聲波處理增強(qiáng)擬南芥的抗病性

艾干 鄭芷若 張小藝 朱海 李田麗 夏慶月 竇道龍 景茂峰

摘要：近期研究發(fā)現(xiàn)，聲波可以激發(fā)植物的防衛(wèi)反應(yīng)，提高植物抗病性。然而，植物感知聲波誘導(dǎo)抗病的分子機(jī)制還缺乏深入研究。選定特定頻率和振幅的聲波處理擬南芥，考察擬南芥與病原細(xì)菌丁香假單胞菌互作的影響。結(jié)果表明，聲波預(yù)處理后植株葉片中的細(xì)菌生長量相比于對照組降低87.5%。利用轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，擬南芥共有317個基因發(fā)生差異表達(dá)，其中有232個上調(diào)表達(dá)基因，85個下調(diào)表達(dá)基因，并且這些上調(diào)表達(dá)基因主要富集于防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)基因。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，2個防衛(wèi)反應(yīng)關(guān)鍵基因PR1和FRK1顯著上調(diào)表達(dá)，說明聲波處理可以通過激活擬南芥的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)，增強(qiáng)植物對丁香假單胞菌的抗性。最后，利用MEME軟件分析聲波處理后上調(diào)表達(dá)的基因的保守轉(zhuǎn)錄元件，鑒定了 “AAXXAGAGAG”等3個特異性響應(yīng)聲波的轉(zhuǎn)錄元件。研究結(jié)果綜合表明聲波處理可以明顯提高植物的抗性，這為把聲波用于作物病害控制奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：聲波;植物抗病;擬南芥;丁香假單胞;防衛(wèi)反應(yīng)

中圖分類號： S432.2? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）14-0125-06

植物沒有動物類似的神經(jīng)系統(tǒng)和運(yùn)動器官，卻須要適應(yīng)復(fù)雜而多變的環(huán)境，因此在漫長的進(jìn)化過程中，植物進(jìn)化出多種復(fù)雜的機(jī)制感受周圍環(huán)境的變化以調(diào)節(jié)自身生長發(fā)育。聲波作為環(huán)境中的一種機(jī)械刺激，可以引起植物的多種復(fù)雜反應(yīng)，包括觸摸形態(tài)學(xué)建成[1]、開花、衰老、葉綠素含量、激素水平、氣孔開閉以及生物和非生物脅迫抗性水平等[2]。有證據(jù)顯示植物對自然聲音有響應(yīng)，比如，植物在處于蜜蜂產(chǎn)生特定頻率的嗡嗡聲中時(shí)會從花藥中釋放出花粉，這種行為被稱作振動傳粉[3]。通過“綠色音樂”（如鳥類和蟋蟀的“歌唱”等聲音）處理后，大白菜中多胺和氧氣吸收量的增加也證實(shí)了這一特性[4]。此外，還有證據(jù)表明植物可以選擇性地響應(yīng)特定頻率的聲波，例如菜青蟲咀嚼聲引起的振動可以誘導(dǎo)擬南芥的化學(xué)防御。然而，在同一研究中，葉蟬發(fā)出的聲波卻未能引發(fā)防御反應(yīng)[5]。在 1 400 Hz 聲波處理下，菊花顯示出吲哚-3-乙酸的積累和脫落酸含量減少[6]。玉米幼根生長于特定聲音頻率（220 Hz）下，表現(xiàn)出趨音性[7]。上述研究表明植物已進(jìn)化出了對聲波的響應(yīng)機(jī)制，有假說認(rèn)為細(xì)胞骨架-質(zhì)膜-細(xì)胞壁界面在聲波感知中發(fā)揮了重要作用[4]。

在對水稻、小麥和番茄等作物的研究中，發(fā)現(xiàn)聲波可以刺激種子萌發(fā)，增加果實(shí)數(shù)量，增長作物株高，增多作物分蘗數(shù)和提高作物產(chǎn)量[8]。聲波的預(yù)處理甚至可以緩解水稻面臨的干旱脅迫[9]。1 000 Hz 的聲波處理會提高菊花、石斛和獼猴桃的品質(zhì)[8]。有研究表明，擬南芥可以通過感知昆蟲食草時(shí)產(chǎn)生的聲波，從而引發(fā)系統(tǒng)化學(xué)防御[5];聲波還可以誘導(dǎo)草莓的抗病性[10]，增強(qiáng)擬南芥對灰霉菌的抗性[10-11]。聲波是一種無污染、耗能少、適用性高的物理手段。依托聲波處理的病害防控和生長調(diào)控技術(shù)可能是未來增加作物抗病性的一種簡單且經(jīng)濟(jì)的方法，了解聲波介導(dǎo)抗性的機(jī)制將能更好地指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。為了探索聲波是否能誘導(dǎo)植物對半活體病原菌的抗性，并解析聲波誘導(dǎo)植物抗性的機(jī)制，本研究以模式植物擬南芥和半活體模式病原菌丁香假單胞菌作為研究對象，研究聲波處理對擬南芥抗丁香假單胞菌能力和基因表達(dá)的影響。由于植物響應(yīng)聲波的特異性，還對聲波誘導(dǎo)后上調(diào)的基因進(jìn)行保守轉(zhuǎn)錄元件的預(yù)測，鑒定3個特異性響應(yīng)聲波的轉(zhuǎn)錄元件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和植物材料

本研究中使用的植物材料擬南芥生長環(huán)境為22 ℃，10 h光照、14 h黑暗的人工氣候室。

所用接種菌株為丁香假單胞菌菌株（Pst）DC3000，于含有相應(yīng)抗性的KB培養(yǎng)液（蛋白胨 20 g，甘油10 mL，K2HPO4 15 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，加水定容至10.0 mL）中搖菌后保存成20%的甘油菌于-70 ℃冷凍保存。丁香假單胞菌于 28 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 聲波處理

參考前人研究結(jié)果[3，6]，選擇500 Hz、100 dB作為聲波處理的頻率和振幅。將生長30 d的擬南芥植株分別放入2個條件一樣的光照培養(yǎng)箱中，在處理組的培養(yǎng)箱中放入一個音箱，持續(xù)播放電腦生成的500 Hz聲波，并結(jié)合分貝儀將音量調(diào)整至 100 dB。對照組的培養(yǎng)箱不作處理。聲波處理 30 min 后進(jìn)行接種或轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）。

1.3 丁香假單胞菌接種分析

首先取Pst相應(yīng)菌株，重新活化后挑取單克隆接種于KB液體培養(yǎng)基中，28 ℃過夜培養(yǎng)。4 000 r/min 離心5 min收集菌體。再用滅菌的去離子水懸起菌體洗滌3次。調(diào)整菌體濃度為 106 CFU/mL。然后選擇聲波處理過的和未處理的擬南芥植株，用去針頭的1 mL注射器從葉片背面將菌液注滿整個葉片。每株植物注射2張葉片作為1個樣品，每次試驗(yàn)每種材料至少需要6個重復(fù)樣品。接種完畢用紙擦干葉片表面殘余菌液，3 d后剪取葉片并將2張葉疊在一起，用直徑為0.74 cm的打孔器獲取樣品放于裝有100 μL滅菌水的離心管中，磨碎樣品后再加900 μL水稀釋后取20 μL菌液涂布平板。2 d后統(tǒng)計(jì)平板上長出的菌落數(shù)。5 d后觀察發(fā)病癥狀。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR

用液氮速凍聲波處理后的擬南芥葉片，使用總RNA提取試劑盒提取RNA。采用D260 nm/D280 nm評估RNA樣品質(zhì)量。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。相對定量PCR采用試劑盒進(jìn)行試驗(yàn)。相對定量PCR引物actin-F：5′-GGAACTGGAATGGTGAAGGCTG-3′，actin-R：5′-CGATTGGATACTTCAGAGTGAGGA-3′，PR1-F：5′-TGGTCACTACACTCAAGTTGTT-3′，PR1-R：5′-GCTTCTCGTTCACATAATTCCC-3′，F(xiàn)RK1-F：5′-TATATGGACACCGCGTATAGTG-3′，F(xiàn)RK1-R：5′-ATAAAACTTTGCGTTAGGGTCG-3′。

1.5 生物信息學(xué)分析

1.5.1 轉(zhuǎn)錄組測序 采用Illumina高通量測序平臺對RNA樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到雙末端讀長 （150 bp）的原始測序數(shù)據(jù)。為了使后續(xù)分析結(jié)果更加可靠準(zhǔn)確，去除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和含有接頭污染的數(shù)據(jù)。隨后使用Tophat軟件將測序讀長匹配到擬南芥的基因上，得到擬南芥每個基因?qū)?yīng)的讀長數(shù)，并對其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，即采用每百萬條讀段中來自于某基因每千堿基長度的讀段數(shù)（reads per kilobase per million mapped reads，RPKM）代表基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。得到基因的RPKM之后，以2倍作為差異基因篩選條件，并通過Cufflinks軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性分析，以P<0.05、差異表達(dá)倍數(shù)2倍以上為標(biāo)準(zhǔn)，得到顯著差異表達(dá)的基因。

1.5.2 轉(zhuǎn)錄組和生物信息學(xué)分析 GO富集分析使用agriGO（http：//systemsbiology.cau.edu.cn/agriGOv2/index.php）獲得，MapMan分析使用MapMan軟件（https：//mapman.gabipd.org/）進(jìn)行。

1.5.3 轉(zhuǎn)錄元件鑒定 提取轉(zhuǎn)錄組分析中上調(diào)表達(dá)基因的啟動子區(qū)域（1 000 bp），利用MEME軟件的默認(rèn)參數(shù)進(jìn)行保守motif鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 聲波處理增強(qiáng)了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性

為探究聲波是否影響植物對病原菌的抗性，采用500 Hz恒定頻率與100 dB恒定振幅處理擬南芥30 min。使用丁香假單胞菌DC3000分別接種對照組與處理組，并調(diào)查和統(tǒng)計(jì)擬南芥發(fā)病情況。結(jié)果顯示，處理組中接種后的擬南芥葉片的癥狀較輕，而對照組的葉片已經(jīng)發(fā)黃皺縮（圖1-A），癥狀明顯，說明該條件聲波的預(yù)處理明顯提高了擬南芥對丁香假單胞菌DC3000的抗性。同時(shí)，對葉片中細(xì)菌生長量進(jìn)行進(jìn)一步測定發(fā)現(xiàn)，聲波預(yù)處理后的植株葉片中的細(xì)菌生長量相比于對照組降低87.5%（圖1-B）。這表明聲波處理可以明顯增強(qiáng)擬南芥對丁香假單胞菌的抗性。

2.2 聲波處理改變了擬南芥轉(zhuǎn)錄組譜

為進(jìn)一步揭示聲波促進(jìn)植物對丁香假單胞菌抗性的機(jī)制，利用RNA-seq技術(shù)檢測聲波處理前后擬南芥的轉(zhuǎn)錄組變化。本試驗(yàn)對2個經(jīng)過不同處理的樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本測序，處理組為500 Hz、100 dB聲波處理30 min后的擬南芥，對照組為相同條件下未經(jīng)聲波處理的擬南芥。對照組與處理組測序后分別共獲得44 395 768、45 668 332個過濾后數(shù)據(jù)讀段。每個樣品的過濾后數(shù)據(jù)與參考基因組的平均比對率為83%，表明測序結(jié)果可靠。對測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，聲波處理后擬南芥共有317個基因發(fā)生差異表達(dá)（差異顯著性小于0.05，差異倍數(shù)大于2），其中232個上調(diào)表達(dá)基因，85個下調(diào)表達(dá)基因（圖2-A），約占擬南芥總基因數(shù)的0.8%。因?yàn)镚hosh等報(bào)道了在聲波處理后，EXL1和HSPRO2等關(guān)鍵標(biāo)志S基因上調(diào)表達(dá)[10]，為驗(yàn)證本試驗(yàn)中 RNA-seq的可靠性，對聲波處理的這2個標(biāo)志基因進(jìn)行定量試驗(yàn)。結(jié)果表明，EXL1在聲波處理15、30、60 min后分別上調(diào)表達(dá)2.56、3.72、3.25倍，而HSPRO2在聲波處理 15、30、60 min后分別上調(diào)表達(dá)2.32、56.72、3.45倍（圖3-A）。這些結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果一致。表明本試驗(yàn)樣品處理和 RNA-seq結(jié)果較可靠。

通過GO富集分析對這些差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，結(jié)果表明它們主要富集于刺激反應(yīng)（GO：0050896）、應(yīng)激反應(yīng)（GO：0006950）、化學(xué)刺激反應(yīng)（GO：0042221）、有機(jī)物反應(yīng)（GO：0010033）、生物刺激反應(yīng)（GO：0009607）、其他有機(jī)體反應(yīng)（GO：0051707）等重要生物學(xué)過程（圖2-B）。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，聲波處理后，擬南芥在刺激反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)和化學(xué)刺激反應(yīng)等過程中上調(diào)基因富集明顯，其抗逆反應(yīng)相關(guān)的通路受到了影響。

2.3 聲波處理激活了擬南芥的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)

對上調(diào)表達(dá)的基因進(jìn)行進(jìn)一步的GO富集分析，找到富集差異基因的GO分類條目，尋找不同樣品的差異基因可能與哪些基因功能的改變有關(guān)，結(jié)果表明，上調(diào)表達(dá)基因中防衛(wèi)反應(yīng)（GO：0006952）的通路顯著富集。利用MapMan軟件對擬南芥受聲波處理后的防衛(wèi)通路進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，大量防衛(wèi)相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，如病程相關(guān)蛋白基因PR1和植物防御素基因PDF1.2等擬南芥防衛(wèi)反應(yīng)的標(biāo)志基因顯著上調(diào)，分別上調(diào)表達(dá)19.62、60.21倍（圖4）。另外，參與質(zhì)體極性運(yùn)輸和脫落酸信號途徑、調(diào)控植株抗病性的基因PCC1（ID：AT3G22231）上調(diào)表達(dá)18.84倍;幾丁質(zhì)酶等防衛(wèi)基因，如CHI基因（ID：AT1G02360）上調(diào)表達(dá)17.23倍;NB-LRR基因（ID：AT3G04210、AT1G58170），分別上調(diào)表達(dá)252、2.49倍。上述結(jié)果初步顯示聲波處理激發(fā)了植物的抗病防衛(wèi)信號途徑，為了進(jìn)一步驗(yàn)證此結(jié)果，利用定時(shí)定量PCR技術(shù)驗(yàn)證聲波處理后PR1和PDF1.2基因分別在聲波處理0、15、30、60 min后的表達(dá)量，結(jié)果表明PR1基因在處理15、30、60 min分別上調(diào)表達(dá)2.61、634、5.46倍;PDF1.2基因在聲波處理后分別上調(diào)表達(dá)30.95、4.06、1.50倍;病原菌相關(guān)分子模式誘導(dǎo)的植物免疫（PAMP-triggered immunity，PTI）的關(guān)鍵基因FRK1同樣上調(diào)表達(dá)，分別上調(diào)表達(dá)1.86、2.47、3.76倍（圖3-B）。上述結(jié)果顯示，富集在防衛(wèi)反應(yīng)相關(guān)通路的相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)，表明聲波處理可以激活擬南芥的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)。

2.4 受聲波誘導(dǎo)的基因啟動子區(qū)域的保守元件的鑒定

為鑒定聲波誘導(dǎo)的啟動子區(qū)域的保守元件，分別將上調(diào)表達(dá)基因和下調(diào)表達(dá)基因的啟動子區(qū)域（1 500 bp）進(jìn)行提取，利用MEME軟件分析受聲波誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)的保守轉(zhuǎn)錄元件和受聲波誘導(dǎo)下調(diào)的保守轉(zhuǎn)錄元件，結(jié)果顯示在232個上調(diào)表達(dá)的基因中，有150個基因的啟動子中含有“TXTXTXXTXX”保守元件（元件1），有114個含有“AAXAXXAAAA”保守元件（元件2），有48個含有“AAXXAGAGAG”保守元件（元件3）（圖5-A），其中，10個基因共同含有這3個保守元件，65個基因同時(shí)含有第1個和第2個保守元件，16個基因同時(shí)含有第1個和第3個保守元件，17個基因同時(shí)含有第2個和第3個保守元件（圖5-B）;在83個下調(diào)表達(dá)基因的啟動子中沒有發(fā)現(xiàn)保守的序列元件。上述結(jié)果表明，植物中特異性響應(yīng)聲波的基因可能受轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合特異的轉(zhuǎn)錄元件調(diào)控。

3 討論與結(jié)論

聲波無害且易于操控，有可能是未來作物病害控制的一種值得嘗試的簡易方法。了解聲波介導(dǎo)抗性機(jī)制將有助于更好地指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。前人研究發(fā)現(xiàn)，聲波處理可以增強(qiáng)植物對灰霉的抗性。但是，對于聲波處理所誘導(dǎo)的抗菌譜的廣度和深度還是了解得不多。因此，本研究在擬南芥中明確了聲波能夠提高植物對細(xì)菌的抗性，同時(shí)通過轉(zhuǎn)錄組探究了其作用機(jī)制。在植物感知環(huán)境刺激后，許多信號以級聯(lián)反應(yīng)的方式傳導(dǎo)，從而調(diào)整植物自身相關(guān)生命活動。刺激信號的獲取、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子生理反應(yīng)是植物在刺激作用下依次發(fā)生的3個主要階段。在本次研究中，擬南芥在聲波處理后，差異表達(dá)的基因數(shù)量較少，說明聲波處理對植物的影響并不大。但是，這些差異表達(dá)的基因大部分與抗性有關(guān)，說明聲波處理可能特異性激活了植物的抗性反應(yīng)，也解釋了為什么聲波處理會增強(qiáng)植物對細(xì)菌的抗性。植物防衛(wèi)反應(yīng)的激活常伴隨著許多標(biāo)志性事件，如鈣瞬變[12]、活性氧爆發(fā)[13]、激素水平調(diào)整[10，14-15]、離子通道通透性變化[16-17]、轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組改變[18]等，同時(shí)發(fā)生很多抗病反應(yīng)標(biāo)志基因的上調(diào)表達(dá)[10]。本研究的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果揭示了與這些標(biāo)志性細(xì)胞活動相關(guān)基因在表達(dá)譜中的巨大變化，如PR1、PDF1.2和FRK1等基因。定量驗(yàn)證也保證了轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的可信度。同時(shí)，為尋找響應(yīng)聲波誘導(dǎo)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，本研究對差異表達(dá)的基因啟動子進(jìn)行MEME分析發(fā)現(xiàn)3個候選的保守原件，這為今后的研究打下了基礎(chǔ)。

怎樣在提高抗病性的同時(shí)不危害植物生長是一直以來的研究難點(diǎn)，植物抗病與生長往往是拮抗的，過度的免疫反應(yīng)往往導(dǎo)致植物的正常生長受損，帶來不必要的產(chǎn)量損失。而從植物防衛(wèi)反應(yīng)的標(biāo)志基因PR1、PDF1.2和FRK1的誘導(dǎo)表達(dá)量來看，聲波誘導(dǎo)的抗性比較微弱，同時(shí)足夠植物抵抗細(xì)菌侵染。前人已經(jīng)報(bào)道聲波處理可通過“啟動效應(yīng)”提高植物水楊酸水平[10]。聲波的本質(zhì)是一種機(jī)械振動，最近的研究表明植物在聲波處理后生長增強(qiáng)，且植株在聲波處理后未發(fā)現(xiàn)任何細(xì)胞分裂素水平的變化[6]。此外細(xì)胞分裂素信號的負(fù)調(diào)節(jié)因子RAV1的表達(dá)量不變，也表明聲波介導(dǎo)的響應(yīng)可能與細(xì)胞分裂素?zé)o關(guān)[19]。這個發(fā)現(xiàn)為平衡植物抗性和植物生長提供了研究前景。

聲波可以誘導(dǎo)植物的光譜抗性。在前期研究中，擬南芥可以感知昆蟲食草時(shí)產(chǎn)生的聲波震動，激活化學(xué)防御[5];聲波處理后，擬南芥對灰霉的抗性也顯著增加[10-11]。本試驗(yàn)驗(yàn)證了聲波處理同樣可以誘導(dǎo)植物對細(xì)菌的抗性。以上數(shù)據(jù)表明，聲波增強(qiáng)植物的光譜抗性，包括昆蟲、疫霉和細(xì)菌。這凸顯出聲波處理在植物病害控制方面的潛力。

通過本研究，揭示了500 Hz的聲波處理可以促進(jìn)擬南芥對丁香假單胞菌的抗性，并且激活了擬南芥的基礎(chǔ)防衛(wèi)反應(yīng)。另外，也尋找到3個可能受聲波誘導(dǎo)的保守元件候選，為今后的研究打下基礎(chǔ)。值得注意的是，之前有研究報(bào)道，聲波處理也可以促進(jìn)擬南芥對死體病原菌的抗性[10]，這表明聲波引起的抗性可能是廣譜的。同時(shí)聲波引起的植物抗性反應(yīng)相對較弱，對植物生長造成的危害就會相對較小。利用聲波干預(yù)提高植物抗病性為實(shí)現(xiàn)綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)提供了一個新的思路。然而，植物響應(yīng)聲波的分子機(jī)制是什么？下游調(diào)控通路是如何實(shí)現(xiàn)的？這些問題仍待解決，因此本領(lǐng)域須要更進(jìn)一步的深入研究。

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收稿日期：2019-08-23

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號：2018YFD0201003）;國家自然科學(xué)基金（編號：31625023、31801715）;江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK20180518）。

作者簡介：艾 干（1993—），男，江蘇南京人，博士研究生，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：2016102010@njau.edu.cn。

通信作者：景茂峰，博士，副教授，主要從事植物與微生物互作研究。E-mail：jingmf@njau.edu.cn。