microRNA在膽囊癌中的作用

成亞飛， 王 斌， 王世明

1 山西醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 太原 030001； 2 山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院 肝膽胰外科， 太原 030001

膽囊癌是最常見的膽道系統(tǒng)惡性腫瘤，占膽道系統(tǒng)惡性腫瘤的80%～85%[1]，發(fā)病率在消化道腫瘤中排第6位[2]。根治性手術(shù)切除是臨床治愈膽囊癌的唯一方式，但因其具有發(fā)病隱匿、臨床癥狀不典型、早期診斷率較低等特點[3]，導(dǎo)致臨床80%以上的患者診斷時已屬中晚期，手術(shù)治療效果不容樂觀。雖然輔助放療、化療等[4]治療方式對膽囊癌有一定幫助，但患者總體預(yù)后仍較差，5年生存率不足5%[5]。因此，提高對膽囊癌的早期診斷及治療效果顯得尤為重要。近些年隨著對microRNA(miRNA)在腫瘤中作用的研究逐漸增多，發(fā)現(xiàn)其在膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、化療耐藥、早期診斷中扮演了重要的角色[6]，為膽囊癌早期診斷及治療提供了新的方向。

1 miRNA的概述

miRNA是一類廣泛存在于真核生物體內(nèi)的內(nèi)源性非編碼小分子RNA。成熟的miRNA由20～25個核苷酸序列組成，其形成過程包括以下幾點：(1)首先在細胞核中，在RNA聚合酶Ⅱ作用下形成較長的具有莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的pri-miRNA；(2)pri-miRNA在RNaseⅢ Drosha酶作用下形成核苷酸序列為60～70個具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的pre-miRNA；(3)pre-miRNA被轉(zhuǎn)運蛋白Exportin-5轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)；(4)在細胞質(zhì)中，pre-miRNA在RNaseⅢ Dicer酶作用下形成20～25個核苷酸序列的雙鏈miRNA；(5)雙鏈miRNA在解螺旋酶的催化下形成兩條單鏈miRNA，其中一條被降解，另一條成為成熟的miRNA[7]。成熟的miRNA通過堿基互補配對原則與mRNA 3′-UTR非特異性結(jié)合，進而抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后翻譯或?qū)е耺RNA轉(zhuǎn)錄后降解，由此調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后基因水平的表達，廣泛參與了真核生物細胞、組織的生長發(fā)育、衰老、死亡等過程[8]。

2 在膽囊癌中發(fā)揮促癌作用的miRNA

2.1 miRNA-182 Qiu等[9]研究發(fā)現(xiàn)，與正常膽囊組織相比，膽囊癌組織中miRNA-182水平顯著升高；與非轉(zhuǎn)移膽囊癌組織相比，轉(zhuǎn)移的原發(fā)膽囊癌組織中miRNA-182的表達亦明顯升高。此外還證實TGFβ可誘導(dǎo)膽囊癌細胞miRNA-182的表達，在阻斷miRNA-182的表達后，TGFβ誘導(dǎo)癌細胞遷移和侵襲的作用減弱，并且有效抑制了體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移。進一步研究發(fā)現(xiàn)，細胞黏附分子1(CADM1)是miRNA-182的靶基因，CADM1的表達水平與miRNA-182呈負相關(guān)，在膽囊癌細胞中CADM1的重新表達減弱了miRNA-182誘導(dǎo)的細胞侵襲。這些結(jié)果表明TGFβ介導(dǎo)的miRNA-182/CADM1軸的激活在膽囊癌的遷移和侵襲中發(fā)揮了重要作用，miRNA-182高表達可作為膽囊癌侵襲和遷移的潛在標(biāo)志物，并且有望成為膽囊癌治療的一個潛在分子靶點。

2.2 miRNA-181b-3p 上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-tomesenchymal transition, EMT)被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的重要原因[10]。E-鈣黏蛋白等細胞黏附分子表達的減少以及細胞角蛋白細胞骨架轉(zhuǎn)化為波形蛋白為主的細胞骨架是EMT過程的顯著特征[11]。何政等[12]研究顯示，與膽囊癌旁正常組織內(nèi)miRNA-181b-3p的表達相比，膽囊癌中miRNA-181b-3p表達上調(diào)。體外細胞學(xué)研究證實過表達的miRNA-181b-3p促進了膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移，而下調(diào)則降低了膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力；進一步研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌細胞中miRNA-181b-3p與E-鈣黏蛋白呈負相關(guān)?；谝陨涎芯刻崾荆琺iRNA-181b-3p促進膽囊癌的侵襲轉(zhuǎn)移可能通過促進EMT過程而實現(xiàn)。

2.3 miRNA-20a Chang等[13]通過高內(nèi)涵篩選，從880個miRNA中篩選出17個膽囊癌主要轉(zhuǎn)移誘導(dǎo)因子；在臨床病例隨訪中發(fā)現(xiàn)，miRNA-20a表達上調(diào)與局部浸潤、遠處轉(zhuǎn)移及預(yù)后不良密切相關(guān)，miRNA-20a高表達組的總生存期低于低表達組。隨后其采用RT-PCR、免疫印跡、免疫組化、原位雜交等方法對miRNA-20a的生物學(xué)功能進行了深入的研究，結(jié)果證實：(1)miRNA-20a水平升高與膽囊癌細胞TGFβ1水平升高有關(guān)；(2)miRNA-20a的異位表達可直接靶向Smad7的3′-UTR，促進β-連環(huán)蛋白(β-catenin)的核移位，誘導(dǎo)膽囊癌細胞在體內(nèi)外的EMT過程，從而促進膽囊癌細胞的增殖和侵襲；相反，阻斷miRNA-20a的表達能有效地恢復(fù)Smad7的表達，減弱TGFβ1誘導(dǎo)的細胞轉(zhuǎn)移。該研究結(jié)果表明，TGFβ1介導(dǎo)的miRNA-20a/Smad7/β-catenin軸的激活在膽囊癌的發(fā)病機制和預(yù)后方面起著關(guān)鍵性的作用。

2.4 miRNA-155 大量研究[14-16]表明，miRNA-155在人多種實體腫瘤中起到了原癌基因的作用，膽囊癌也不例外。Kono等[17]發(fā)現(xiàn)，miRNA-155的高表達與膽囊癌的侵襲行為有關(guān)，阻斷miRNA-155表達，則使得膽囊癌細胞增殖和侵襲性減弱。在膽囊癌miRNA-155表達水平與臨床病理特征關(guān)系的研究[18]中發(fā)現(xiàn)，miRNA-155的高表達與TNM分期、淋巴結(jié)狀態(tài)、肝轉(zhuǎn)移、分化程度顯著相關(guān)。Kaplan-Meier生存分析表明，高表達miRNA-155的膽囊癌患者5年生存率明顯低于低表達者。這些發(fā)現(xiàn)均提示miRNA-155在膽囊癌發(fā)展過程中起到了促進作用，對miRNA-155水平的調(diào)節(jié)可能會被應(yīng)用于膽囊癌的治療，故其可作為判斷膽囊癌預(yù)后的預(yù)測因子及治療靶標(biāo)。

3 在膽囊癌中發(fā)揮抑癌作用的miRNA

3.1 miRNA-34a miRNA-34a在人多種腫瘤中表達下調(diào)。Jin等[19]研究發(fā)現(xiàn)與正常膽囊組織相比，膽囊癌組織miRNA-34a表達明顯下調(diào)，端粒長度延長。在CD44+CD133+膽囊癌干細胞和異種移植瘤模型中，注射腺病毒介導(dǎo)的miRNA-34a可抑制CD44+CD133+膽囊癌干細胞體外集落形成能力和異種移植瘤體內(nèi)生長，并同時降低移植瘤細胞蛋白磷酸酶1核目標(biāo)亞基(PNUTS)的表達和端粒長度，而在異種移植瘤模型中，PNUTS是一種端?？s短的蛋白。故miRNA-34a低表達和端粒長是膽囊癌預(yù)后不良的標(biāo)志。

3.2 miRNA-335 Peng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-335在大多數(shù)膽囊癌細胞中表達下調(diào)，低表達的miRNA-335與膽囊癌的高組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性、臨床分期相關(guān)，單因素分析表明，miRNA-335低表達是影響膽囊癌患者總生存率的重要因素，進一步的多因素分析同樣證實了上述結(jié)果。Fatima等[21]采用Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miRNA-335低表達顯著影響了膽囊癌患者中位生存期(7個月 vs 25個月)。這些結(jié)果說明，miRNA-335的表達下調(diào)與疾病的嚴(yán)重程度有關(guān)，即miRNA-335低表達時可以作為膽囊癌患者預(yù)后不良的標(biāo)志。

3.3 miRNA-135a-5p、miRNA-26a Zhou等[22]首次報道了miRNA-135a-5p、miRNA-26a在膽囊癌組織中下調(diào)，并通過應(yīng)用CCK-8檢測方法證實二者下調(diào)對膽囊癌細胞增殖有顯著影響。另外，miRNA-135a-5p可直接靶向作用于極低密度脂蛋白受體(VLDLR)，進一步研究表明p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路參與miRNA-135a-5p/VLDLR下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。更重要的是p38抑制劑預(yù)處理后，miRNA-135a-5p誘導(dǎo)的對膽囊癌細胞增殖的抑制作用消失。此外miRNA-135a-5p誘導(dǎo)的G1/S期阻滯也可以被p38抑制劑阻斷。這些結(jié)果提示，miRNA-135a-5p/VLDLR/p38 MAPK軸可能有助于膽囊癌細胞增殖。Zhou等[23]在隨后的一項研究中發(fā)現(xiàn)，高遷移率蛋白A2 mRNA(HMGA2 mRNA)的3′-UTR是miRNA-26a的直接靶點，高水平miRNA-26a抑制HMGA2的表達，進而抑制膽囊癌細胞增殖，當(dāng)HMGA2重新表達時，miRNA-26a對膽囊癌細胞增殖的抑制作用則減弱。以上研究表明，miRNA-135a-5p、miRNA-26a有望成為膽囊癌患者的預(yù)后參考因素和治療靶點。

3.4 miRNA-146b-5p Cai等[24]研究表明miRNA-146b-5p的表達水平與腫瘤大小和發(fā)展密切相關(guān)，與膽囊癌旁正常組織相比，miRNA-146b-5p在膽囊癌組織中的表達明顯降低。miRNA-146b-5p在SGC-996人膽囊癌細胞中的過表達通過增強細胞凋亡和G1期阻滯抑制細胞生長。此外，表皮生長因子受體(EGFR)的強表達逆轉(zhuǎn)了miRNA-146b-5p的增殖抑制能力，提示EGFR是miRNA-146b-5p在膽囊癌中的生物學(xué)效應(yīng)介導(dǎo)因子。Lv等[25]收集了150對膽囊癌患者及周圍正常組織標(biāo)本，通過檢測發(fā)現(xiàn)，與鄰近正常組織相比，miRNA-146b-5p在膽囊癌組織中的表達降低，采用Kaplan-Meier生存分析顯示，miRNA-146b-5p高表達的膽囊癌患者總體生存率高于miRNA-146b-5p低表達的患者。在進一步的單因素和多因素分析中證實miRNA-146b-5p的表達增加是膽囊癌患者預(yù)后良好的獨立預(yù)測指標(biāo)。

3.5 miRNA-218-5p 結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(CCAT-1)是一種長鏈非編碼RNA，該基因除了在結(jié)腸癌中高表達外，在其他實體瘤中也可表達上調(diào)，如膽囊癌[26]。Ma等[27]在研究中發(fā)現(xiàn)高表達的CCAT-1可通過充當(dāng)“miRNA海綿”降低miRNA-218-5p有效性，干擾miRNA-218-5p介導(dǎo)靶基因Bmi-1基因下調(diào)，進而促進膽囊癌細胞的增殖和侵襲能力。以上結(jié)果提示，在膽囊癌中CCAT-1的促癌作用可能部分是通過負向調(diào)控miRNA-218-5p而實現(xiàn)，二者可作為膽囊癌治療的靶標(biāo)。

3.6 miRNA-145-5p miRNA-145-5p在人多種腫瘤中表達異常。研究[28]發(fā)現(xiàn)，與正常膽囊組織相比，膽囊癌中miRNA-145-5p表達明顯降低。在體外細胞學(xué)研究證實miRNA-145-5p的過度表達顯著降低了細胞增殖和菌落形成。miRNA-145-5p在膽囊癌細胞中特異性地激活了信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子1(STAT1)，通過對轉(zhuǎn)染miRNA-145-5p-mimics細胞的基因表達分析顯示，STAT1信號通路的激活主要是抑癌作用。故miRNA-145-5p通過激活STAT1而影響膽囊癌的相關(guān)特性。

3.7 miRNA-139-5p Chen等[29]研究發(fā)現(xiàn)miRNA-139-5p在膽囊癌中異常下調(diào)，miR-139-5p的低表達與不良臨床結(jié)局顯著相關(guān)。miRNA-139-5p的過度表達可抑制膽囊癌細胞的增殖、遷移和侵襲。體外實驗證實丙酮酸激酶M2(PKM2)是miRNA-139-5p的直接靶點。另外，在異種移植小鼠模型中，miRNA-139-5p的過度表達可直接抑制PKM2的表達，進而導(dǎo)致葡萄糖消耗、乳酸生成和抑制細胞ATP水平。進一步研究發(fā)現(xiàn)PKM2在膽囊癌中經(jīng)常上調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)。這些結(jié)果表明，miRNA-139-5p在膽囊癌中通過靶向作用于PKM2發(fā)揮抗癌作用，可作為膽囊癌預(yù)后預(yù)測因子和治療靶標(biāo)。

3.8 miRNA-143-3p 血管生成對惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展起著關(guān)鍵作用，不僅可以為腫瘤的生長提供充足的養(yǎng)分，還可以促進腫瘤的轉(zhuǎn)移[30]。Jin等[31]研究發(fā)現(xiàn)，與腫瘤鄰近正常組織相比，miRNA-143-3p在膽囊癌組織中表達水平有所下降。過表達的miRNA-143-3p在體內(nèi)外抑制了腫瘤血管的生成。進一步研究顯示，整合素α6(ITGA6)是miRNA-143-3p的直接靶基因，而過表達miRNA-143-3p后，胎盤生長因子(PLGF)表達明顯下調(diào)。以上結(jié)果表明，miRNA-143-3p通過ITGA6/PLGF途徑影響腫瘤血管生成進而影響膽囊癌生長，故miRNA-143-3p可能成為一種新的膽囊癌分子治療靶點。

3.9 miRNA-29c-5p、miRNA-29c-3p Shu等[32]證實miRNA-29c-5p在膽囊癌中的表達明顯下調(diào)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。在體外實驗證實，miRNA-29c-5p的異位表達顯著抑制腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、集落形成和誘導(dǎo)細胞凋亡。進一步研究發(fā)現(xiàn)，胞質(zhì)多聚腺苷酸化原件組合蛋白4(CPEB4)是miRNA-29c-5p的一個關(guān)鍵效應(yīng)靶點，miRNA-29c-5p的強表達顯著抑制了CPEB4的表達，通過影響MAPK途徑，從而抑制膽囊癌細胞增殖和轉(zhuǎn)移；相反，CPEB4的恢復(fù)逆轉(zhuǎn)了miRNA-29c-5p抑制作用。此外，TGFβ可下調(diào)miRNA-29c-5p的表達。因此，TGFβ/miRNA-29c-5p/CPEB4/MAPK軸在膽囊癌的發(fā)病機制和預(yù)后方面具有重要作用，提示miRNA-29c-5p可作為膽囊癌的潛在預(yù)后標(biāo)志物或治療靶點。有研究[33]發(fā)現(xiàn)miRNA-29c-3p在膽囊癌中表達下調(diào)，更為重要的是，上調(diào)miRNA-29c-3p逆轉(zhuǎn)了膽囊癌細胞EMT過程，進而抑制膽囊癌細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。故在膽囊癌中，miRNA-29c-3p作為一種抑癌基因影響膽囊癌侵襲轉(zhuǎn)移。

3.10 miRNA-33a 慢性膽囊炎被公認(rèn)為是膽囊癌的發(fā)病因素。流行病學(xué)資料顯示，慢性炎癥可能是腫瘤發(fā)生的重要因素，有報道[34]稱，大約20%的惡性腫瘤與慢性炎癥有關(guān)。Zhang等[35]研究發(fā)現(xiàn)炎性細胞因子IL-6在體內(nèi)外均促進膽囊癌的增殖、遷移、侵襲和EMT。在膽囊癌所有miRNA譜改變的miRNA中，IL-6處理的膽囊癌細胞株和膽囊癌組織中miRNA-33a的表達均顯著低于病例對照正常組織和膽囊炎組織。在移植瘤模型中，過表達的miRNA-33a抑制了瘤細胞的生長和擴散。進一步研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-33a通過直接結(jié)合Twist基因抑制IL-6誘導(dǎo)的腫瘤轉(zhuǎn)移。故在膽囊癌中，miRNA-33a是一種抑癌miRNA，可被炎性細胞因子IL-6下調(diào)，能作為膽囊炎進展為膽囊癌潛在的風(fēng)險指標(biāo)。

4 與膽囊癌化療敏感性相關(guān)的miRNA

4.1 miRNA-125b-5p Yang等[36]研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑存在情況下，上調(diào)miRNA-125b-5p可促進膽囊癌細胞死亡。相反，miRNA-125b-5p的敲除降低了順鉑治療膽囊癌的細胞死亡。miRNA-125b-5p的上調(diào)與順鉑聯(lián)合可顯著抑制小鼠腫瘤的生長。另外，研究中還發(fā)現(xiàn)B淋巴細胞-2基因(Bcl-2)是miRNA-125b-5p的直接靶點。臨床上膽囊癌中miRNA-125b-5p表達與Bcl-2表達呈負相關(guān)。此外，miRNA-125b-5p低表達或Bcl-2高表達與預(yù)后不良相關(guān)。以上研究表明，miRNA-125b-5p是一種有效的化療增敏劑，有望成為膽囊癌患者治療靶點及預(yù)測化療效果和預(yù)后的一個新的生物標(biāo)志物。

4.2 miRNA-31 研究[37]顯示，miRNA-31的異位高表達降低了順鉑耐藥細胞增殖、活力和侵襲能力，促進了細胞凋亡。在異種移植瘤模型中，miRNA-31在順鉑耐藥的膽囊癌細胞中顯著降低。以上結(jié)果提示，miRNA-31表達上調(diào)可增強順鉑化療敏感性，具有克服膽囊癌耐藥的治療潛力。

4.3 miRNA-145 miRNA-145在膽囊癌中是一種抑癌基因，miRNA-145的異位表達顯著影響細胞活力及集落形成，降低血管內(nèi)皮生長因子A和AXL的基因表達[38]。Zhan等[39]研究表明，miRNA-145過表達增加了順鉑的療效。miRNA-145通過直接靶向其3′-UTR加速多藥耐藥相關(guān)蛋白mRNA(MRP1 mRNA)的降解，并因此導(dǎo)致膽囊癌細胞中順鉑毒性增加。故低miRNA-145和高MRP1表達水平預(yù)示著接受化療的膽囊癌患者預(yù)后不良。這些結(jié)果表明，miRNA-145在膽囊癌中發(fā)揮抗癌作用，并可作為順鉑化療療效的生物標(biāo)志物。

5 與膽囊癌診斷相關(guān)的miRNA

膽囊癌患者確診時多為中晚期，往往已失去行根治性手術(shù)機會，因此尋找特異的診斷膽囊癌的腫瘤標(biāo)志物成為膽囊癌研究熱點。miRNA存在于人類體液中，其物理性狀非常穩(wěn)定，能夠抵抗核糖核酸酶的降解，并且耐酸、耐堿，不受溫度變化及時間影響[40]，更重要的是，miRNA差異性的表達譜可以用于識別人類腫瘤的診斷、分期、預(yù)后及治療反應(yīng)[41]。Li等[42]在膽囊癌患者血漿中檢測出6個與健康人群差異表達的miRNA，分別為let-7a、miRNA-21、miRNA-187、miRNA-143、miRNA-202和miRNA-335，另外發(fā)現(xiàn)miRNA-187、miRNA-143、miRNA-202與膽囊癌臨床病理特征有關(guān)。這些差異表達有可能為膽囊癌的診斷提供重大意義。另有報道[43]稱，miRNA-182在膽囊癌患者血清中表達升高，且通過聯(lián)合癌胚抗原153檢測提高了膽囊癌的診斷效能。通過上述研究可以看出，miRNA在人的體液中穩(wěn)定存在，并且在膽囊癌患者體液中存在特異性改變，故體液中miRNA檢測有望成為一種膽囊癌早期診斷的新的生物學(xué)標(biāo)志物。

6 總結(jié)與展望

miRNA影響膽囊癌發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后、化療耐藥及診斷，在膽囊癌中有很好的研究前景，其有望成為膽囊癌診斷、預(yù)測預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志物，同時也為抗腫瘤藥物的研制提供了新思路和新靶標(biāo)。但目前miRNA對于膽囊癌的作用仍僅限于基礎(chǔ)研究。此外，miRNA相互之間復(fù)雜的分子機制及相關(guān)通路尚未完全了解，從而限制了臨床上的應(yīng)用。上述問題將是以后研究的重點。隨著對miRNA研究的不斷深入，相信其在膽囊癌診斷及治療中將會有廣泛的應(yīng)用前景。