殊位點(diǎn)，各種生理和病理刺激，例如細(xì)胞缺氧、氧化應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞DNA損傷、營(yíng)養(yǎng)不良等均會(huì)激活未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[10]。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白在誘導(dǎo)凋亡中起關(guān)鍵作用，包括C/EBP同源蛋白質(zhì)(C/EBP homologous protein，CHOP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(glucose-regulating protein，GRP)家族中的GRP78、GRP94，后者是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分子伴侶，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)降解。高良姜素可抑制肝癌細(xì)胞中的鈣通道，使得細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的游離Ca2+濃度增高，進(jìn)而引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白CHOP、GRP78、GRP94水平升高，而這三種蛋白的升高又使胞質(zhì)游離Ca2+濃度進(jìn)一步增加。高良姜素還促使絲裂原活化蛋白激酶磷酸化，亦會(huì)提升胞質(zhì)內(nèi)游離的Ca2+濃度，這些機(jī)制最終促成了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，使得如HepG2/G3等肝癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。

2.2 線粒體依賴(lài)途徑 線粒體作為細(xì)胞的能量工廠，其氧化磷酸化的順利進(jìn)行取決于線粒體膜電位水平是否正常。Bcl-2蛋白家族控制線粒體外膜透化，分為促凋亡蛋白(Bax、Bad和Bid等)或抗凋亡蛋白(包括Bcl-2本身和Bcl-XL等)，前者可通過(guò)線粒體依賴(lài)途徑引起線粒體通透性增加，誘導(dǎo)凋亡；后者則可以阻止這些線粒體事件的發(fā)生。細(xì)胞色素C由Bax基因調(diào)控，與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合后，構(gòu)象發(fā)生改變，形成凋亡復(fù)合體，隨后招募胞質(zhì)中的procaspase-9發(fā)生自切割活化，成為caspase-9，再激活caspase-3。最終多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶被caspase-3裂解，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡[12]。高良姜素是一種強(qiáng)親脂性化合物，可直接進(jìn)入肝癌細(xì)胞，降低線粒體膜電位，增加膜通透性，促使細(xì)胞色素c從線粒體向細(xì)胞質(zhì)釋放，導(dǎo)致促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白在線粒體膜上發(fā)生移位，增加促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例。

腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體是一種潛在的具有抗腫瘤效應(yīng)的蛋白質(zhì)，最近被認(rèn)為是肝癌的潛在治療靶點(diǎn)，其原因在于該配體對(duì)細(xì)胞凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)具有重要的影響[13]。死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體亦參與細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它是由Fas分子的胞內(nèi)段死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合Fas相關(guān)的死亡域蛋白(Fas associated death domain protein，F(xiàn)ADD)，再與procaspase-8結(jié)合構(gòu)成，即由Fas/FADD/procaspase-8組成的復(fù)合體。Zhang等[14]發(fā)現(xiàn)，高良姜素可通過(guò)與腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體結(jié)合，并和死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體相互作用，激活凋亡相關(guān)蛋白caspase-8，切割Bid形成具有活性的截短Bid，后者轉(zhuǎn)移進(jìn)入線粒體，導(dǎo)致細(xì)胞色素c的釋放，最終誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

磷酸酶及張力蛋白同源物(phosphate and tension homology deleted on chromsometen，PTEN)是一類(lèi)磷酸酶活性物質(zhì)，具有一定的腫瘤抑制作用，在肝癌細(xì)胞中可能是失活的，也可能是突變的[15]?，F(xiàn)有研究[16]已經(jīng)證實(shí)，高良姜素可以激活PTEN并使之表達(dá)上調(diào)，從而抑制磷脂酰肌醇3-激酶的活性，降低細(xì)胞內(nèi)AKT的磷酸化水平，最終誘導(dǎo)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞凋亡。

3 誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞自噬

細(xì)胞自噬可理解為細(xì)胞自我吞噬，是指在溶酶體作用下發(fā)生細(xì)胞自我降解的過(guò)程，也是受損、功能障礙或多余細(xì)胞器和蛋白質(zhì)被隔離、吞噬并回收，以維持細(xì)胞代謝、生存能力和穩(wěn)態(tài)的過(guò)程[17]。

TGFβ/JNK或TGFβ/Smad通路在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和遷移中起重要作用。Wang等[18]發(fā)現(xiàn)，高良姜素可以增加TGFβ受體(包括受體R1和受體R2)的水平，從而使JNK磷酸化或受體調(diào)節(jié)型Smads(包括Smad1～4)的水平進(jìn)一步升高，但導(dǎo)致抑制型Smads(包括Smad6、7)的水平降低，隨后參與細(xì)胞自噬的Beclin1蛋白水平增加。Beclin1又稱(chēng)細(xì)胞自噬相關(guān)基因6(autophagy-related gene 6，ATG6)。 Beclin1、ATG16、ATG12與高良姜素誘導(dǎo)的Bcl-XL水平升高和Bcl-2水平降低相互作用，然后和ATG5相結(jié)合，促進(jìn)自噬泡形成，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。

高良姜素通過(guò)增加單磷酸腺苷占總腺苷核苷酸的比例，進(jìn)一步增加單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)磷酸化，抑制AKT和mTOR的磷酸化，從而促進(jìn)HepG2細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞自噬[19]。

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3)又稱(chēng)為ATG8，它結(jié)合磷脂酰乙醇胺脂質(zhì)化并插入自噬泡膜中，促使自噬泡形成并與溶酶體融合，而該過(guò)程離不開(kāi)沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)的調(diào)控，SIRT1是一種組蛋白去乙酰化酶[20]，其對(duì)LC3的脫乙?；饔檬荓C3脂質(zhì)化并參與自噬泡形成的前提。高良姜素通過(guò)AMPK/SIRT1信號(hào)通路或ATG5、ATG7和ATG8去乙酰化上調(diào)SIRT1的表達(dá)，增強(qiáng)了SIRT1對(duì)LC3的脫乙?；饔?，從而誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞自噬[21]。

p53基因是一種重要的抑癌基因。有文獻(xiàn)[22]稱(chēng)，在HepG2和Hep3B這兩類(lèi)細(xì)胞中，低濃度的高良姜素(130 μmol/L)上調(diào)p53的表達(dá)誘導(dǎo)自噬。

4 抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的過(guò)程包括基質(zhì)金屬蛋白酶(主要是MMP2和MMP9)、細(xì)胞外基質(zhì)降解蛋白對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的局部降解，腫瘤組織浸潤(rùn)基質(zhì)和進(jìn)入血管，最后遷移、外滲及侵襲[23]。

高良姜素對(duì)咐醇酯誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞黏附、浸潤(rùn)和遷移具有抑制作用。高良姜素能夠?qū)Ω来减ニT導(dǎo)產(chǎn)生的蛋白激酶C起到顯著的抑制作用，誘導(dǎo)細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1/2產(chǎn)生相應(yīng)的磷酸化抑制效應(yīng)，進(jìn)而抑制核因子-κB和激活蛋白-1與MMP2/MMP9啟動(dòng)子的結(jié)合能力，從而抑制其轉(zhuǎn)錄過(guò)程，降低MMP2和MMP9的活性與表達(dá)，最終抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[24]。

5 展望

惡性腫瘤及其癌旁組織局部新生成的血管有助于向腫瘤組織輸送氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此，抑制惡性腫瘤局部新生血管形成成為惡性腫瘤臨床治療的熱點(diǎn)，同時(shí)也是難點(diǎn)。根據(jù)以往的文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤組織的血管生成與細(xì)胞外因子相關(guān)，其中報(bào)道最多的為血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，其作用機(jī)制包括促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生成與增殖、遷移與形成血管的作用，同時(shí)它還有助于內(nèi)皮細(xì)胞的局部浸潤(rùn)，通過(guò)以上作用機(jī)制促進(jìn)腫瘤局部的新生血管形成[25]。高良姜素的抗血管生成作用已經(jīng)在卵巢癌細(xì)胞中得到證實(shí)[26]，盡管血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子在肝癌細(xì)胞內(nèi)亦存在高表達(dá)[27]，但目前高良姜素是否對(duì)肝癌細(xì)胞具有抗血管生成作用尚不明確，期待更多此方面的研究成果。

癌細(xì)胞在一定程度上具有耐藥性，能夠耐受多種藥物，被研究者稱(chēng)為多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)。MDR會(huì)導(dǎo)致癌癥的化療及其他治療方法療效減弱。在人類(lèi)癌細(xì)胞中存在著多種多藥耐藥蛋白，最主要的有3種，分別是乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein，BCRP)、P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)以及多藥耐藥蛋白1。最新研究[28]表明，一些植物、食品和草藥中含量豐富的黃酮類(lèi)化合物例如高良姜素有助于逆轉(zhuǎn)MDR，其機(jī)制可能是高良姜素可作為一種多功能的調(diào)節(jié)劑，對(duì)導(dǎo)致MDR的關(guān)鍵因素發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。2019年，Zhu等[29]研究發(fā)現(xiàn)該類(lèi)化合物的衍生物三唑橋聯(lián)類(lèi)黃酮二聚體能夠?qū)θ橄侔┮种频鞍?ATP酶的活性產(chǎn)生一定的抑制作用，通過(guò)阻斷BCRP的藥物外排活性、提高細(xì)胞內(nèi)藥物蓄積的作用，最終恢復(fù)BCRP過(guò)表達(dá)細(xì)胞的藥物敏感性。因此，現(xiàn)有的證據(jù)表明，高良姜素及其衍生物在逆轉(zhuǎn)臨床MDR方面具有潛在的臨床應(yīng)用前景，期待更多的研究聚焦于此。

高良姜素聯(lián)合黃連素可通過(guò)增加活性氧誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞周期，從而抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，且在體內(nèi)外均無(wú)明顯毒性[30]。此外，低濃度的高良姜素聯(lián)合順鉑可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，即使在對(duì)順鉑具有耐藥性的細(xì)胞中亦是如此[31]。這說(shuō)明高良姜素與其他抗癌藥物聯(lián)合用于逆轉(zhuǎn)MDR可能更為有效。然而，迄今為止尚未有高良姜素與其他藥物聯(lián)合作用于肝癌細(xì)胞的報(bào)道，期待此方面更多的研究。

高良姜素的臨床應(yīng)用仍有一定的局限性，其中最為突出的問(wèn)題是難以溶于水，使得高良姜素在人體內(nèi)代謝速度快，難以被人體吸收，從而限制了其在臨床應(yīng)用推廣。為克服此問(wèn)題，Patil等[32]制備了肝靶向高良姜素半乳糖基化Pluronic F68聚合物膠束，從而降低了其在體內(nèi)的代謝速度，提高了肝內(nèi)高良姜素的濃度，從而延長(zhǎng)了高良姜素在肝內(nèi)的消除時(shí)間，該研究促進(jìn)了高良姜素臨床治療應(yīng)用的轉(zhuǎn)化，并使之成為可能。

6 小結(jié)

高良姜素是一種新的抗癌候選藥物，其抑制肝癌細(xì)胞的作用機(jī)理主要在于逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞的Warburg效應(yīng)，并讓其細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，發(fā)揮抗增殖作用；通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和線粒體依賴(lài)性凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；誘導(dǎo)自噬、抑制肝癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。目前高良姜素在抑制肝癌血管生成、克服MDR以及與其他藥物聯(lián)用方面的研究較少。此外，其在體內(nèi)代謝迅速，生物利用度低，因此，高良姜素的修飾、相關(guān)衍生物的合成、制備納米載藥系統(tǒng)是非常重要的降低代謝速度、提高生物利用度的方法。再者，目前有關(guān)高良姜素對(duì)肝癌細(xì)胞作用的研究多集中于細(xì)胞及動(dòng)物模型水平，需在臨床試驗(yàn)中對(duì)其療程、副作用和預(yù)后做全面研究，以便考慮是否可以將高良姜素作為臨床抗肝癌藥物。

作者貢獻(xiàn)聲明：李程負(fù)責(zé)分析資料，擬定思路，撰寫(xiě)論文；張惠文負(fù)責(zé)收集資料，參與修改論文；容鵬飛負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。