細(xì)胞焦亡在急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制中的作用

韋碧薇， 龔雅慧， 梁志海

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 消化內(nèi)科一病區(qū)， 南寧 530021

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是多種病因?qū)е乱让冈谝认賰?nèi)被激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的炎癥反應(yīng)，其發(fā)病率逐年增加，發(fā)生率也隨年齡的增長(zhǎng)而增加[1]。20%～30%的AP患者可進(jìn)展為重癥急性胰腺炎(server acute pancreatitis, SAP)，SAP的病死率高達(dá)30%[2]。傳統(tǒng)的“酶異常激活”和“自身消化學(xué)說(shuō)”未能完全闡明AP的發(fā)病機(jī)制。目前的研究認(rèn)為炎性因子反應(yīng)、微循環(huán)障礙、氧化應(yīng)激反應(yīng)、腸道細(xì)菌移位等均參與了AP的發(fā)病過(guò)程。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)胰腺腺泡細(xì)胞損傷和死亡方式?jīng)Q定了AP的進(jìn)展和預(yù)后，因此了解AP發(fā)病早期胰腺腺泡細(xì)胞死亡方式可對(duì)發(fā)病機(jī)制、診斷和治療提供新的理論基礎(chǔ)。細(xì)胞凋亡和壞死是AP中胰腺腺泡細(xì)胞兩種主要的死亡方式，在病理刺激下胰腺腺泡細(xì)胞從壞死向凋亡轉(zhuǎn)變可以降低AP的嚴(yán)重程度，產(chǎn)生有利影響[3]。除這兩種細(xì)胞死亡方式外，新近的研究表明，細(xì)胞焦亡與AP的發(fā)生發(fā)展亦密切相關(guān)，細(xì)胞焦亡作為其中一種可促炎性反應(yīng)的細(xì)胞死亡方式，是依賴(lài)于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)活性的細(xì)胞程序性死亡。目前大量研究[4-6]證實(shí)，細(xì)胞焦亡參與了感染性疾病、免疫性疾病、腫瘤等諸多疾病的發(fā)生，并發(fā)揮重要作用。細(xì)胞焦亡通過(guò)活化核因子-κB(NF-κB)通路誘導(dǎo)炎性小體激活，以及切割GSDMD(gasdermin D)釋放效應(yīng)分子，引起急性炎癥反應(yīng)[7]。炎性小體的激活和釋放效應(yīng)分子對(duì)AP的全身免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的激活至關(guān)重要，是AP中胰腺及胰腺外器官損傷的重要決定因素[8-9]。本文就細(xì)胞焦亡在AP發(fā)病機(jī)制中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1 細(xì)胞焦亡與AP發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

細(xì)胞焦亡不同于細(xì)胞凋亡、自噬、壞死等其他細(xì)胞死亡方式，焦亡需要炎癥性的Caspase參與。細(xì)胞焦亡時(shí)，細(xì)胞發(fā)生腫脹，細(xì)胞上形成氣泡狀突出物，膜上形成眾多1～2 nm孔隙，隨后細(xì)胞膜發(fā)生破裂，大量胞質(zhì)內(nèi)容物釋放，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，形態(tài)學(xué)上出現(xiàn)細(xì)胞核濃縮，DNA斷裂等改變[10-11]。細(xì)胞焦亡在生理上可以清除細(xì)胞內(nèi)病原體，抵御病原體感染，保護(hù)機(jī)體[12]；還可以通過(guò)快速的質(zhì)膜破裂將細(xì)胞內(nèi)的病原體驅(qū)逐并暴露于細(xì)胞外，成為免疫效應(yīng)機(jī)制的目標(biāo)。同時(shí)，焦亡可使受感染細(xì)胞釋放出炎性細(xì)胞因子和危險(xiǎn)信號(hào)，將更多的免疫細(xì)胞吸引至感染部位，從而有助于消滅病原體，維持機(jī)體免疫平衡。但是，與過(guò)度炎癥反應(yīng)相似，當(dāng)過(guò)多的宿主細(xì)胞發(fā)生焦亡時(shí)，則可能由于細(xì)胞內(nèi)炎性因子的過(guò)度釋放或宿主細(xì)胞的過(guò)度破壞而對(duì)機(jī)體產(chǎn)生有害影響[13]，導(dǎo)致疾病加重。細(xì)胞焦亡激活通路可分為依賴(lài)Caspase-1的經(jīng)典途徑與依賴(lài)Caspase-4/5/11的非經(jīng)典途徑。

1.1 細(xì)胞焦亡的激活機(jī)制 細(xì)胞焦亡的經(jīng)典途徑依賴(lài)于Caspase-1，通過(guò)細(xì)胞膜表面的模式識(shí)別受體識(shí)別病原體相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular patterns, DAMP)后，在接頭蛋白凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein, ASC)的胱天蛋白酶募集域(Caspase recruitment domain, CARD)的相互作用下組裝和激活炎性小體，募集Caspase-1前體(pro-Caspase-1)[13]，繼而促進(jìn)Caspase-1的活化并釋放。活化的Caspase-1將IL-1β前體和IL-18前體轉(zhuǎn)化為成熟的IL-1β和IL-18[14]。Caspase-1還可以切割GSDMD，分泌到細(xì)胞外，募集更多的炎癥細(xì)胞，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)。

除了上述經(jīng)典途徑，不依賴(lài)于Caspase-1的非經(jīng)典途徑同樣發(fā)揮著重要作用。鼠源性Caspase-11和人源性Caspase-4/5是同源蛋白，Caspase-11直接識(shí)別脂多糖，通過(guò)Caspase-11的CARD與脂多糖結(jié)合后，促使其寡聚和活化[15]?；罨腃aspase-11也可以切割GSDMD，形成具有打孔功能的N端，使細(xì)胞破裂，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。同時(shí)Caspase-11通過(guò)間接參與NOD樣受體蛋白3(nod-like-receptor protein 3, NLRP3)炎性小體的形成進(jìn)而誘導(dǎo)pro-Caspase-1激活，促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子IL-1β和IL-18的成熟[14]。這種依賴(lài)于Caspase-4/5/11的細(xì)胞焦亡方式稱(chēng)為非經(jīng)典細(xì)胞焦亡途徑。

1.2 細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白——GSDMD GSDMD是gasdermin家族的胞漿蛋白，由487個(gè)氨基酸構(gòu)成，全長(zhǎng)53 kD，可廣泛表達(dá)于各種組織與細(xì)胞[16]。GSDMD作為Caspase-1/4/5/11的共同底物，是細(xì)胞焦亡中的執(zhí)行者。

經(jīng)典或非經(jīng)典途徑中的Caspase-1/4/5/11在Asp276位點(diǎn)上對(duì)GSDMD進(jìn)行切割，裂解后的GSDMD釋放出2個(gè)結(jié)構(gòu)域，即gasdermin-N和gasdermin-C。N端片段與質(zhì)膜相結(jié)合，在質(zhì)膜上形成10～15 nm的gasdermin孔隙。這些孔隙的形成被認(rèn)為是細(xì)胞膜上電化學(xué)梯度改變所造成，導(dǎo)致無(wú)法維持細(xì)胞滲透壓平衡和穩(wěn)定細(xì)胞體積，最終造成細(xì)胞破裂[17]，但值得關(guān)注的是，即使在沒(méi)有發(fā)生細(xì)胞裂解的情況下，巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞亦能夠以GSDMD依賴(lài)的方式釋放IL-1β和IL-18[18]。

1.3 細(xì)胞焦亡在AP發(fā)病機(jī)制中的作用 Caspase-1和Caspase-11的激活可促進(jìn)AP炎癥反應(yīng)并加重胰腺損傷。Rau等[19]對(duì)AP大鼠模型注射Caspase-1抑制劑后，發(fā)現(xiàn)在AP發(fā)病早期IL-1β水平、胰腺壞死程度以及病死率均顯著降低。在巨噬細(xì)胞中，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能?chē)?yán)重受損引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，活化的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)源性轉(zhuǎn)錄因子(C/EBP-homologous protein, CHOP)使pro-Caspase-11發(fā)生自身溶解，誘導(dǎo)Caspase-11和IL-1β激活，CHOP-Caspase-11通路在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[20]中也被認(rèn)為參與了AP的發(fā)病機(jī)制。此外，有研究[21]指出，敲除Caspase-1與Caspase-11的小鼠較敲除NLRP3或ASC的小鼠對(duì)AP有更好的保護(hù)作用，這可能與相關(guān)的細(xì)胞焦亡途徑被抑制后，胰腺腺泡細(xì)胞破壞、促炎細(xì)胞因子釋放減少有關(guān)。

2 細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子與AP發(fā)病機(jī)制的關(guān)系

2.1 炎性小體與AP 大部分炎性小體是由NOD樣受體或黑色素瘤缺乏因子2樣受體蛋白家族、ASC、pro-Caspase-1結(jié)合組成的多蛋白復(fù)合體。炎性小體可以識(shí)別來(lái)自宿主細(xì)胞胞質(zhì)的威脅，是檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)抗原和DAMP的傳感器。其組裝激活后募集pro-Caspase-1，將其裂解成Caspase-1[22]，并將信號(hào)傳導(dǎo)給下游GSDMD蛋白，最終實(shí)現(xiàn)細(xì)胞焦亡。因此，細(xì)胞焦亡的過(guò)程中需要炎性小體參與，炎性小體的激活是細(xì)胞發(fā)生焦亡的關(guān)鍵。與細(xì)胞焦亡相關(guān)的炎性小體主要包括NLRP1、NLPR3、NLRC4、黑色素瘤缺乏因子2(absent in melanoma, AIM2)和Pyrin[23]。目前發(fā)現(xiàn)與AP發(fā)病機(jī)制有關(guān)的炎性小體主要是NLRP3和AIM2。

2.1.1 NOD樣受體蛋白3(NLRP3) NLRP3屬于NOD受體蛋白家族，NLRP3炎性小體由NLRP3蛋白、ASC和pro-Caspase-1組成。當(dāng)AP發(fā)生時(shí)，胰蛋白酶激活后引起胰腺腺泡細(xì)胞自身消化[24]，免疫細(xì)胞中Toll樣受體(TLR)4和TLR9以及胰腺腺泡細(xì)胞中NOD1可以識(shí)別壞死腺泡細(xì)胞釋放的三磷酸腺苷、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和游離脂肪酸在內(nèi)的多種刺激，通過(guò)受體P2X7激活NLRP3炎性小體[25-26]。缺乏P2X7基因可以減少AP動(dòng)物模型的胰腺損傷和炎癥反應(yīng)[21]。另一方面，在應(yīng)激條件下，機(jī)體生成活性氧(ROS)增加，硫氧還蛋白互作蛋白與NLRP3結(jié)合，促進(jìn)炎性小體的激活[27-28]。Ren等[29]研究證明，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)的ROS會(huì)加重AP嚴(yán)重程度，清除ROS時(shí)能減少NLRP3炎性小體的激活，進(jìn)而減輕胰腺損傷。除胰腺自身?yè)p傷外，NLRP3炎性小體還參與了胰外臟器的損傷機(jī)制[30]。Jin等[31]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)減少ROS的產(chǎn)生和抑制NLRP3炎性小體的激活，可以減輕胰腺和肺損傷的嚴(yán)重程度。Xu等[32]在SAP大鼠模型中，還發(fā)現(xiàn)NLRP3可能通過(guò)Caspase-1途徑參與了腸損傷，導(dǎo)致腸屏障功能受損。

2.1.2 黑色素瘤缺乏因子2(AIM2) AIM2的C端HIN200結(jié)構(gòu)域可以識(shí)別病毒DNA和細(xì)菌雙鏈DNA，與ASC結(jié)合形成AIM2/ASC/pro-Caspase-1復(fù)合體，即AIM2炎性小體。臨床研究表明，AP患者的全身炎癥狀態(tài)與外周血單個(gè)核細(xì)胞介導(dǎo)的AIM2表達(dá)及AIM2介導(dǎo)的IL-1β產(chǎn)生存在相關(guān)性。在AP早期過(guò)程中AIM2炎性小體的激活和表達(dá)增加，提示AIM2的激活不僅可以促進(jìn)局部胰腺炎癥，也可以促進(jìn)AP全身性炎癥和多器官衰竭[33]。然而AIM2在AP發(fā)病過(guò)程中的機(jī)制尚未闡明，有研究[34]發(fā)現(xiàn)可能與核小體有關(guān)。因?yàn)橐认贀p傷后可釋放出核小體，它是由DNA和組蛋白組成的復(fù)合物，是感染和無(wú)菌性炎癥環(huán)境中常見(jiàn)的疾病預(yù)后標(biāo)志物，其可導(dǎo)致機(jī)體全身炎癥反應(yīng)加重。另外，體外研究[35]還發(fā)現(xiàn)晚期糖基化終產(chǎn)物受體(receptor of advanced glycation endproducts, RAGE)在調(diào)節(jié)核小體復(fù)合物中DNA/高遷移率組蛋白1(high mobility group box1, HMGB1)的攝取方面起著重要作用：核小體激活RAGE后，使雙鏈RNA依賴(lài)蛋白激酶磷酸化，通過(guò)核小體-RAGE-AIM2炎性小體通路，激活A(yù)IM2炎性小體和釋放促炎因子IL-1β、HMGB1來(lái)促進(jìn)AP發(fā)展。

2.2 效應(yīng)分子與AP 細(xì)胞焦亡發(fā)生后，細(xì)胞釋放出的效應(yīng)分子主要為IL-1β和IL-18，二者均是典型的IL-1家族成員。IL-1是驅(qū)動(dòng)炎癥反應(yīng)的主要因素，可引起發(fā)熱，激活免疫細(xì)胞，發(fā)揮抗微生物和促炎作用。IL-1在感染環(huán)境中起保護(hù)性作用，但當(dāng)它以不受控制的方式產(chǎn)生時(shí)，會(huì)導(dǎo)致各種自身炎癥性疾病發(fā)生病理變化[36]。IL-1β被認(rèn)為是AP無(wú)菌性炎癥和損傷反應(yīng)的主要決定因素。IL-1β受體拮抗劑對(duì)IL-1β信號(hào)的抑制可減少胰腺炎癥和胰腺組織損傷[37]。IL-18參與輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1和Th2免疫反應(yīng)，并參與自然殺傷細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活化，在不同的病理中發(fā)揮一定的作用。IL-18可誘導(dǎo)IFNγ的產(chǎn)生，而IFNγ是抗病毒和抗菌免疫的重要介質(zhì)。與IL-1β類(lèi)似，IL-18也可促進(jìn)與IFNγ相關(guān)的疾病發(fā)生病理變化[38]。血清IL-18水平與AP的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，可以作為早期潛在的預(yù)測(cè)指標(biāo)。此外，IL-18升高通過(guò)激活Th2反應(yīng)加重AP，并參與AP相關(guān)的肺損傷[39]。

另一方面，細(xì)胞焦亡的關(guān)鍵蛋白GSDMD除了影響細(xì)胞焦亡、釋放IL外，還可以促使細(xì)胞釋放HMGB1。有研究[21,40]表明HMGB1作為主要內(nèi)源性TLR4配體，分別通過(guò)TLR4和核酸TLR(如TLR9)誘導(dǎo)和增強(qiáng)AP的無(wú)菌性炎癥反應(yīng)，抑制HMGB1的釋放或細(xì)胞因子活性，也可對(duì)AP動(dòng)物模型產(chǎn)生保護(hù)作用。在AP患者中，血清HMGB1水平顯著升高，并與疾病的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[41]。

以上細(xì)胞焦亡的相關(guān)分子，包括促炎因子IL-1β、IL-18和HMGB1，它們與AP炎癥反應(yīng)程度、胰腺實(shí)質(zhì)細(xì)胞損傷和疾病進(jìn)程均密切相關(guān)。

3 小結(jié)與展望

細(xì)胞焦亡是受多基因調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡，在免疫和疾病中起著重要作用。經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑分別通過(guò)Caspase-1和Caspase-4/5/11介導(dǎo)激活，切割下游關(guān)鍵蛋白GSDMD，誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡。細(xì)胞焦亡與代謝物受體、炎性小體激活、炎性因子之間的多種聯(lián)系密不可分，既往研究已經(jīng)表明這些激活途徑及其發(fā)生過(guò)程中釋放的分子與AP發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)。但是，仍有許多細(xì)胞焦亡的相關(guān)機(jī)制需要進(jìn)一步探索，如：除NLRP3、AIM2以外其他NOD樣受體與AP的關(guān)系、溶酶體破壞激活NLRP3炎性小體途徑與AP的關(guān)系、胰腺內(nèi)溶酶體降解等防御機(jī)制是否能有效對(duì)抗壞死作用、代謝物受體能否通過(guò)細(xì)胞焦亡通路抑制AP的組織損傷等。進(jìn)一步探究細(xì)胞焦亡的調(diào)控機(jī)制，可能為AP的治療提供新的靶點(diǎn)和理論依據(jù)。