高壓靜電場脅迫對甘草生長過程中RNA的影響

李倩 郭九峰 高海榮

摘要：為探究高壓靜電場對甘草生長過程中RNA含量的影響，本試驗以甘草幼葉、嫩莖和種子為研究材料，依次采用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法、異硫氰酸胍（Trizol）法提取甘草幼葉、嫩莖、種子的RNA，并進行比較分析。并通過紫外分光光度法，分析檢測經不同強度高壓靜電場（0、12、15、18 kV）處理之后生長過程中甘草不同組織RNA含量。結果表明，3種方法均能從甘草中提取出RNA。SDS法是適用于甘草組織RNA提取的最佳方法。經不同強度高壓靜電場處理，甘草RNA含量增加，降解含量降低。高壓靜電場影響最明顯的是處理電場強度為18 kV時，甘草生長9 d時，RNA含量最高。本研究初步探究了高壓靜電場對甘草生長過程中RNA含量的影響，為甘草RNA的研究和高壓靜電場與分子生物學的研究提供了基礎參考。

關鍵詞：甘草;高壓靜電場;RNA提取;SDS法;RNA含量

中圖分類號：S567.7+10.1 文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2020）13-0076-04

收稿日期：2019-08-10

基金項目：國家自然科學基金（編號：51467014）。

作者簡介：李倩（1993—），女，河北張家口人，碩士，主要從事環(huán)境生物物理和分子技術研究。E-mail：934192500@qq.com。

通信作者：郭九峰，博士，教授，碩士生導師，主要從事生物物理與生物技術研究。E-mail：guojf101@sina.com。甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）作為我國傳統(tǒng)的大宗中藥材，本身也是一種可綜合利用的經濟型植物。但迄今為止，有關甘草不同組織總RNA的提取報道甚少。這主要是由于甘草葉片、莖干中蛋白質、脂肪、多糖等含量均很高，刺毛狀腺體中還含有大量黏液質[1]。根和根莖中有甘草酸等豐富的次生代謝產物，致使提取甘草的RNA比一般的植物要困難，通過這些方法提取的RNA多適用于后期的逆轉錄PCR（PT-PCR）等試驗，很少用于轉錄組測序[1-3]。針對這類植物，相關學者通過調整試驗方式，結合不同方法以及加入不同的物質來提高植物RNA的提取率，例如陳華等使用改良Trizol法結合LiCl法提取了番茄葉片的RNA[4]。

高壓靜電技術是近幾十年興起的一種重要的處理種子的方法[5]。利用其能夠擊穿組織細胞壁和細胞膜的特征，從而提高種子的活化能，調節(jié)內部水分子、腺嘌呤核苷三磷酸（ATP）含量、酶活性等，優(yōu)化原有性質，增強種子的生理生化反應[6-7]，提高種子活力，與此同時降低植物的發(fā)病率并提高其抗逆能力[8]。本試驗以甘草幼葉、嫩莖、種子為材料，選用十二烷基苯磺酸鈉（SDS）法、Trizol法、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取總RNA，期望找到一種提取甘草RNA的最佳方法，并能達到轉錄測序要求，并探究高壓靜電場對甘草RNA含量的影響，以便為后續(xù)相關分子水平研究提供科學參考。

1材料與方法

1.1材料及處理采集

1.1.1試劑材料甘草種子，選用人工栽培的烏拉爾甘草，購自內蒙古赤峰生態(tài)甘草種植基地;甘草完整苗株取自筆者所在課題組實驗室組織培養(yǎng)的甘草苗。供試試劑：Trizol[天根生化科技（北京）有限公司]，CTAB、焦碳酸二乙酯（DEPC）、SDS、酚-三氯甲烷、異戊醇、異丙醇、乙醇、無RNA酶水（內蒙古鴻之惠商貿有限公司）。

1.1.2材料處理挑選飽滿的甘草種子，于98%濃硫酸溶液中處理10 min，用無菌水洗滌3～4次，洗凈種子表面殘留酸液，晾干。將經濃硫酸處理過的種子分成若干份，進行高壓靜電場處理。高壓靜電場電壓的選取是在筆者所在課題組研究基礎上進行篩選的，電壓依次為0（CK）、12、15、18 kV，處理時間為 25 min（CK處理為0 min）。高壓靜電場處理完之后，置于10%次氯酸鈉溶液中15 min，用無菌水洗滌數次，晾干備用。播種于MS培養(yǎng)基中

表明提取的總RNA完整性好。CTAB法得到的凝膠電泳圖譜中，幼葉的整體效果不錯，但嫩莖的條帶有些許彌散，可能是DNA污染造成的;種子的條帶完整但亮度偏暗，可能是沉降過程不完全所致，或有其他物質輕微干擾所致。Trizol法提取甘草幼葉、嫩莖和種子總RNA過程中，出現溶液褐化現象，幼葉的最終提取產物中稍有影響，但整體影響不大。而嫩莖和種子中RNA存在量微乎其微，整體完整性略低，質量差。因此，通過3種方法分析比較，SDS法是提取甘草RNA的最佳方法。

2.2SDS法提取不同高壓靜電場處理甘草苗的RNA檢測

采用SDS法提取經由不同高壓靜電場處理的甘草苗的RNA，電泳結果見圖4，條帶清晰、明亮。18 kV和CK條件下（泳道3和泳道4）條帶孔位有些明亮，考慮可能有沉淀未洗脫完全。經電場處理的泳道條帶比CK清晰明亮，說明經高壓靜電場處理對甘草RNA的提取起到了一定的促進作用。

2.3SDS法的PCR驗證

采用SDS法得到的不同高壓靜電場處理的甘幼葉、嫩莖和種子RNA進行逆轉錄反應，以RT-PCR得到的第一鏈CDNA作為模板，以甘草Actin基因設計引物對，進行PCR擴增，結果見圖5。不同高壓靜電場處理的甘草的幼葉、嫩莖和種子都出現了目的條帶，擴增效果理想，條帶清晰明顯，沒有一點拖帶，進一步說明SDS法是甘草RNA提取的最佳方法，同時高壓靜電場的加入也優(yōu)化了高質量RNA的獲得。

2.4RNA含量與電場強度的關系

使用SDS法提取甘草種子經電場處理和對照組分別生長1、3、5、7、9、11 d的RNA，檢測不同高壓靜電場對甘草RNA的影響（圖6）。

不同高壓靜電場處理在不同生長時間里，RNA含量呈現不同的變化趨勢。隨著生長時間的延長，經高壓靜電場處理的RNA含量出現不同程度的波動變化，在15、18 kV條件下整體波動上升，12 kV條件下，在一定范圍之內波動下降，而CK組出現大范圍波動下降。隨著電場強度增加，RNA的含量也出現波動變化，綜合觀察來看，當處理所用高壓靜電場強度為18 kV時，甘草生長到9 d時，RNA含量最大，并且此時RNA降解量最少。因此，確定 18 kV 為最佳電場強度。

3討論與結論

純度高、完整性好的RNA是進行RT-PCR、熒光定量Real-time PCR、轉錄組測序、基因表達分析等的基礎[22-23]。甘草是一種經濟型綜合利用的植物，由于其本身有大量蛋白質、多糖，莖葉的刺毛狀腺體中還含有大量黏液質，根和根莖中又有豐富的

次生代謝產物，提取甘草RNA面臨一定的困難。Trizol法是一種簡單快速提取RNA的方法，試驗中溶液褐化現象，可能與試劑中含有氧化性物質有關，在去除雜質的同時也會造成RNA的損失，所以Trizol法不適合甘草這類植物RNA的提取。CTAB法能夠摒棄試驗過程中的部分氧化還原情況，但是其操作復雜，操作過程溫度區(qū)間涉及廣，容易造成降解。因此，并不是提取甘草RNA的最佳方法。SDS法既能克服Trizol法的一些弊端，又比CTAB法操作簡單，且成本不高，能夠獲得高質量的RNA。因此，SDS法是甘草不同組織RNA提取的最佳選擇。高壓靜電場是近幾十年來興起的且用途廣泛的一門技術[5]，本試驗通過加入高壓靜電場的處理，結果表明，甘草組織中RNA的獲得率確有提高，說明高壓靜電場處理促進了RNA的提取。目前為止，有關電場對植物的處理效應詳盡的機制尚未有明確的定論，可能的分析方向類型有細胞膜電穿孔模型、電崩解模型、影響酶的活性[24-27]、影響遺傳物質[28-29]等。本研究結果表明，高壓靜電場處理甘草之后，組織中RNA發(fā)生了明顯的變化，這也驗證了高壓靜電場影響遺傳物質的說法。

本試驗研究了不同RNA提取方法對甘草的適用性，并以此為基礎探究高壓靜電場處理對甘草生長過程中RNA含量的影響。存在于自然界的所有生物體都擁有特異的生理特性和電磁效應，試驗證明，高壓靜電場處理對甘草RNA的提取有促進作用，這可能也為高質量RNA的獲得提供一種可能。想要全面、深層次地探究高壓靜電場對甘草RNA的影響機制，未來學者可以以此為切入點從不同層次進行探究。

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