白芨工廠化育苗組培快繁技術(shù)體系的構(gòu)建

李志紅 徐靜雅 旦真次仁 段金華 侯典云

摘要：白芨的野生資源瀕臨匱乏，其種子自然萌發(fā)比較困難，因此傳統(tǒng)的白芨種植方法已不適于市場需求。以白芨種子為材料，探究白芨種子萌發(fā)、生根及組培苗移栽馴化的最佳方法。白芨種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂8 g/L+馬鈴薯10 g/L，增殖培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂9 g/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，最佳生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L+IAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂9 g/L+馬鈴薯25 g/L，馬鈴薯可促進白芨組培苗根的生長，組培苗馴化的最佳處理為預(yù)先將培養(yǎng)瓶開瓶進行適應(yīng)性鍛煉，2～3 d后把組培苗移至煉苗基質(zhì)中，這樣可提高白芨組培苗的成活率。白芨工廠化育苗體系的建立可有效地擴大白芨的種植規(guī)模，縮短育苗時間，從而更好地利用和保護白芨野生資源。

關(guān)鍵詞：白芨;組織培養(yǎng);快速繁殖;種子萌發(fā)率;組培苗;叢生芽;生根率;成活率

中圖分類號：S567.23+9.043 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0080-04

收稿日期：2019-08-30

基金項目：國家自然科學(xué)基金（編號：1404829）;西藏自治區(qū)重點科技計劃（編號：2015-ZD-NM-0）。

作者簡介：李志紅（1996—），女，河南新鄉(xiāng)人，碩士，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E-mail：1600356814@qq.com。

通信作者：侯典云，博士，副教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事藥用植物資源評價與利用研究。E-mail：dianyun518@163.com。白芨[Bletilla striata（Thunb.）Reichb.f.]為蘭科多年生草本植物，其干燥塊莖入藥，具有收斂止血、消腫生肌的功效，可用于治療吐血、外傷出血、皮膚皸裂等癥[1]，還具有很高的園林觀賞價值[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，白芨具有抗菌[3]、止血[4-5]、促進創(chuàng)傷愈合[6]、抗腫瘤[7-8]等作用。研究表明，白芨的主要化學(xué)成分是多糖、三萜及皂苷等[9-10]。白芨在我國分布較為廣泛，在云南、廣西、甘肅、貴州等地均有發(fā)現(xiàn)[11]。近年來市場對白芨的需求量不斷加大，導(dǎo)致野生白芨遭到過度的開采，野生資源急劇減少，現(xiàn)已是國家重點保護的野生藥用植物[12]。但白芨的常規(guī)種植卻受到很大的限制，每個白芨蒴果內(nèi)大約有幾萬顆種子，種子細(xì)小且無胚乳，自然條件下出苗率只有萬分之一[13]。目前主要是依靠人工栽培的方法來增加白芨的產(chǎn)量，但這種方法不僅周期長，且白芨苗易染病害，不能滿足大規(guī)模栽培的需要[14]。利用組織培養(yǎng)技術(shù)對白芨外植體進行離體培養(yǎng)，不僅可實現(xiàn)工廠化育苗選育白芨優(yōu)良品種，而且可保護白芨野生資源[15]。

1材料與方法

1.1材料處理

選取未開裂的白芨成熟蒴果，用75%乙醇棉球擦拭表面后，在超凈工作臺內(nèi)，用75%乙醇浸泡 30 s 后取出，用0.1%的氯化汞溶液浸泡6 min后，用無菌水沖洗5次，每次30 s，最后用無菌濾紙吸干蒴果表面水分。在無菌條件下將白芨種子均勻接在培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室內(nèi)進行約10 d的暗培養(yǎng)，當(dāng)種子出綠時，可轉(zhuǎn)為光培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為15～20 d。

選取表面完整無病毒、無發(fā)芽跡象的普通市售馬鈴薯，切塊煮熟后，用紗布過濾，棄濾渣后備用。

1.2種子萌發(fā)最適培養(yǎng)基篩選

取白芨無菌種子于表1中的各組MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每組培養(yǎng)基均添加30 g/L蔗糖，8 g/L瓊脂，培養(yǎng)基pH值調(diào)至5.8～6.0，篩選白芨種子萌發(fā)最佳培養(yǎng)基，查看培養(yǎng)7、30 d時種子情況，計算接種30 d時的萌發(fā)率。萌發(fā)率以培養(yǎng)基的底面積計算。

1.3增殖繼代培養(yǎng)

繼代培養(yǎng)的關(guān)鍵影響因素是植物激素之間的配比[16]，本研究所用增殖培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，并向其中添加3%蔗糖，0.9%瓊脂，1.0 mg/L激動素（KT），0.2 mg/L NAA，調(diào)節(jié)pH值為5.5～6.0。

在超凈工作臺內(nèi)，將無菌種子萌發(fā)所獲得的叢生芽小苗分株接種在增殖培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，約50 d后獲得3～5 cm的白芨叢生苗。

1.4叢生芽生根培養(yǎng)

將4 cm左右的叢生芽轉(zhuǎn)接到表2所示培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)，各培養(yǎng)基均添加蔗糖30 g/L，瓊脂9 g/L，pH值調(diào)至5.8～6.0。每組培養(yǎng)基接種300株，接種30 d后統(tǒng)計叢生苗生根的株數(shù)，計算生根率。

1.5白芨無菌苗馴化

制作煉苗基質(zhì)時需將中位泥炭土滅菌，然后將中位泥炭土、珍珠巖以及碎木屑按照體積比 5 ∶2 ∶3 的比例混合后，加入滅菌的蒸餾水拌勻，使其含水量為50%～55%，然后將所制作的煉苗基質(zhì)裝入育苗盤中， 放在遮陽率為50%的拱棚中備用，控制拱棚中的濕度為50%～55%，溫度為 15～25 ℃。

注：IAA為吲哚-3-乙酸。

挑選生長健壯、根系較發(fā)達(dá)的白芨組培苗，打開培養(yǎng)瓶瓶蓋，向瓶內(nèi)噴灑無菌水，每瓶噴灑約 6 mL，置于培養(yǎng)室內(nèi)2～3 d后，將組織培養(yǎng)瓶移出培養(yǎng)室再放置2～3 d。從培養(yǎng)瓶中取出白芨組培苗，并用蒸餾水清洗根部殘留的培養(yǎng)基后，置于 0.2 mg/L 的NAA中浸泡30 s，需注意通風(fēng)晾苗，以防根莖發(fā)霉[17]。將白芨苗種植于表3所示的煉苗基質(zhì)中，煉苗90 d后移栽至大田種植，并計算煉苗成活率。

2結(jié)果與分析

2.1不同培養(yǎng)基對白芨種子萌發(fā)的影響

不同培養(yǎng)基對白芨種子萌發(fā)的影響見圖1和圖2。當(dāng)MS培養(yǎng)基中無馬鈴薯和外源激素NAA時，接種30 d后的白芨種子萌發(fā)率僅有60%，低于添加馬鈴薯或NAA后的萌發(fā)率，而添加馬鈴薯的培養(yǎng)基內(nèi)的種子萌發(fā)率均遠(yuǎn)高于添加NAA的培養(yǎng)基。通過對比組1和組5、組2和組6可以看出，在加入馬鈴薯后如果再次添加NAA反倒不利于白芨種子的萌發(fā)。因此，本試驗所用的種子萌發(fā)培養(yǎng)基無需添加外源激素，即可有效促進白芨種子的萌發(fā)，且與添加激素的培養(yǎng)基相比，能夠取得更高的萌發(fā)率。

2.2叢生芽生長

白芨叢生芽繼代培養(yǎng)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，向其中添加外源激素KT和NAA以促進叢生芽的生長。白芨叢生芽的生長結(jié)果見圖3，可以看出，白芨叢生苗生長茂密， 葉翠綠且寬，長勢較好，表明

外源激素KT和NAA有利于提高白芨叢生苗的質(zhì)量，促進白芨生長與增殖。

2.3不同培養(yǎng)基對叢生芽生長及生根的影響

不同培養(yǎng)基對叢生芽生根的影響見圖4和圖5。由圖5可知，在生根培養(yǎng)基中添加馬鈴薯后，白芨叢生芽生根率高于未添加馬鈴薯的生根培養(yǎng)基，表明馬鈴薯對白芨生根有明顯的促進作用，可使白芨叢生芽生根率較高，根系較發(fā)達(dá)。因此本試驗中MS+NAA 0.2 mg/L+IAA 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂 9 g/L+馬鈴薯25 g/L為白芨叢生芽生根的最佳培養(yǎng)基。

2.4白芨組培苗煉苗、馴化

不同煉苗培養(yǎng)基對白芨組培苗成活率的影響

如圖6所示。采用表3中組1所述的煉苗基質(zhì)時，白芨組培苗成活率可達(dá)98%，遠(yuǎn)高于其他3組。組1的配比較其他3組更為合理，保證了煉苗過程中的水分和營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)以及透氣性，提高了白芨組培苗馴化的成活率。組1的組成成分易獲取，若將其運用在白芨的工廠化育苗中，可降低白芨的培育成本。

3討論

在白芨種子萌發(fā)試驗中，外源激素NAA和有機添加物馬鈴薯泥起到了明顯的促進作用，接種后 30 d，未加激素和有機添加物的MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的種子萌發(fā)率不高，而同時加入馬鈴薯和NAA培養(yǎng)基中的白芨種子萌發(fā)率反倒低于單獨添加馬鈴薯或NAA的培養(yǎng)基。因此，本試驗中最佳的白芨種子萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂 8 g/L+馬鈴薯10 g/L。筆者所在實驗室還發(fā)現(xiàn)，在5 ℃條件下儲存的種子萌發(fā)率比 -20 ℃ 條件下的高，說明5 ℃的溫度條件較溫和，可保護種子的生物活性，使得種子萌發(fā)率較高。

白芨組培苗移栽的成活率由生根條件決定。研究表明，外源激素NAA更適合誘導(dǎo)生根[18]。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在生根誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加有機物馬鈴薯，會促進白芨組培苗的生根。白芨組培苗在培養(yǎng)瓶內(nèi)的生長主要依靠培養(yǎng)基提供養(yǎng)分，因此煉苗過程前的開瓶、噴灑無菌水可增強白芨無菌苗對外界環(huán)境的適應(yīng)性[19]。研究發(fā)現(xiàn)，對外界環(huán)境的適應(yīng)性鍛煉促進了蘭科植物組培苗的生長及移栽成活率[20]。本試驗以中位泥炭土、珍珠巖和碎木屑作為白芨組培苗的移栽介質(zhì)。中位泥炭土是介于高位和低位之間的過渡性泥炭，透氣性好，保水，富含營養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)中位泥炭土、珍珠巖、碎木屑按體積比 5 ∶2 ∶3 混合時，不僅能增強培養(yǎng)基質(zhì)的排水能力，還能加大基質(zhì)間的孔隙，防止土壤硬結(jié)，有助于組培苗根系的呼吸和對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，進而促進組培苗的生長[21]。

白芨喜溫暖、陰涼和較濕潤的環(huán)境，不耐寒，怕積水。因此大田種植期間，切忌向育苗床頻繁灑水，水分過多會導(dǎo)致地下塊莖的腐爛。由于組培苗移栽初期新根系尚不發(fā)達(dá)，且土壤疏松透氣，排水良好，因此移栽初期的養(yǎng)分供應(yīng)以葉面噴施為主?？蛇x擇噴施對白芨產(chǎn)量影響最大的氮肥[22]。

本試驗以白芨種子為材料，通過誘導(dǎo)種子萌發(fā)、增殖和生根，成功建立了白芨工廠化育苗快繁體系，并獲得了大量可用于大田種植的組培苗，為種植戶提供了優(yōu)良種苗及技術(shù)支持。最佳誘導(dǎo)種子萌發(fā)的培養(yǎng)基配比為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂 8 g/L+馬鈴薯10 g/L，接種30 d內(nèi)種子萌發(fā)率可達(dá)100%;增值繼代培養(yǎng)基為MS+蔗糖30 g/L+瓊脂9 g/L+KT 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L;生根培養(yǎng)基為MS+NAA 0.2 mg/L+IAA 1.0 mg/L+蔗糖 30 g/L+瓊脂9 g/L+馬鈴薯25 g/L，生根率可達(dá)99%。向培養(yǎng)基內(nèi)添加馬鈴薯等有機添加物可促進白芨種子的萌發(fā)與根的生長。

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