劍蘭葉斑病病原菌的分離與鑒定

鐘文文 葛朝暉 許俊杰

摘要：對山東省臨沂市蘭山區(qū)、羅莊區(qū)、河東區(qū)及北城新區(qū)的觀賞花卉劍蘭葉部病害進行了調(diào)查和研究，利用常規(guī)方法對葉部病原菌進行了分離純化，得到1株純培養(yǎng)物lyxjj012。利用該菌的形態(tài)學特征和rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合柯赫氏法則和葉部解剖特征觀察，確認該葉斑病的病原真菌為葡萄殼小圓孢菌（Coniothyrium vitivorum Miura）。

關鍵詞：劍蘭;葉斑病;病原真菌;真菌鑒定;葡萄殼小圓孢菌

中圖分類號： S432.4+4? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0131-07

劍蘭又名菖蘭、唐菖蒲，是鳶尾科多年生草本植物，唐菖蒲原產(chǎn)于南非和地中海地區(qū)，在世界各地廣泛栽培[1]，常見的病害有根腐病、萎蔫病、葉枯病和病毒病等。我國通常作春植球根栽培，在栽培管理中病蟲害防治非常重要，延誤診治或措施不當都會造成品質(zhì)下降、減產(chǎn)甚至絕收[2]。據(jù)相關文獻記載，美國1947年曾有劍蘭花枯姜葉斑病發(fā)生的報道，此病首先在佛羅里達州發(fā)現(xiàn)，之后，亞拉巴馬州、紐約州、威斯康星州及太平洋西岸地區(qū)都有此病發(fā)生的報道。1986年有資料報道，在深圳平湖區(qū)栽植劍蘭花的年收入減少20萬元，其中一個主要原因就是遭到劍蘭花枯姜葉斑病的危害[3]。由此看來，劍蘭病害對劍蘭的觀賞種植、大面積推廣栽培都有嚴重威脅，開展劍蘭病害調(diào)查和病原物的研究有著重要的意義。

本試驗對山東省臨沂市蘭山區(qū)、羅莊區(qū)、河東區(qū)及北城新區(qū)的觀賞花卉劍蘭的調(diào)查和病原物進行了研究，旨在為劍蘭病害的防治提供理論依據(jù)和指導。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查及樣品采集

2016年4月至2017年8月對臨沂市蘭山區(qū)、羅莊區(qū)、河東區(qū)及北城新區(qū)劍蘭葉斑病進行調(diào)查，在調(diào)查過程中對其侵染規(guī)律、流行狀況、感病情況、發(fā)病癥狀等進行了觀察、記錄和拍照，同時采集具有代表性的感病葉片用于病原菌的分離。

1.2 病原菌的分離、純化和鑒定

1.2.1 病原菌的分離、純化

采用常規(guī)組織分離方法，挑取適量劍蘭葉片病斑組織，置于PDA培養(yǎng)基平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)1～2周，在體視鏡下挑取單菌落，并制片觀察，然后再利用單孢分離法進行純化培養(yǎng)，由此得到的菌株為純菌株。對分離物平板進行編號，同時記錄其菌落特征和顯微特征。

1.2.2 致病性測定

用0.2～0.5 cm的打孔器在分離得到的純菌落上打孔，分別得到若干數(shù)量的菌餅。選擇健康的劍蘭植株中部、上部葉片進行接種，將劍蘭葉片的表面用75%乙醇消毒，以菌餅為接種體進行接種，每種菌接2張葉，1張刺傷（用無菌牙刷在葉片表面刷3下），另1張不刺傷，每張葉片接種6～10個菌餅，同時設置對照。接種后保濕24 h，每隔1～2 d觀察其致病情況，連續(xù)觀察15 d以上，測定其致病性。

1.2.3 病原菌的確認

1.2.3.1 柯赫氏法則驗證

將純化后的致病性菌株回接種到健康的劍蘭葉片上，觀察有刺傷的葉片癥狀和無刺傷的葉片癥狀與田間自然發(fā)病是否相同，并設置對照。對發(fā)病葉片的病斑進行常規(guī)分離，以此確認接種菌是否為劍蘭葉斑病的病原菌。

1.2.3.2 葉片病斑組織解剖觀察

選取含有病斑的劍蘭葉片，用清水沖洗干凈，然后再用無菌水洗 1～3遍，保證葉片表面沒有附著其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法切取病斑及其周圍的葉片組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗證。

1.2.4 病原菌形態(tài)學的特征觀察

病原菌的培養(yǎng)性狀觀察，將病原菌移接于PDA平板上，25 ℃培養(yǎng)7～14 d，記錄菌落形態(tài)和顏色，檢測分生孢子的形狀和大小等形態(tài)學特征。

1.2.5 病原菌rDNA-ITS的PCR擴增和序列分析

1.2.5.1 病原菌總DNA的提取 試驗菌株為lyxjj012。菌絲培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基（PDB），28 ℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，離心收集菌絲體，經(jīng)冷凍干燥后置于-20 ℃冰箱保存。利用Omega公司試劑盒提取DNA。

1.2.5.2 rDNA-ITS的PCR擴增與序列測定 采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴增該病原菌的ITS和5.8S rDNA。PCR反應采用50 μL反應體系，包括模板DNA溶液2.0 μL（約10 ng）、10×PCR buffer 5.0 μL、2.5 mmol/L dNTP 4.0 μL、7.5 pmol/μL ITS1和ITS4引物各1.5 μL、5 U/μL Taq酶（含MgCl2）0.5 μL、加ddH2O至 50 μL。擴增反應程序為：94 ℃預變性3 min;94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個循環(huán);最后72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。切膠回收PCR產(chǎn)物，委托山東省農(nóng)業(yè)科學院測序中心進行純化和序列測定。

1.2.5.3 病原菌rDNA ITS序列分析 將菌株lyxjj 012的rDNA ITS序列在NCBI網(wǎng)站上，用BLAST軟件與GenBank中已知種屬的rDNA進行序列比對和同源性分析，或者參照DNAMAN和Mega 6.0軟件，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，用以輔助鑒定病原菌的種類。

2 結(jié)果與分析

2.1 劍蘭葉斑病的危害與癥狀特點

劍蘭葉斑病在各城區(qū)均有發(fā)生，發(fā)病嚴重的田塊病葉率可達20%以上，特別是在7—8月，氣溫高，降雨多，該病可在2周左右暴發(fā)流行，造成大量的葉片快速感病。該病主要危害劍蘭的葉片，也可危害莖部。通常是中部、下部葉片先發(fā)病，而且發(fā)病較為嚴重，病斑初為灰白色或者淡褐色小斑點，后擴展成近圓形、橢圓形或不規(guī)則形（圖1-B、圖1-C），病斑邊緣不整齊，有明顯輪生癥狀，灰褐色至灰白色，稍凹陷，有時可出現(xiàn)不規(guī)則的同心輪紋，病斑可相互連結(jié)成片，濕度大時葉片正面有橘紅色黏質(zhì)小點。有時葉尖先發(fā)病，病原菌通過流水、風或其他方式把孢子傳播到其他部位，甚至導致整個葉片發(fā)病，最后嚴重時整片葉枯死。葉片干枯部分經(jīng)雨后或者在冬季常常有黑色或者褐色顆粒點狀物，該顆粒物為病原菌分生孢子器。通常下部葉片受害較為嚴重，危害癥狀見圖1-A。

2.2 病原菌的鑒定

2.2.1 病原菌的分離和純化

從臨沂市各城區(qū)采集劍蘭病葉若干，從中選取12張具有代表性的葉片，于PDA培養(yǎng)基平板上分離病原菌25 ℃條件下培養(yǎng)，各標樣均于4～7 d長出相似的灰白色、絨毛狀菌落，5～7 d菌落開始變成灰褐色。將純化后的菌株分別編號為lyxjj001～lyxjj012。

2.2.2 病原菌的確認

2.2.2.1 柯赫氏法則驗證 將12個純化后的菌株重新接種到健康的劍蘭葉片上（圖2），回接7～14 d，接種菌絲塊的劍蘭葉片全部發(fā)病，有刺傷的葉片發(fā)病比無刺傷的葉片早1～4 d，癥狀與田間觀察到的相同，對照不發(fā)病;用發(fā)病的病斑進行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌完全一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為劍蘭葉斑病的病原菌。

2.2.2.2 葉片病斑組織解剖觀察驗證 選取含有病斑的劍蘭葉片，用清水沖洗干凈，然后再用無菌水洗1～3遍，保證葉片表面沒有附著的其他微生物和塵土顆粒。利用徒手切法，切取病斑及其周圍的葉片組織，選取合適材料制成玻片，用于病原菌的顯微觀察和驗證，驗證結(jié)果如圖3-A、圖3-B。從圖3可以看出，表面除病原菌菌絲和孢子之外，未見其他菌絲和孢子。氣孔周圍的孢子形態(tài)特征和病原菌分離物形態(tài)完全一致。從導管、篩管以及無明顯病斑的葉片中也觀察到孢子的存在。由此可證明，該菌為致病菌。

2.2.3 病原菌的形態(tài)特征

2.2.3.1 病原菌的菌落特征 分離到的12個菌株的形態(tài)特征基本一致，在25 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d，形成圓形菌落，菌落平展，生長速度中等，菌落灰白色至淡褐色，菌絲部分埋生、部分表生，背面淡褐色（圖4-A、圖4-B）。在15 ℃ PDA培養(yǎng)基上，培養(yǎng)2～4周后，菌落顏色呈白色至淡褐色，短絨毛狀，較致密，4周后可見菌絲下面的顆粒狀分生孢子器（圖4-C、圖4-D、圖4-E）。

2.2.3.2 顯微特征觀察 對25個病害標樣的12個病原菌株的鑒定均獲得基本一致的結(jié)果，表明病原菌組成比較單一。通過徒手切片法切取帶有病斑和黑色點狀分生孢子器的劍蘭新鮮葉片，制片在顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果見圖5，孢子和菌絲在葉片表面均有分布，而且孢子多聚集在氣孔周圍，其他部位有零星分布;菌絲淡色在葉片表面呈不規(guī)則分布，淡色，有分枝，偶見膨大厚垣細胞和褐色細胞的集合體，菌絲體與分離培養(yǎng)物的特征較為一致，菌絲寬度2～10 μm，膨大細胞端部寬度達18 μm。由此可確認，導致葉片病害的病原菌是單一的真菌種類。

菌絲無色，表面光滑，多分枝，菌絲端部細胞多膨大，且菌絲體常呈枝狀（圖5-F）。菌絲寬度 2.5～25.0 μm，無孢子產(chǎn)生，應該屬于無性階段。這種特殊結(jié)構(gòu)的存在可能有助于有性階段分生孢子器的形成。該菌在溫度為15 ℃條件下培養(yǎng)，菌落生長緩慢，14 d后菌落直徑可達2.5～4.5 cm，菌落灰白色至淡褐色，菌絲體短絨毛狀，其下可見黑色分生孢子器顆粒（圖4-C、圖4-E）。挑去分生孢子器在顯微鏡下觀察，可見圓球狀或者橢球狀的分生孢子器，分生孢子器黑色，單生，球形，直徑200～360 μm，分生孢子器開口不甚明顯，成熟的或者擠壓后分生孢子器會產(chǎn)生1個以上的裂口，釋放出分生孢子（圖5-A、圖5-B、圖5-C）。菌絲淡色，有分枝，菌絲端部常膨大呈球狀或者橢球狀，菌絲寬度2～10 μm，光滑（圖4-D、圖4-E）。菌絲端部特化成產(chǎn)孢細胞，柱狀、光滑、淡色、4～8 μm，分生孢子梗短，孔口和分生孢子梗有時特化不明顯，在分生孢子器中的產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)物基本相同。分生孢子梗直或者彎曲，結(jié)構(gòu)見圖4-D、圖4-E、圖4-F。分生孢子褐色，圓球形或者橢圓形，光滑，直徑3～9 μm。菌落、產(chǎn)孢細胞、分生孢子和分生孢子器的特征與絲蘭褐疽病菌（Paraphaeosphaeriopsis recurvifoliae）[4]的特征非常相似，但是，絲蘭褐疽病菌有子囊殼和子囊，而分離物lyxjj012沒有子囊殼和子囊，所以不屬于絲蘭褐疽病菌。該菌的形態(tài)學特征與絲蘭小殼霉（C. concentricum）[5]、葡萄殼小圓孢菌（C. concentricum）。絲蘭小殼霉分生孢子卵形至近球形，黃色，后變褐色，3.5 μm×3.0～4.5 μm，而本分離物孢子多為球形，大小直徑3～9 μm，由此可以看出該分離物不屬于絲蘭小殼霉，但與核桃內(nèi)生葡萄殼小圓孢菌（C. vitivorum）[6]更為相似，故將其暫定為葡萄殼小圓孢菌（C. vitivorum）。

2.2.4 病原菌致病機理的初步觀察

在植物與病原菌的親和互作中，一些真菌利用寄主表面的氣孔或創(chuàng)傷入侵。通常會產(chǎn)生一些由特化菌絲形成的侵染結(jié)構(gòu)，如侵染墊（infection cushion）、附著胞（appressorium）、吸器（haustorium）等幫助病原真菌入侵并與寄主建立寄生關系，造成植物感染[7-8]。

從本研究的觀察結(jié)果可知，該病原菌侵染機制有所不同，分生孢子從分生孢子器中釋放出來后，隨雨水或者風力等散播作用首先聚集在氣孔周圍（圖6-B、圖6-G、圖6-H），之后分泌一種紅色或者褐色球狀體，緊靠在細胞上;這些球狀體內(nèi)含葉綠素和其他褐色物質(zhì)，多聚集在氣孔周圍，而且氣孔周圍的小球與其他位置相比較大。最大的直徑70 μm，小球慢慢往其他細胞擴散，同時細胞也慢慢變成褐色，氣孔周圍的細胞內(nèi)積累大量的褐色物質(zhì)，這些褐色物質(zhì)可能是酚類物質(zhì)。致病因子一般包括各種酶類，如胞壁降解酶、毒素、生長調(diào)節(jié)物質(zhì)及其類似物。至于這種紅色球和褐色球是液泡還是其他什么物質(zhì)，是不是直接侵染因子，有待于進一步研究。受害部位褐變后，細胞喪失正常功能而變?yōu)樯詈稚“?，有時也特化成分生孢子器（圖6-A、圖6-C、圖6-D、圖6-E、圖6-F、圖6-I）。

2.2.5 病原菌rDNA-ITS的序列分析及同源性

因為真菌形態(tài)學特征受培養(yǎng)基和基質(zhì)影響較大，所以單純進行形態(tài)學分類還缺乏一定的科學性。為進一步確定該分離物是否為絲蘭小殼霉，本研究從12個菌株中隨機選取菌株lyxjj012，克隆并分析該菌的rDNA-ITS序列。菌株lyxjj012的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到1個568 bp的基因序列片段（圖7）。將菌株lyxjj012的rDNA ITS基因序列與GenBank 中已有的21個親緣關系較為相近的 DNA序列進行同源性比較，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，結(jié)果見圖8。從同源性比較可知，該菌株與絲蘭小殼霉 （菌株登錄號為MH860889.1）同源性100%，與擬暗球腔菌P. phacidiomorpha（菌株登錄號為FJ462742.1）、絲蘭褐疽病菌（菌株登錄號為AY957476.1和 MN121340.1）、葡萄殼小圓孢菌（菌株登錄號為EU520058.1）和P. yuccae（菌株登錄號為KY554482.1）同源性均為99%。由圖8可知，與該菌株親緣關系較近的是擬暗球腔菌和絲蘭褐疽病菌，其次是絲蘭小殼霉、P. yuccae和葡萄殼小圓孢菌。該菌與絲蘭褐疽病菌、P. yuccae和擬暗球腔菌的同源性達99%，但是由于本分離物不產(chǎn)子囊和子囊孢子，所以該分離物不屬于此三者。除此之外，該菌與絲蘭小殼霉同源性為100%，但是形態(tài)特征明顯不同。綜上所述，該分離物lyxjj012與葡萄殼小圓孢菌種類最為接近，故將其鑒定為葡萄殼小圓孢菌。

3 結(jié)論與討論

利用該菌的形態(tài)特征和rDNA-ITS基因序列系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)合柯赫氏法則和葉部解剖特征觀察，確認了劍蘭葉斑病的病原真菌為葡萄殼小圓孢菌。

3.1 劍蘭病原菌的種類存在多樣性

深圳動植物檢疫所劍蘭花枯萎葉斑病調(diào)查組1986研究報道，劍蘭花枯萎葉斑病病原菌為彎孢霉菌[Curvularia lunata（Wakker）]。梁麗華報道，3種劍蘭病害頸腐?。≒seudomona marginata）、葉枯?。˙otrytis gladiolorum）和鐮刀菌爛?。‵usarium xysporum）[9]，表明劍蘭上的病害不止1種。絲蘭和劍蘭為同一科植物，形態(tài)特點較為相似。田雪亮等研究報道，絲蘭輪紋斑菌為絲蘭褐斑病病原菌[10]，賁海燕報道，曾在絲蘭上發(fā)病，并命名褐疽病[11]，于麗娜采用核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）對冬棗（Zizyphus jujuba）黑點病病原菌進行分子水平上的鑒定，利用通用引物擴增了病原菌桑殼小圓孢菌（C. fucsidulum Sacc），該菌屬半知菌亞門腔孢綱球殼孢目盾殼霉屬[12]。問小強研究了核桃內(nèi)生菌葡萄殼小圓孢菌的次生代謝物[6]。呼洪圖報道了葡萄白腐菌[C. diplodiella（Speg.）Sacc][13]。徐文濤報道了核桃內(nèi)生真菌葡萄殼小圓孢菌[14]，這為研究劍蘭病原菌的鑒定提供了資料。李曉琴對上海地區(qū)唐菖蒲（劍蘭）干腐病病原種類進行了分離鑒定，研究了病原菌的生物學特性，將唐菖蒲（劍蘭）干腐病病原初步鑒定為唐菖蒲尖鐮孢（F. oxysporum）[15]，從劍蘭葉片上未發(fā)現(xiàn)該病原菌，但是筆者在研究的同時也發(fā)現(xiàn)1株劍蘭內(nèi)生菌，該菌為變紅鐮刀菌（F. incarnatum），至于該菌是否為劍蘭葉片致病菌還有待于進一步研究。葡萄殼小圓孢菌在劍蘭上尚屬首次報道。以上研究結(jié)果表明，不同地區(qū)劍蘭葉部病害的病原菌種類的確存在不同。所以，明確各地的病原菌種類，對進一步研究該病的發(fā)生與流行，以及通過品種改良來提高品種的抗病性均具有重要意義。

3.2 侵染機制和生物學特性

本試驗對菌絲侵染機制和生物學特性進行了初步研究，未發(fā)現(xiàn)該分離菌lyxjj012產(chǎn)生子囊和子囊孢子，但Cmara等報道，擬暗球菌屬（Phaeosphaeriopsis）真菌可產(chǎn)生3～5個子囊孢子[16]，這與本研究結(jié)果葡萄殼小圓孢菌的特點是不同的。Lee等也未報道有子囊和子囊孢子的存在，因此須要對lyxjj012分離菌的其他特點繼續(xù)開展深入研究[4]。

3.3 分子鑒定的輔助作用

本研究利用培養(yǎng)特征鑒定菌種的同時，對劍蘭葉片制備切片進行觀察，給柯赫氏法則提供了解剖特征方面的依據(jù)。相關學者認為，僅根據(jù)形態(tài)學特征來進行病原菌種的鑒定與分類通常是不適當?shù)模栽诖嘶A上，筆者研究了lyxjj012菌株的 rDNA-ITS基因序列。DNA ITS是介于18S rDNA、5.8S rDNA和28S rDNA之間的區(qū)域，該區(qū)域進化速度較編碼區(qū)快，可以提供足夠多的變異來進行種間或種內(nèi)的分子系統(tǒng)研究。隨著分子生物學技術的發(fā)展，rDNA-ITS序列分析已廣泛應用于植物病原真菌的分類和系統(tǒng)發(fā)育研究。本試驗以傳統(tǒng)的形態(tài)學特征為基礎，并對臨沂市劍蘭葉部病原菌 rDNA-ITS 序列進行分析和比對，從分子生物學水平上將病原菌鑒定為葡萄殼小圓孢菌，為進行該病害的防治和抗性品種選育研究提供理論依據(jù)。

3.4 應用開發(fā)前景

國內(nèi)外有關盾殼霉屬（Coniothyrium）內(nèi)真菌的研究多集中在其次生代謝物和生防功能的研究方面，葡萄殼小圓孢菌具有重要的開發(fā)前景。Siu等研究報道，盾殼霉屬內(nèi)真菌可以引起人類暗色絲孢菌病[17]。目前，國內(nèi)外研究較多的是盾殼霉（C. minitans）。該菌是油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）重要的重寄生菌，同時還會產(chǎn)生少量的抗真菌物質(zhì)[17]。盾殼霉cmsit[STBX]1[STBZ]基因在菌核寄生盾殼霉菌中不間斷表達，導致其生長抑制和增強抗真菌能力[18]。用盾殼霉真菌可以防治由油菜菌核病菌引起的大豆白腐病，減少農(nóng)藥的使用[19]。盾殼霉（C. minitans）是植物絲核病原菌的絲核和菌絲寄生菌[20-21]。海洋生物內(nèi)生真菌谷類錐孢菌（C. cereale）可以產(chǎn)生phenalenone類次生代謝物[22]。醫(yī)用植物裸莖楤木（Aralia nudicaulis）盾殼霉屬內(nèi)生菌可以產(chǎn)生天然抗細菌活性物質(zhì)[23]。cmpacC因子是盾殼霉重寄生作用調(diào)節(jié)的活化劑，也是草酸降解和抗真菌活性的抑制劑[24]。海洋藻生真菌谷類錐孢菌可以產(chǎn)生多種phenalenone 物質(zhì)[25]?？傊?，有關盾殼霉的研究報道較多，而有關該菌的研究報道較少，因此，對該菌進一步研究具有廣闊的前景。

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收稿日期：2019-08-07

基金項目：山東省自然科學基金（編號：ZR2017LC001）。

作者簡介：鐘文文（1978—），女，山東臨沂人，碩士，講師，從事微生物學教學和研究。E-mail：Zhongwenwen@lyu.edu.cn。

通信作者：許俊杰，博士，副教授，從事真菌分類及真菌資源利用研究。E-mail：xujunjie@lyu.edu.cn。