添加中草藥與草分枝桿菌對凡納濱對蝦育苗效果的影響

彭張明 黃明 康健南 劉志剛 蒲桂川

摘要：為探究添加不同濃度中草藥（芪參散）與草分枝桿菌對凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei）育苗、蝦苗標粗與養(yǎng)殖效果的影響，在室內(nèi)養(yǎng)殖桶內(nèi)采用相同方法開展2次育苗試驗，并跟蹤2次育苗試驗蝦苗低鹽耐受性、標粗與養(yǎng)殖的表現(xiàn)。結果顯示，凡納濱對蝦苗生長性狀上的差異具統(tǒng)計學意義，D組（2.0%芪參散）和G組（1.0%草分枝桿菌）的育苗效果最佳。蝦苗低鹽耐受性的表現(xiàn)差異具統(tǒng)計學意義，C組（添加1.0%芪參散）、D組、F組（0.5%草分枝桿菌）和G組的蝦苗存活率相比其余組差異顯著，此外該4組蝦苗標粗成活率、養(yǎng)殖生長速度、養(yǎng)殖成活率及成功率都優(yōu)于其他組蝦苗。在育苗過程中添加一定比例的中草藥（芪參散）與草分枝桿菌可提高凡納濱對蝦的育苗效果，對培育高健康優(yōu)質(zhì)蝦苗、提升標粗與養(yǎng)成效果具有重要意義。

關鍵詞：凡納濱對蝦;中草藥（芪參散）;草分枝桿菌（Mycobacterium plei Sq-1）菌粉;育苗效果;影響

中圖分類號： S966.12+9? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0192-06

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），又稱南美白對蝦（Penaeus vannamei），俗稱白對蝦或白蝦，于1988年從美國引進國內(nèi)，并在1992年突破了育苗關，在全國各地推廣養(yǎng)殖[1]。進入21世紀，對蝦養(yǎng)殖業(yè)已由片面追求生長速度向高質(zhì)量、穩(wěn)定生產(chǎn)轉(zhuǎn)型，優(yōu)質(zhì)苗種培育已經(jīng)引起了政府、企業(yè)、養(yǎng)殖戶的高度重視，人們對于優(yōu)質(zhì)苗種的需求及認知達到了前所未有的高度。優(yōu)質(zhì)、健康的苗種是對蝦養(yǎng)殖成功的前提和基礎，關于凡納濱對蝦室內(nèi)、室外水泥池育苗試驗，工廠化育苗、生態(tài)育苗及仿生態(tài)育苗的摸索，有益微生物在對蝦育苗中的應用等已有大量的研究，并取得了豐厚的成果[2-6]。

中草藥對水產(chǎn)動物的生長性能、免疫功能有顯著提高，在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)有著廣泛的應用，不但可以解決化學藥品、抗生素等耐藥性和藥物殘留等制約食品安全的問題，而且有利于推動健康養(yǎng)殖的發(fā)展[7-9]。微生態(tài)制劑是對養(yǎng)殖動物本身或環(huán)境有益的微生物及其相關產(chǎn)物[10]，已經(jīng)被廣泛應用于醫(yī)藥、食品及飼料添加劑[11]以及污水處理等方面，可以促進水產(chǎn)動物健康生長、預防疾病，同時還具有無毒副作用等優(yōu)點[12-13]。草分枝桿菌（Mycobacterium plei Sq-1）屬于抗酸分枝桿菌屬，非結核分枝桿菌快速增長的物種，大量研究證實其能提高機體免疫力[14-15]。在凡納濱對蝦育苗過程添加中草藥及草分枝桿菌菌粉尚未有系統(tǒng)研究報道，本研究利用公司獨立的種苗研究機構，采用玻璃鋼養(yǎng)殖桶進行育苗試驗，添加一種復合中草藥（芪參散）與草分枝桿菌菌粉在餌料中，旨在探究2種添加物對凡納濱對蝦育苗效果的影響，并對蝦苗的生長性狀、抗逆能力做一個初步探究，同時還對本次試驗培育的蝦苗養(yǎng)殖性能做一個跟蹤，為中草藥和草分枝桿菌微生態(tài)制劑在對蝦育苗產(chǎn)業(yè)中的推廣應用提供理論依據(jù)，也為培育高健康優(yōu)質(zhì)凡納濱對蝦蝦苗提供一定的實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 無節(jié)幼體 2次育苗試驗所用的無節(jié)幼體來源于公司種蝦場培育的同一批進口SPF凡納濱對蝦親蝦的F1代SPF無節(jié)幼體，經(jīng)公司獨立的檢測機構檢測后，幼體各項檢測指標均合格，符合出場標準。

1.1.2 2種添加物 復合中草藥（芪參散）與草分枝桿菌菌粉皆來自于湖南圣雅凱生物科技有限公司所生產(chǎn)的產(chǎn)品，芪參散為灰白色或灰黃色的粉末，其處方為黃芪300 g、人參200 g及甘草200 g，經(jīng)粉碎、過篩、混勻后得到;草分枝桿菌菌粉來自草分枝桿菌（Mycobacterium plei Sq-1）在蔗糖無機鹽培養(yǎng)液內(nèi)首先產(chǎn)生胞壁酰二肽（MDP）、草分枝桿菌多糖（MPS）、CGP免疫調(diào)節(jié)序列等構形物，其次是黃酮、胡蘿卜素、維生素酶多種微量元素，發(fā)酵液離心收集菌體，在108～112 ℃烘干、收干，得到一種草分枝桿菌Sq-1的菌體。

1.2 方法

1.2.1 育苗準備工作 2018年8月16日對室內(nèi)玻璃鋼養(yǎng)殖桶、各項育苗工具以及整個車間清洗消毒，安裝好氣管、氣石，投幼體前一天準備好比重為1.020經(jīng)公司十重水處理流程過后的海水放入室內(nèi)蓄水池中，調(diào)整海水總堿度140～160，pH值8.0～84，投入10 mg/L EDTA-2Na，充分打均勻后，停氣沉淀24 h，溫度為海水自然溫度31～32 ℃。

1.2.2 轉(zhuǎn)水及幼體投放 8月7日上午開始第1次育苗試驗，首先從蓄水池中過棉花棒轉(zhuǎn)水到育苗桶（1 m3）中，水位70 cm，進好21個桶的水后，檢測余氯為0，下午開始投放幼體，放幼體前投入1.0 ～1.5 mg/L的維生素C到各育苗桶中，總量 250萬尾無節(jié)幼體，均分投放在21個桶內(nèi)，密度約11.9萬尾/桶，同時，取放幼體前的水樣涂弧菌板檢測得到黃弧菌、綠弧菌數(shù)量為0。

1.2.3 試驗設計 將21個育苗桶分成7個組，1個對照組和6個試驗組，每個組設置3個重復組，編號為A、B、C、D、E、F和G，按照表1處理方法進行投喂，其中在基礎餌料中添加芪參散及草分枝桿菌菌粉的頻次為4次/d，另外，每個育苗桶中放置1個500 W的自動恒溫棒，根據(jù)蝦苗不同發(fā)育階段設置所需溫度。

1.2.4 日常投喂 蝦苗日常投喂按照表1的方法，蝦苗發(fā)育各時期的具體投喂詳細情況見表2。

1.2.5 日常加換水 幼體發(fā)育到Z2后期開始加水，每天2～5 cm淡水和3～5 cm海水，蝦苗發(fā)育到PL1開始排水，每天排水20 cm，到PL4后，每天排水30 cm，海水和淡水對半加，排水后加入1.0 ～15 mg/L的維生素C，降低蝦苗的應激，每次加完水后，投入5～8 mg/L的NaHCO3，穩(wěn)定水質(zhì)。

1.2.6 育苗試驗 第1次育苗試驗的育苗周期為2018年8月7—30日，總計24 d，蝦苗發(fā)育階段為PL16;第2次育苗試驗的育苗周期為2018年9月9日至10月2日，總計24 d，蝦苗發(fā)育階段為PL16，育苗試驗保持統(tǒng)一的操作方法，無節(jié)幼體為同一批次親蝦所生產(chǎn)，2次育苗試驗的各環(huán)節(jié)操作、環(huán)境均保持一致，主要目的是做一個重復性驗證。

1.2.7 育苗生長指標測定 糠蝦成活率測定方法：用1 L的采水器分別在桶的4個角落的上層和底層以及桶的中心取9個點，統(tǒng)計1 L水中糠蝦幼體數(shù)量的平均值，重復3次，計算出育苗桶中糠蝦幼體的數(shù)量（NM）。育苗成活率測定方法：在試驗結束時，分別將每個桶中的蝦苗收集在撈網(wǎng)中，稱取質(zhì)量（W1，精確至0.001 g），再從其中隨機取100 ind蝦苗，稱取其質(zhì)量（W2），計算每個育苗桶內(nèi)蝦苗存活總數(shù)。蝦苗全長測定：測量對蝦的額劍尖端至對蝦尾節(jié)末端的長度，要將對蝦盡量伸直，然后測量，在PL3、PL8及PL16階段分別隨機取各組50 ind蝦苗進行全長測量。

相關計算公式如下：

糠蝦成活率SR= NM/N×100%;

育苗成活率SR=[（W1/W2）/100]/N×100%;

生長速率LGR（cm/d）=（L1-L0）/（t1-t0）。

其中N為無節(jié)幼體數(shù)量，L0和L1為前一次取樣的蝦苗全長和后一次取樣時的全長，t0和t1分別為前一次采樣時間和后一次采樣時的時間。

1.2.8 低鹽耐受性檢測 隨機取各組育苗桶內(nèi)PL16階段蝦苗100 ind，放入淡水中30 min，然后將蝦苗全部轉(zhuǎn)移到原海水（鹽度32‰）中30 min，最后統(tǒng)計蝦苗的存活率。

1.2.9 無特定病原攜帶檢測 利用公司引進的熒光定量PCR及巢式PCR等檢測手段對各組蝦苗進行AHPND（急性肝胰腺壞死?。┘癊HP（蝦肝腸胞蟲）等病原攜帶檢測，檢測合格后進行標粗及養(yǎng)殖效果的跟蹤。

1.2.10 標粗成活率及養(yǎng)殖效果表現(xiàn) 標粗及養(yǎng)成過程不再投喂芪參散和草分枝桿菌，分別將各組的蝦苗集中后轉(zhuǎn)移到遂溪草潭鎮(zhèn)養(yǎng)殖基地編號A～G的7個水泥池中進行正常標粗，跟蹤各組蝦苗的標粗成活率;當蝦苗全長規(guī)格達到2.5 cm時，進行分池，開展水泥池工廠化養(yǎng)殖，并對各組蝦苗養(yǎng)殖效果進行定性跟蹤。

1.2.11 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 19.0分析軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），并使用Duncan法進行多重比較，檢驗處理間的差異顯著性水平設為0.05;試驗數(shù)據(jù)采用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 中草藥與草分枝桿菌對凡納濱對蝦育苗過程生長性狀的影響

由表3、圖1可知，通過2次試驗數(shù)據(jù)的分析，D、G兩組在蝦苗全長、生長速率、糠蝦成活率及育苗成活率相比其他組別均表現(xiàn)出差異顯著（P<005），而B、C、E及F 4組相比對照組則表現(xiàn)生長性狀差異不顯著（P>0.05）。

2.2 中草藥與草分枝桿菌對凡納濱對蝦蝦苗低鹽耐受性的影響

由圖2可知，C、D、F和G 4組蝦苗的存活率相比其余3組存在顯著差異（P<0.05），但4組內(nèi)沒有顯著差異（P> 0.05），其中存活率最高的是第2次試驗中的G組，達到94.5%;B、E組的存活率相比對照組沒有顯著差異（P>0.05），其中存活率最低的是第1次試驗中的對照組，僅為54.3%。

2.3 2次凡納濱對蝦育苗試驗蝦苗標粗效果與養(yǎng)殖效果的跟蹤

通過對2次育苗試驗蝦苗后續(xù)的7 d標粗效果及60 d養(yǎng)殖效果的定性跟蹤，由表4中的基本情況

可知，C、D、F和G組蝦苗表現(xiàn)最為顯著，其標粗成活率、養(yǎng)殖生長速度、養(yǎng)殖成活率及成功率都得到了肯定。這一方面是因為室內(nèi)水泥池工廠化養(yǎng)殖的先天條件，另外一方面也是因為苗種質(zhì)量的保障。

3 討論與結論

3.1 中草藥與草分枝桿菌對凡納濱對蝦育苗過程生長性狀的影響

中草藥中含有維生素、氨基酸、多糖類等營養(yǎng)物質(zhì)和一些未知的誘食因子，可以增強養(yǎng)殖動物的食欲，促進水產(chǎn)動物機體代謝和消化酶的分泌，提高餌料利用率，從而加速水產(chǎn)動物生長發(fā)育。在對蝦養(yǎng)殖過程中，通過添加黃芪、板藍根、甘草、白術、黃芩及大黃等常見中草藥的水提取物、制劑及復合制劑到餌料中，可有效促進凡納濱對蝦及斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）的生長速度、個體增重率、餌料系數(shù)和成活率等[16-18]。本研究通過2次重復育苗試驗，在凡納濱對蝦育苗過程中添加3種濃度復合中草藥（芪參散），蝦苗生長速率及成活率均優(yōu)于對照組，其中以2.0%的添加量效果最佳，生長速率分別達到0.061、0.062 cm/d，育苗成活率分別達到79.3%和70.3%，結果表明添加中草藥在凡納濱對蝦育苗過程中可達到促進生長、提升成活率的效果。其原因可能是復方中草藥中的某些成分，如黃芪多糖、甘草多糖、黃酮類化合物和葡萄糖氨基酸等已被證實有促生長作用[19]。

微生態(tài)制劑被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，在對蝦生長的不同階段使用芽胞桿菌（bacillus）、乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）以及酵母培養(yǎng)物（Yeast Culture）等具有促進消化、提高蝦苗的體質(zhì)量和存活率以及降低餌料系數(shù)的作用[20-22]。育苗階段，光合細菌（photosynthetic bacteria，PSB）可提高蝦苗的成活率、促進變態(tài)發(fā)育[23]。草分枝桿菌菌體組成成分復雜，其中包括糖類、脂肪、蛋白質(zhì)、鈣、磷、維生素和微量元素等50多種活性成分[24]，本試驗添加的草分枝桿菌是經(jīng)滅活制成的菌粉，適口性佳，蝦苗可以攝食到多種活性物質(zhì)，如胞壁酰二肽（MDP）對生長發(fā)育和成活率都有促進作用[25]，試驗得到以1.0%的添加量育苗效果表現(xiàn)最優(yōu)秀，育苗成活率達到80.0%和73.5%，因此草分枝桿菌也具有微生態(tài)制劑的效果，可作為養(yǎng)殖動物的餌料被其直接利用，從而促進養(yǎng)殖動物的生長以及提高養(yǎng)殖動物的消化機能和對飼料的利用率[26-27]，進而推測其可作為凡納濱對蝦養(yǎng)殖過程中一種新的微生態(tài)制劑。

3.2 中草藥與草分枝桿菌對凡納濱對蝦蝦苗低鹽耐受性、標粗效果與養(yǎng)殖效果的影響

動物抗逆能力是指自身對外界不良因素、環(huán)境抵抗的能力，包括抵抗化學性、物理性、生物性等逆境的能力，而低鹽耐受性是檢驗動物抗逆能力強弱重要的方面。在對蝦育苗期和養(yǎng)成期，添加一定量的中草藥、微生態(tài)制劑以及復合中草藥益生菌制劑能有效促進凡納濱對蝦抗逆能力的研究已有大量報道[8，12，16]。本育苗試驗結果顯示，添加1%和2%的中草藥（芪參散）的蝦苗對在鹽度突變后的存活率達到85%以上，而添加0.1%的中草藥和對照組沒有促進作用，芪參散中含有黃芪多糖、甘草多糖、黃酮類以及生物堿等成分，能夠提高凡納濱對蝦非特異性免疫相關機能及免疫因子活性[28-29]，有效調(diào)節(jié)機體功能，提高對蝦機體免疫，從而改善機體內(nèi)環(huán)境，提高了蝦苗的低鹽耐受性，因此，建議育苗過程中可添加1%或2%的中草藥（芪參散），以提高蝦苗的抗逆能力。

2次育苗試驗中，添加0.5%和1.0%的草分枝桿菌菌粉相比對照組可以顯著提高蝦苗鹽度突變的存活率，添加0.1%的草分枝桿菌菌粉則沒有提升作用，草分枝桿菌菌粉能提高蝦苗的抗逆能力可能與其本身所含的MDP、MPS等多種活性物質(zhì)以及在蔗糖無機鹽培養(yǎng)基上發(fā)酵后產(chǎn)生的胡蘿卜素、黃酮等物質(zhì)有關，例如MDP可提高機體免疫功力及抗應激能力[25]，從而提高機體防御能力。在育苗過程中通過添加草分枝桿菌讓蝦苗攝食，與添加芽孢桿菌、乳酸桿菌及復合益生菌等活菌類微生態(tài)制劑增強凡納濱對蝦機體的免疫力和抗應激能力的機制不盡相同[30]，但菌體作為餌料被攝食，也可提高蝦苗的抗逆能力。

蝦苗質(zhì)量的優(yōu)劣直接影響標粗與養(yǎng)殖的成活率，而蝦苗的低鹽耐受性是體現(xiàn)其抗逆能力的重要的方面，直接影響其成活率，本試驗通過2次蝦苗標粗與養(yǎng)殖效果的定性跟蹤，從側面很好地說明了這一點。育苗過程的蝦苗質(zhì)量監(jiān)控至關重要，通過添加中草藥（芪參散）與草分枝桿菌的2次育苗試驗及標粗、養(yǎng)殖效果的定性跟蹤，發(fā)現(xiàn)二者之間存在較大關聯(lián)性，可能原因是芪參散與草分枝桿菌中的某些活性物質(zhì)讓蝦苗從小攝食后，完善和鞏固了蝦苗機體的免疫力、抗病力、抗應激能力等，達到扶正固本的作用，不但提高了育苗的效果，而且對標粗、養(yǎng)殖意義重大。至于2種添加物各自發(fā)揮作用的具體機制則有待進一步研究，以及二者配伍后在凡納濱對蝦育苗、養(yǎng)殖中的應用也需要進一步探究。

本研究發(fā)現(xiàn)凡納濱對蝦育苗過程中定期添加一定量的中草藥（芪參散）和草分枝桿菌能夠提高蝦苗的成活率及個體生長速度，以添加2.0%芪參散或1.0%草分枝桿菌效果顯著;同時可增強蝦苗的低鹽耐受性能力，以添加1%、2%芪參散或05%、1%草分枝桿菌效果明顯。因此，在凡納濱對蝦實際育苗過程中添加中草藥（芪參散）和草分枝桿菌，對培育高健康優(yōu)質(zhì)蝦苗具有重要意義。

參考文獻：

[1]張偉權. 世界重要養(yǎng)殖品種——南美白對蝦生物學簡介[J]. 海洋科學，1990，14（3）：69-73.

[2]梁華芳. 南美白對蝦室外育苗的初步試驗[J]. 水產(chǎn)科學，2003，22（2）：27-29.

[3]駱大鵬，何玉貴，楊明秋，等. 凡納濱對蝦室內(nèi)生態(tài)育苗技術[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2015（10）：256-257.

[4]王玉佩，肖培弘，孔玉敏，等. 臭氧在南美白對蝦工廠化育苗生產(chǎn)中的應用[J]. 漁業(yè)現(xiàn)代化，2006（1）：23-24.

[5]林更銘，楊清良，許章程. 對蝦無公害生態(tài)育苗[J]. 海洋科學，2007，31（10）：11-14.

[6]許章程. 益生菌在水產(chǎn)育苗中的應用研究[J]. 應用海洋學學報，2006，25（2）：279-284.

[7]陳輝輝，涂晨凌，唐 楊，等. 復方中草藥對凡納濱對蝦生長、消化酶和免疫因子活性及抗WSSV的影響[J]. 水產(chǎn)學報，2017，41（11）：1766-1778.

[8]周歧存，羅從彥，韓兆紅. 復合中草藥制劑對凡納濱對蝦生長及抗病力的影響[J]. 飼料研究，2006（9）：53-56.

[9]李 政，王國良，金 珊，等. 31種常見抗菌中藥對DPPH自由基清除作用的分析[J]. 漁業(yè)科學進展，2005，26（1）：38-40.

[10]Kesarcodi-Watson A，Kaspar H，Lategan M J，et al.Probiotics in aquaculture：the need，principles and mechanisms of action and screening processes[J]. Aquaculture，2008，274（1）：1-14.

[11]Francesca G，Diana D G，Loredana B，et al.The role of protective and probiotic cultures in food and feedand their impact in food safety[J]. Trends in Food Science and Technology，2011，22（1）：58-66.

[12]Farzanfar A. The use of probiotics in shrimp aquaculture[J]. Pathogens & Disease，2010，48（2）：149-158.

[13]Verschuere L，Rombaut G，Sorgeloos P，et al.Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture[J]. Microbiology & Molecular Biology Reviews，2000，64（4）：655-671.