基于GBS測(cè)序開發(fā)SNP在植物上的應(yīng)用進(jìn)展

薛曉杰 杜曉云 蓋藝 唐巖 孫燕霞 宋來慶 姜中武

摘要：基因分型測(cè)序（genotyping by sequencing，GBS）因具有實(shí)現(xiàn)相對(duì)簡單、成本較低、可產(chǎn)生高通量SNP的優(yōu)點(diǎn)而受到青睞。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）因簡單、快速、特異性強(qiáng)、穩(wěn)定遺傳、便于檢測(cè)等特點(diǎn)已成為目前最廣泛使用的分子標(biāo)記之一。本文就利用GBS技術(shù)開發(fā)SNP分子標(biāo)記近年來在親緣關(guān)系評(píng)價(jià)、重要農(nóng)藝性狀鑒定、遺傳多樣性研究、遺傳圖譜構(gòu)建以及基因定位等方面在國內(nèi)外的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)其今后的研究提出展望，以期為其在植物上的更廣泛應(yīng)用提供參考。

關(guān)鍵詞：SNP分子標(biāo)記;GBS技術(shù);簡化基因組測(cè)序;遺傳圖譜構(gòu)建;QTL定位;基因定位

中圖分類號(hào)：S184 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2020）13-0062-07

收稿日期：2020-040-02

基金項(xiàng)目：山東省外專雙百計(jì)劃（編號(hào)：WST2018013）;山東省重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（編號(hào)：2018GHZ005）。

作者簡介：薛曉杰（1994—），女，山東煙臺(tái)人，碩士研究生，主要從事果樹分子與生理技術(shù)研究，E-mail：xuexiaojieYT@163.com;共同第一作者：杜曉云（1979—），女，山西呂梁人，博士，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事果樹生物技術(shù)育種研究，E-mail：duxiaoyunduzi@163.com。

通信作者：姜中武，博士，研究員，主要從事果樹育種與栽培技術(shù)研究。E-mail：jiangzhongwu@163.com。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展迅速，基因組測(cè)序技術(shù)日漸成為標(biāo)記開發(fā)的重要手段。簡化基因組測(cè)序（GBS）技術(shù)近年發(fā)展起來。GBS技術(shù)可以捕獲基因組重要區(qū)域，獲得大量單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP），且無需已知基因組信息[1]。目前，SNP分子標(biāo)記在果樹、蔬菜和花卉等植物上已被成功應(yīng)用于遺傳圖譜構(gòu)建、數(shù)量性狀基因座（quantitative trait locus，QTL）、全基因組關(guān)聯(lián)分析、基因定位等方面的研究，GBS被認(rèn)為是分子標(biāo)記輔助選擇的最高級(jí)應(yīng)用。但基于GBS技術(shù)開發(fā)SNP分子標(biāo)記的研究在植物上尚無詳細(xì)報(bào)道。本文簡要介紹GBS技術(shù)發(fā)展情況，著重概述其近年來在植物上的應(yīng)用現(xiàn)狀和前景，以期為該方法的進(jìn)一步廣泛應(yīng)用提供參考。

1SNP分子標(biāo)記

在分子育種發(fā)展過程中，若干分子標(biāo)記類型得到開發(fā)。基于雜交的第一代分子標(biāo)記限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）是首次應(yīng)用于植物基因分型的DNA標(biāo)記?；赑CR的第二代分子標(biāo)記主要包括隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（randomly amplified polymorphic DNA，RAPD）、序列特征性擴(kuò)增區(qū)域（sequence characterined amplified regions，SCAR）、切割的擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性序列（cleaved amplified polymorphic sequence，CAPS）、簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，SSR）和擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism，AFLP）等，它們均存在不同程度的缺點(diǎn)?；诮觑w速發(fā)展的高通量測(cè)序技術(shù)，第三代分子標(biāo)記應(yīng)運(yùn)而生，其中，SNP在基因組中最為豐富，被證明更能高效、全面地揭示基因組變異信息。SNP分子標(biāo)記由Lander提出，指某個(gè)堿基對(duì)出現(xiàn)替換、缺失或插入而引起的堿基序列改變，最終導(dǎo)致DNA序列多樣性[2]。該標(biāo)記被首次應(yīng)用于人類基因組計(jì)劃，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，人類DNA序列中每1.3 bp即可產(chǎn)生1個(gè)SNP[3]，證明SNP分子標(biāo)記在基因組中分布密度較高。SNP根據(jù)位置分布可分為基因編碼區(qū)SNP（cSNP）、基因SNP（iSNP）和基因周邊SNP（pSNP），通常非編碼區(qū)變異率高于編碼區(qū)[4]。SNP具有突變頻率較低、等位基因較少、遺傳穩(wěn)定性較高和較其他標(biāo)記分布范圍更廣等特點(diǎn)，為目前使用較為廣泛的分子標(biāo)記之一。SNP的開發(fā)依賴于第二代測(cè)序技術(shù)（next generation sequencing，NGS）。隨著測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，諸多植物基因組序列得到公布，擴(kuò)大了SNP分子標(biāo)記的檢測(cè)范圍。第二代測(cè)序技術(shù)通常使用高通量測(cè)序平臺(tái)，具有檢測(cè)速度快、精確度高和高通量等特點(diǎn)，又稱為高通量測(cè)序技術(shù)。其中，簡化基因組測(cè)序（GBS）技術(shù)逐漸成為國內(nèi)外研究熱點(diǎn)，最近在植物上的應(yīng)用迅速發(fā)展。

2GBS技術(shù)

GBS是利用二代測(cè)序技術(shù)在作物中發(fā)現(xiàn)和分型SNP的一種新應(yīng)用[5]，其原理是使用限制性內(nèi)切酶（RE）對(duì)DNA進(jìn)行酶切，并對(duì)酶切片段兩端序列進(jìn)行高通量測(cè)序，通過分析獲得的SNP信息進(jìn)行基因分型，是一種快速、簡單、低成本的基因分型方法。該技術(shù)的關(guān)鍵是GBS文庫構(gòu)建與生物信息分析，核心是使用ApiKI限制性內(nèi)切酶來減少基因組的重復(fù)序列。2011年，Elshire等首次在玉米和大麥上進(jìn)行GBS試驗(yàn)，分別挖掘出約200 000個(gè)和 25 000 個(gè)序列標(biāo)記，建立降低基因組復(fù)雜性的文庫，分析表明，該文庫適合大規(guī)模樣品進(jìn)行標(biāo)記篩選[6]。同為基于酶切的簡化基因組測(cè)序技術(shù)，與限制性位點(diǎn)關(guān)聯(lián)DNA測(cè)序技術(shù)RAD（restriction-site associated DNA sequencing）相比[7]，GBS技術(shù)步驟更簡單，DNA純化步驟少，無需進(jìn)行片段大小選擇，可檢測(cè)到RAD技術(shù)無法處理的大量缺失基因型，尤其在分析多態(tài)性低和重復(fù)序列高的物種上更占優(yōu)勢(shì)，成本相對(duì)低廉。GBS技術(shù)在國內(nèi)逐漸發(fā)展起來，目前已在部分植物上實(shí)現(xiàn)高效、大規(guī)模的基因組測(cè)序。

2.1GBS技術(shù)主要流程

GBS技術(shù)的重點(diǎn)是GBS文庫構(gòu)建。進(jìn)行GBS文庫構(gòu)建或?qū)蚪MDNA酶切的關(guān)鍵是選擇甲基化敏感的RE和合適接頭。RE可影響DNA片段大小和數(shù)量[8]。選擇含有多個(gè)懸垂核苷酸的RE可有效提高接頭與DNA的連接效率，并能優(yōu)先從低拷貝基因區(qū)域生成片段[6]。選取酶切后的片段，用T4 DNA連接酶連接其兩端的接頭和條形碼（barcode）。酶切與連接通常不同時(shí)進(jìn)行，除非選用特殊耐熱連接酶。連接結(jié)束后，以回收產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增可使酶切片段兩端產(chǎn)生帶有不同接頭的核苷酸片段，混合樣品，再次回收DNA片段并純化。至此，GBS文庫準(zhǔn)備就緒，將混和好的文庫使用Illumina高通量平臺(tái)測(cè)序;通常該平臺(tái)的測(cè)序錯(cuò)誤率隨測(cè)序序列長度的增加而升高，堿基質(zhì)量同時(shí)受到影響，另外堿基質(zhì)量還可能受測(cè)序試劑和樣品等多方面影響，因此，提高測(cè)序堿基質(zhì)量是一個(gè)有待解決的問題。為保證分析質(zhì)量，根據(jù)建庫樣品與 barcode 對(duì)應(yīng)關(guān)系，將原始測(cè)序數(shù)據(jù)Raw Reads 拆分為單樣品 Raw Reads，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)控得到過濾后的數(shù)據(jù)Clean Reads，根據(jù)有無參考基因組分別將 Clean Reads 與參考基因組和構(gòu)建的參考基因組進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而進(jìn)行 SNP基因型分析?？赏ㄟ^進(jìn)化樹構(gòu)建、主成分分析、群體遺傳結(jié)構(gòu)分析等進(jìn)行SNP信息分析。

2.2GBS生物信息學(xué)發(fā)展

GBS發(fā)展需要生物信息學(xué)工具助力海量數(shù)據(jù)處理。近年來生物信息學(xué)分析流程迅速發(fā)展，其中幾條主要信息流程使用率較高。Sonah等開發(fā)了IGST-GBS分析流程，從所產(chǎn)生的序列中讀取調(diào)用SNP和DENEL，并在8種不同大豆基因型上進(jìn)行了驗(yàn)證[9]。Glaubitz等創(chuàng)建了TASSEL-GBS數(shù)據(jù)分析流程，可將原始GBS序列數(shù)據(jù)高效地處理成SNP基因型[10]，利用該信息學(xué)工具所讀取的堿基在后人的使用中被認(rèn)為幾乎無錯(cuò)誤[1]。Melo等開發(fā)了GBS-SNP-CROP，對(duì)可變長度成對(duì)末端基因分型的SNP和植物種質(zhì)鑒定，尤其適用于目標(biāo)種群多樣化程度過高情況[11]。Torkamaneh等綜合比較了7條GBS生物信息學(xué)流程，包括5條需要參考基因組的流程（TASSEL-GBS v1&v2、Stacks、IGST和 Fast-GBS）和2條無需參考基因組的從頭分析流程（UNEAK和Stacks），分析表明，F(xiàn)ast-GBS分析過程中產(chǎn)生的多態(tài)性SNP最多，準(zhǔn)確性最高[12]。綜合結(jié)果表明，運(yùn)用不同流程分析相同測(cè)序技術(shù)產(chǎn)生的SNP會(huì)使得SNP高度重疊，然而使用相同流程分析不同測(cè)序技術(shù)獲得的SNP，重疊相對(duì)較少。筆者認(rèn)為，選擇適宜的生物信息學(xué)分析流程對(duì)于GBS分析結(jié)果具有較大意義，因此分析流程工具的開發(fā)與選擇對(duì)于預(yù)期研究至關(guān)重要。

3基于GBS開發(fā)SNP應(yīng)用進(jìn)展

GBS自開發(fā)一來，受到國內(nèi)外研究者的青睞，目前在植物遺傳多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建、QTL鑒定、基因定位上有較好應(yīng)用。

3.1親緣關(guān)系和遺傳多樣性

研究品種起源和親緣關(guān)系對(duì)地區(qū)種質(zhì)資源的保護(hù)和利用具有重要參考價(jià)值，了解作物的群體結(jié)構(gòu)和遺傳多樣性對(duì)基因關(guān)聯(lián)定位研究和基因組選擇至關(guān)重要[13]。利用GBS技術(shù)產(chǎn)生的SNP可有效地對(duì)種質(zhì)資源親緣關(guān)系和遺傳多樣性進(jìn)行研究，對(duì)此已有前人作過不少研究。

3.1.1親緣關(guān)系中的應(yīng)用王曉柯等利用GBS技術(shù)對(duì)240份寬皮柑橘進(jìn)行基因分型，共獲得了 114 200 個(gè)高質(zhì)量的SNP位點(diǎn)，主成分分析結(jié)果顯示，240份寬皮柑橘被分為4大類，系統(tǒng)演化樹和主成分分析結(jié)果都揭示了不同地理來源和特定形態(tài)的寬皮柑橘在遺傳水平上存在明顯的差異[14]。Zhao等利用GBS技術(shù)、系統(tǒng)基因組學(xué)、群體遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和全葉綠體基因組學(xué)，推斷了核桃屬5種中國本地物種譜系形成的過程，驗(yàn)證了核桃與水曲柳是一個(gè)園藝品種，發(fā)現(xiàn)冰川進(jìn)退是與種群隔離有關(guān)的氣候變化事件，即使在基因流動(dòng)和導(dǎo)入的情況下也是如此[15]。Wu等利用GBS技術(shù)對(duì)82個(gè)大葉繡球花品種的遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，對(duì)大葉繡球栽培盤上發(fā)現(xiàn)的5 803個(gè)優(yōu)質(zhì)SNPs進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析和分子變異分析，得出了大葉繡球的分類方法，證實(shí)“Preziosa”是大葉黃連的雜種[16]。Niu等利用GBS技術(shù)對(duì)貴州高原起源中心的415份茶樹樣本進(jìn)行了首次群體遺傳分析，揭示了茶樹群體的連鎖不平衡模式、群體結(jié)構(gòu)和遺傳分化，共鑒定出79 016個(gè)優(yōu)質(zhì)SNP位點(diǎn)，確定了純野生型、混合野生型、古代型和現(xiàn)代型4個(gè)類群，并發(fā)現(xiàn)古代型和混合野生型的遺傳多樣性水平高于純野生型和現(xiàn)代型[17]。

3.1.2遺傳多樣性中的應(yīng)用Taranto等使用GBS技術(shù)對(duì)辣椒資源進(jìn)行SNP全基因組鑒定，并評(píng)估222個(gè)栽培辣椒基因型子集遺傳多樣性水平，貝葉斯和層次聚類分析結(jié)果表明，基因型在集群中的分布反映了物種的地理起源和果實(shí)相關(guān)特征[13]。Pavan等將GBS技術(shù)首次應(yīng)用于甜瓜，通過對(duì)收集的72份材料的分析，檢測(cè)到25 422個(gè)SNPs，通過遺傳結(jié)構(gòu)、主成分和層次聚類分析進(jìn)行3個(gè)不同亞群的識(shí)別，每個(gè)亞群的遺傳分析結(jié)果揭示了與果實(shí)表型和地理起源相關(guān)的多樣性模式[18]。Solomon等通過GBS技術(shù)對(duì)辣椒進(jìn)行基因分型，第一次全面地分析了埃塞俄比亞辣椒物種的遺傳變異，對(duì)142個(gè)辣椒種質(zhì)資源中53 284個(gè)高質(zhì)量SNP進(jìn)行了模型的世系分析和系統(tǒng)發(fā)育樹、主成分分析，確定了2個(gè)不同的遺傳群體[19]。周萍萍等利用GBS技術(shù)對(duì)27 份來自中國的大粒裸燕麥材料進(jìn)行測(cè)序，結(jié)合先前發(fā)表的包括6個(gè)六倍體燕麥種在內(nèi)的66份燕麥材料的GBS數(shù)據(jù)進(jìn)行SNP挖掘，并對(duì)其進(jìn)行主成分分析、結(jié)構(gòu)分析以及聚類分析，為栽培六倍體燕麥起源研究提供了理論依據(jù)[20]。

以上研究結(jié)果表明，利用GBS技術(shù)獲得的SNP群體結(jié)構(gòu)信息可為遺傳圖譜研究、標(biāo)記輔助選擇和物種起源研究提供基礎(chǔ)，證明GBS技術(shù)在基因分型中被高效運(yùn)用，可準(zhǔn)確地進(jìn)行親緣關(guān)系和遺傳多樣性研究，挖掘大量基因組潛在信息，是一個(gè)高效可靠的工具。

3.2遺傳圖譜和重要農(nóng)藝性狀

遺傳圖譜也稱連鎖圖譜，是以有多態(tài)性的遺傳標(biāo)記為路標(biāo)，以2個(gè)位點(diǎn)交換率為圖距的圖譜，其理論依據(jù)為染色體的交換和重組，是分子標(biāo)記開發(fā)、基因鑒定等基因組信息挖掘的基礎(chǔ)。GBS是一種穩(wěn)定且經(jīng)濟(jì)的方法，可以生成通用的全基因組SNP數(shù)據(jù)，適用于在高度雜合的農(nóng)業(yè)物種中對(duì)多個(gè)群體構(gòu)建整合連鎖圖譜[21]。

數(shù)量性狀由染色體中的多個(gè)基因控制，QTL的研究可以直接將目標(biāo)性狀定位到相關(guān)基因。GBS技術(shù)的發(fā)展，成功使基于重組的基因分型來開發(fā)物種的QTL圖譜成為可能。近年來，植物上基于GBS技術(shù)開發(fā)SNP的應(yīng)用主要集中在圖譜構(gòu)建和QTL定位方面。

3.2.1在遺傳圖譜構(gòu)建中的應(yīng)用Lee等利用GBS技術(shù)構(gòu)建甘藍(lán)型油菜的高分辨率遺傳圖譜，并對(duì)抗性基因進(jìn)行鑒定，分別獲得甘藍(lán)型油菜2號(hào)和9號(hào)的2個(gè)主效QTL和1個(gè)主效QTL[22]。Ipek等使用GBS對(duì)125份橄欖DNA樣本進(jìn)行分析，共鑒定出22 033個(gè)基于轉(zhuǎn)錄組的SNP標(biāo)記，其中3 384個(gè)標(biāo)記被映射到橄欖基因組中，構(gòu)建包含1個(gè)CAPS、19個(gè)SSR和3 384個(gè)基于轉(zhuǎn)錄組的SNP標(biāo)記的飽和遺傳圖譜[23]。Jo等首次采用GBS技術(shù)對(duì)洋蔥（無參考基因組）進(jìn)行SNP挖掘，獲得1 851 428個(gè)SNP，構(gòu)建洋蔥SNP遺傳圖譜[24]。Li等通過GBS技術(shù)構(gòu)建了基于SNP的包含1 465個(gè)bin標(biāo)記的甘藍(lán)高密度遺傳連鎖群，其基因組長度為128 577 cM，相鄰bin標(biāo)記間的平均遺傳距離為0.88 cM[25]。Carrasco等利用通過GBS技術(shù)獲得的SNP構(gòu)建日本李高密度連鎖圖譜，指明日本李子和桃子基因組具有高度的共線性[26]。遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建，將為物種重要農(nóng)藝性狀的QTL定位、基因定位和候選基因挖掘提供有用的工具。

3.2.2重要農(nóng)藝性狀中的應(yīng)用Pootakham等利用GBS技術(shù)在油棕全基因組范圍內(nèi)構(gòu)建的遺傳圖譜上檢測(cè)到1個(gè)與果莖相關(guān)的QTL、3個(gè)控制植株生長的QTL和2個(gè)相關(guān)候選基因[21]。賴國榮等利用通過GBS技術(shù)獲得的SNP構(gòu)建玉米高密度遺傳連鎖圖譜，并結(jié)合重組自交系群體籽粒脂肪含量、賴氨酸含量、蛋白質(zhì)含量和淀粉含量共4個(gè)營養(yǎng)品質(zhì)性狀的表型數(shù)據(jù)進(jìn)行QTL定位，共檢測(cè)到20個(gè)與營養(yǎng)品質(zhì)性狀相關(guān)的QTL[27]。Diouf等利用GBS技術(shù)從233個(gè)陸地棉群體中開發(fā)出由5 178個(gè)SNP標(biāo)記組成的第1個(gè)高密度遺傳圖譜，鑒定出了與鹽度相關(guān)性狀的QTL，確定了8個(gè)集群，發(fā)現(xiàn)了12個(gè)可用于QTL精細(xì)檢測(cè)的可能關(guān)鍵基因[28]。Bhattarai等通過基于GBS的飽和SNP連鎖圖譜對(duì)水稻進(jìn)行基因分型，確定了控制水稻根莖長、鮮根質(zhì)量、分蘗數(shù)和根冠比等的14個(gè)QTL，并在QTL置信區(qū)間內(nèi)發(fā)現(xiàn)了影響短根的重要基因，被認(rèn)為通過控制細(xì)胞增殖和伸長來調(diào)節(jié)根的生長[29]。Zhang等以牡丹品種鳳丹和日月錦的雜交后代為母本，利用GBS技術(shù)檢測(cè)到257 335 738個(gè)優(yōu)質(zhì)SNP標(biāo)記，根據(jù)分布在5個(gè)連鎖群上共包含3 868個(gè)標(biāo)記的完整遺傳圖譜分別測(cè)定了控制花數(shù)、花瓣長度、花瓣數(shù)和花期4個(gè)表型性狀的共6個(gè)QTL[30]。

諸多研究結(jié)果表明，基于GBS技術(shù)開發(fā)SNP在不同植物中構(gòu)建遺傳圖譜并進(jìn)行QTL定位均取得較好的效果，證明GBS是一個(gè)值得推薦的簡化基因組重測(cè)序技術(shù)。高分辨率的遺傳圖譜構(gòu)建和精確的QTL檢測(cè)可以顯著縮小植物重要性狀的候選基因范圍[31]。

3.3基因定位

基因定位即測(cè)定基因在染色體上的位置，是遺傳機(jī)理研究的重要環(huán)節(jié)，對(duì)于深入了解植物遺傳信息具有重要作用。GBS技術(shù)可以深入到基因組重要區(qū)域，獲取的基因信息較為準(zhǔn)確。Passianotto等使用GBS技術(shù)對(duì)大豆188個(gè)植物引種和5個(gè)品種進(jìn)行基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)3個(gè)與線蟲抗性顯著相關(guān)的基因區(qū)域[32]。郭燕等利用GBS技術(shù)對(duì)100份古茶樹資源進(jìn)行全基因組SNP挖掘，共鑒定出近55萬個(gè)高質(zhì)量SNPs，為后續(xù)開展分子標(biāo)記輔助育種和功能基因位點(diǎn)定位提供了基礎(chǔ)[33]。Gerardo等構(gòu)建了由486個(gè)SNPs、11個(gè)SSR以及2個(gè)形態(tài)標(biāo)記組成的桃遺傳連鎖圖譜，對(duì)可溶性固形物含量、成熟期和果肉粉質(zhì)3個(gè)性狀進(jìn)行QTL鑒定并確定了與其相關(guān)的候選基因[34]。高美玲等通過GBS技術(shù)分別對(duì)西瓜果形指數(shù)大于1.4和小于1.1的各10株個(gè)體進(jìn)行基因分型，在3號(hào)染色體的 26.80～27.33 Mb 區(qū)段內(nèi)定位到與西瓜果形有關(guān)的基因，并預(yù)測(cè)了14個(gè)候選基因[35]。楊柳等基于GBS技術(shù)獲得棗品種SNP標(biāo)記后，對(duì)其進(jìn)行主成分和遺傳多樣性分析，并解析棗品種的群體遺傳關(guān)系，通過基因功能注釋和富集分析確定了 6 個(gè)參與細(xì)胞周期或激素合成調(diào)控途徑的候選基因[36]。

通過研究發(fā)現(xiàn)，GBS技術(shù)可應(yīng)用于不同物種SNP標(biāo)記的獲取（表1），在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建、重要農(nóng)藝性狀定位以及相關(guān)基因定位等中均具有重要意義，這將有助于植物輔助育種和育種保護(hù)，也為后續(xù)的遺傳機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。

4總結(jié)與展望

綜上所述，近年來國內(nèi)外基于GBS技術(shù)發(fā)現(xiàn)的SNP在植物基因組中分布密集，證實(shí)了無需生物基因組信息的GBS技術(shù)是一個(gè)開發(fā)SNP強(qiáng)有力的工具。未來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)、SNP分子標(biāo)記技術(shù)和生物信息學(xué)技術(shù)的開發(fā)和進(jìn)步，GBS-SNP有望開啟新一代分子標(biāo)記與測(cè)序技術(shù)的重要里程。

目前，GBS-SNP在作物上應(yīng)用較廣，在小麥、棉花、水稻等作物上的應(yīng)用研究已趨于先進(jìn)，而在果樹、蔬菜和花卉上的應(yīng)用研究相對(duì)較少且不夠完善。利用GBS技術(shù)開發(fā)SNP在果樹方面的研究仍需不斷探索，例如果樹童期長、病害種類較多，GBS可作為一個(gè)方便高效選育優(yōu)良性狀的輔助育種工具;芽變選種中存在同名異物、同物異名的現(xiàn)象，GBS又可作為一個(gè)鑒定果樹親緣關(guān)系和遺傳多樣性的有效手段。從國內(nèi)外研究對(duì)比來看，GBS技術(shù)在國外的使用較為廣泛，國內(nèi)近3年以來發(fā)展迅速，但總體與國外在研究效率和范圍上有一定差距。因此，在今后GBS技術(shù)應(yīng)用中，選用合適的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行GBS文庫構(gòu)建、高效的生物信息學(xué)流程進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及減少測(cè)序堿基錯(cuò)誤率將變得更為重要。后續(xù)研究中，結(jié)合代謝組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)與蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行完善的遺傳機(jī)理研究，對(duì)于我國植物育種保護(hù)具有重大意義。

參考文獻(xiàn)：

[1]Kim C，Guo H，Kong W Q，et al. Application of genotyping by sequencing technology to a variety of crop breeding programs[J]. Plant Science，2016，242：14-22.

[2]Lander E S.The new genomics： global views of biology[J]. Science，1996，274（5287）：536-539.

[3]Brookes A J.The essence of SNPs[J]. Gene，1999，234（2）：177-186.

[4]Wang D G，F(xiàn)an J B，Siao C J，et al.Large-scale identification，mapping and genotyping of single-nucleotide polymorphisms in the human genome[J]. Science，1998，280（5366）：1077-1082.

[5]He J F，Zhao X，Laroche A，et al.Genotyping-by-sequencing（GBS），an ultimate marker-assisted selection （MAS） tool to accelerate plant breeding[J]. Frontiers in Plant Science，2014，5：484.

[6]Elshire R J，Glaubitz J C，Sun Q，et al.A robust，simple genotyping-by-sequencing （GBS） approach for high diversity species[J].? PLoS One，2011，6（5）：e19379.

[7]Baird Nathan A，Etter Paul D，Atwood Tressa S，et al.Rapid SNP discovery and genetic mapping using sequenced RAD markers[J]. PLoS One，2008，3（10）：e3376.

[8]Hwang K，Oh S，Kim K，et al.Genotyping-by-sequencing approaches using optimized two-enzyme combinations in Asian pears （Pyrus spp.）[J]. Molecular Breeding，2019，39（12）：1-9.

[9]Sonah H，Bastien M，Iquira E，et al.An improved genotyping by sequencing （GBS） approach offering increased versatility and efficiency of SNP discovery and genotyping[J]. PLoS One，2013，8（1）：e54603.

[10]Glaubitz J C，Casstevens T M，Lu F，et al.TASSEL-GBS： a high capacity genotyping by sequencing analysis pipeline[J]. PLoS One，2014，9（2）：e90346.

[11]Melo A T O，Bartaula R，Hale I. GBS-SNP-CROP：a reference-optional pipeline for SNP discovery and plant germplasm characterization using variable length，paired-end genotyping-by-sequencing data[J]. BMC Bioinformatics，2016，17（1）：29.

[12]Torkamaneh D，Laroche J，Belzile F. Genome-wide SNP calling from genotyping by sequencing （GBS） data：a comparison of seven pipelines and two sequencing technologies[J]. PLoS One，2016，16（8）：e0161333.

[13]Taranto F，DAgostino N，Greco B，et al.Genome-wide SNP discovery and population structure analysis in pepper （Capsicum annuum） using genotyping by sequencing[J]. BMC Genomics，2016，17（1）：943.

[14]王小柯，江東，孫珍珠. 利用GBS技術(shù)研究240份寬皮柑橘的系統(tǒng)演化[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（9）：1666-1673.

[15]Zhao P，Zhou H J，Potter D，et al.Population genetics，phylogenomics and hybrid speciation of Juglans in China determined from whole chloroplast genomes transcriptomes and genotyping-by-sequencing （GBS）[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution，2018，126：250-265.

[16]Wu X B，Alexander L W. Genetic diversity and population structure analysis of big leaf hydrangea using genotyping-by-sequencing[J]. Journal of the American Society for Horticultural Science，2019，144（4）：257-263.

[17]Niu S Z，Song Q F，Koiwa H，et al.Genetic diversity，linkage disequilibrium，and population structure analysis of the tea plant （Camellia sinensis） from an origin center，Guizhou plateau，using genome-wide SNPs developed by genotyping-by-sequencing[J]. BMC Plant Biology，2019，19（1）：328.

[18]Pavan S，Marcotrigiano A R，Ciani E，et al.Genotyping-by-sequencing of a melon （Cucumis melo L.） germplasm collection from a secondary center of diversity highlights patterns of genetic variation and genomic features of different gene pools[J].? BMC Genomics，2017，18（1）：53.

[19]Solomon A M，Han K，Lee J H，et al.Genetic diversity and population structure of? Ethiopian Capsicum germplasms[J]. PLoS One，2019，14（5）：e0216886.

[20]周萍萍，顏紅海，彭遠(yuǎn)英，等. 基于高通量GBS-SNP標(biāo)記的栽培燕麥六倍體起源研究[J]. 作物學(xué)報(bào)，2019，45（10）：1604-1612.

[21]Pootakham W，Jomchai N，Ruang-Areerate P，et al. Genome-wide SNP discovery and identification of QTL associated with agronomic traits in oil palm using genotyping-by-sequencing （GBS）[J].? Genomics，2015，105（5-6）：288-295.

[22]Lee J，Izzah N K，Choi B S，et al.Genotyping-by-sequencing map permits identification of clubroot resistance QTLs and revision of the reference genome assembly in cabbage （Brassica oleracea L.）[J]. DNA Research，2016，23（1）：29-41.

[23]Ipek A，Ipek M，Ercisli S，et al.Transcriptome-based SNP discovery by GBS and the construction of a genetic map for olive[J].? Functional & Integrative Genomics，2017，17（5）：493-501.

[24]Jo J，Purushotham P M，Han K，et al. Development of a genetic map for onion （Allium cepa L.） using reference-free genotyping-by-sequencing and SNP assays[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：1606.

[25]Li X，Kong C C，Yu H L，et al. Identification of a major QTL for seed number per silique in cabbage （Brassica oleracea L. var. capitata） using genotyping by sequencing[J].? Euphytica，2019，215（7）：UNSP 133.

[26]Carrasco B，Gonzalez M，Gebauer M，et al. Construction of a highly saturated linkage map in Japanese plum （Prunus salicina L.） using GBS for SNP marker calling[J].? PLoS One，2018，13（12）：e0208032.

[27]賴國榮，張靜，劉函，等. 基于GBS構(gòu)建玉米高密度遺傳圖譜及營養(yǎng)品質(zhì)性狀QTL定位[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，25（9）：1400-1410.

[28]Diouf L，Pan Z E，He S P，et al. High-density linkage map construction and mapping of salt-tolerant QTLs at seedling stage in upland cotton using genotyping by sequencing （GBS）[J]. International Journal of Molecular Sciences，2017，18（12）：2622.

[29]Bhattarai U，Subudhi P K.Identification of drought responsive QTLs during vegetative growth stage of rice using a saturated GBS-based SNP linkage map[J]. Euphytica，2018，214（2）：38.

[30]Zhang L，Guo D L，Guo L L，et al.Construction of a high-density genetic map and QTLs mapping with GBS from the interspecific F1 population of P. ostii ‘Fengdan Bai and P. suffruticosa ‘Xin Riyuejin[J].? Scientia Horticulturae，2019，246：190-200.

[31]Gabay G，Dahan Y，Izhaki Y，et al. High-resolution genetic linkage map of European pear （Pyrus communis） and QTL fine-mapping of vegetative budbreak time[J].? BMC Plant Biology，2018，18（1）：175.

[32]Passianotto A L D，Sonah H，Dias W P，et al.Genome-wide association study for resistance to the southern root-knot nematode （Meloidogyne incognita） in soybean[J]. Molecular Breeding，2017，37（12）：1-11.

[33]郭 燕，喬大河，楊 春，等.基于全基因組SNP的貴州久安古茶樹遺傳關(guān)系分析[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2019，20（1）：26-36.

[34]Gerardo N L，Cristóbal B，Catalina P，et al.High-density genetic map and QTL analysis of soluble solid content，maturity date，and mealiness in peach using genotyping by sequencing[J]. Scientia Horticulturae，2019，2579（17 ）：108734.

[35]高美玲，梁曉雪，劉秀杰，等.基于極端個(gè)體GBS測(cè)序初步定位西瓜果形基因[J]. 分子植物育種，2020，18 （10）：3164- 3171.

[36]楊 柳，周鶴瑩，薄文浩，等.基于選擇清除分析鑒定影響棗果實(shí)大小的基因[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，41（10）：30-36.

[37]Guajardo V，Solis S，Sagredo B，et al.Construction of high density sweet cherry（Prunus avium L.） linkage maps using microsatellite markers and snps detected by genotyping-by-sequencing （GBS）[J].? PLoS One，2015，10（5）：e0127750.

[38]Zhou Z，Zhang C，Zhou Y，et al. Genetic dissection of maize plant architecture with an ultra-high density bin map based on recombinant inbred lines[J].? BMC Genomics，2016，17：178.

[39]Celik I，Bodur S，F(xiàn)rary A，et al.Genome-wide SNP discovery and genetic linkage map construction in sunflower （Helianthus annuus L.） using a genotyping by sequencing （GBS） approach[J]. Molecular Breeding，2015，36（9）：133，

[40]Lee J，Izzah N K，Choi B S，et al.Genotyping-by-sequencing map permits identification of clubroot resistance QTLs and revision of the reference genome assembly in cabbage （Brassica oleracea L.）[J].? DNA Research，2016，23（1）：29-41.

[41]Bielenberg D G，Rauh B，F(xiàn)an S H，et al.Genotyping by sequencing for SNP-based linkage map construction and QTL analysis of chilling requirement and bloom date in peach [Prunus persica （L.） Batsch[J].? PLoS One，2015，10（10）：e0139406.

[42]Gardner K M，Brown? P，Cooke T F，et al. Fast and cost-effective genetic mapping in apple using next-generation sequencing[J]. G3 （Bethesda），2014，4（9）：1681-1687.

[43]Manickavelu A，Jighly A，Ban T.Molecular evaluation of orphan Afghan common wheat （Triticum aestivum L.） landraces collected by Dr. Kihara using single nucleotide polymorphic markers[J]. BMC Plant Biology，2014，14（1）：320.

[44]Nimmakayala P，Tomason Y R，Abburi V L，et al.Genome-wide differentiation of various melon horticultural groups for use in GWAS for fruit firmness and construction of a high resolution genetic map[J]. Frontiers in Plant Science，2016，7：1437.

[45]Tanhuanpaa P，Erkkila M，Tenhola-Roininen T，et al.SNP diversity within and among Brassica rapa accessions reveals no geographic differentiation[J].? Genome，2016，59（1）：11-21.

[46]Ashraf B H，Byrne S，F(xiàn)e D，et al. Estimating genomic heritabilities at the level of family-pool samples of perennial ryegrass using genotyping-by-sequencing[J].? Theoretical and applied Genetics，2016，129（1）：45-52.

[47]Pavan S，Lotti C，Marcotrigiano A，et al. A distinct genetic cluster in cultivated chickpea as revealed by genome-wide marker discovery and genotyping[J]. Plant Genome，2017，10（2）：1-9.

[48]Otto L G，Mondal P，Brassac J，et al. Use of genotyping-by-sequencing to determine the genetic structure in the medicinal plant chamomile，and to identify flowering time and alpha-bisabolol associated SNP-loci by genome-wide association mapping[J]. BMC Genomics，2017，18（1）：1-18.

[49]Kumar S，Kirk C，Deng C，et al.Genotyping-by-sequencing of pear （Pyrus spp.） accessions unravels novel patterns of genetic diversity and selection footprints[J]. Horticulture Research，2017，4（1）：17015.

[50]蔡 露，楊 歡，王 勇，等.利用GBS技術(shù)開發(fā)煙草SNP標(biāo)記及遺傳多樣性分析[J]. 中國煙草科學(xué)，2018，39（5）：17-24.

[51]Wang X，Bao K，Reddy U K，et al.The USDA cucumber （Cucumis sativus L.） collection：genetic diversity，population structure，genome-wide association studies，and core collection development[J].? Horticulture Research，2018，5（1）：64.

[52]Lee S R，Gaskin J F，Kim Y D. Molecular diagnosis for a Tamarix species from two reclaimed lands along the Yellow Sea in Korea inferred from genome wide SNP markers[J].? Journal of Systematics and Evolution，2018，57（3）：247-255.

[53]Ryu J，Kim W J，Im J，et al.Single nucleotide polymorphism （SNP） discovery through genotyping-by-sequencing （GBS） and genetic characterization of Dendrobium mutants and cultivars[J].? Scientia Horticulturae，2019，244：225-233.

[54]Upadhyaya H D，Vetriventhan M，Deshpande S P，et al.Population genetics and structure of a global foxtail millet germplasm collection[J].? Plant Genome，2015，8（3）：1-13.

[55]Ertiro B T，Ogugo V，Worku M，et al. Comparison of kompetitive allele specific PCR （KASP） and genotyping by sequencing （GBS） for quality control analysis in maize[J].? BMC Genomics，2015，16（1）：908.

[56]Chitwood J，Shie A N，Mou B Q，et al.Population structure and association analysis of bolting，plant height，and leaf erectness in spinach[J].? Hortscience，2016，51（5）：481-486.

[57]Wiersma A T，Pulman J A，Brown L K，et al. Identification of Pm58 from Aegilops tauschii[J].? Theoretical and Applied Genetics，2017，130（6）：1123-1133.

[58]董艷輝，宇鳳，溫鑫，等.基于高通量測(cè)序的藜麥連作根際土壤微生物多樣性研究[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2019，34（2）：205-211.

[59]Liu X P，Yu L X.Genome-wide association mapping of loci associated with plant growth and Forage production under salt stress in alfalfa （Medicago sativa L.）[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：853.

[60]Zaid I U，Tang W J，Liu E B，et al. Genome-wide single-nucleotide polymorphisms in CMS and restorer lines discovered by genotyping using sequencing and association with marker-combining ability for 12 yield-related traits in Oryza sativa L. subsp japonica[J]. Frontiers in Plant Science，2017，8：143.

[61]Kang Y J，Lee B M，Nam M，et al.Identification of quantitative trait loci associated with flowering time in perilla using genotyping-by-sequencing[J]. Molecular Biology Reports，2018，46（4）：4397-4407.

[62]Hussain W，Baenziger P S，Belamkar V，et al.Genotyping-by-sequencing derived high-density linkage map and its application to QTL mapping of flag leaf traits in bread wheat[J].? Scientific Reports，2017，7（1）：1-15.

[63]Bajgain P，Rouse M N，Tsilo T J，et al. Nested association mapping of stem rust resistance in wheat using genotyping by sequencing[J]. PLoS One，2016，11（5）：e0155760.

[64]de Leon T B，Linscombe S，Subudhi P K. Molecular dissection of seedling salinity tolerance in rice （Oryza sativa L.） using a high-density GBS-based SNP linkage map[J].? Rice，2016，9（1）：52.

[65]Moncada M D，Tovar E，Montoya J C，et al.A genetic linkage map of coffee （Coffea arabica L.） and QTL for yield，plant height，and bean size[J]. Tree Genetics & Genomes，2016，12（1）：5.

[66]McClure K A，Gardner K M，Toivonen P M A，et al.QTL analysis of soft scald in two apple populations[J]. Horticulture Research，2016，3：16043.

[67]Qi H K，Wang N，Qiao W Q，et al.Construction of a high-density genetic map using genotyping by sequencing （GBS） for quantitative trait loci （QTL） analysis of three plant morphological traits in upland cotton （Gossypium hirsutum L.）[J]. Euphytica，2017，213（4）：83.

[68]Ravelombola W，Qin J，Shi A N，et al.Association mapping revealed SNP markers for adaptation to low phosphorus conditions and rock phosphate response in USDA cowpea [Vigna unguiculata （L.） Walp.] germplasm[J]. Euphytica，2017，213（8）：14.

[69]Shimray P W，Bajaj D，Srivastava R，et al.Identifying transcription factor genes associated with yield traits in chickpea[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2017，35（5）：562-574.

[70]Zhang J P，Long Y，Wang L M，et al.Consensus genetic linkage map construction and QTL mapping for plant height-related traits in linseed flax （Linum usitatissimum L.）[J].? BMC Plant Biology，2018，18（1）：1-12.

[71]Gali K K，Liu Y，Sindhu A，et al.Construction of high-density linkage maps for mapping quantitative trait loci for multiple traits in field pea （Pisum sativum L.）[J]. BMC Plant Biology，2018，18：172.

[72]Talukder Z I，Long Y M，Seiler G J，et al.Introgression and monitoring of wild Helianthus praecox alien segments associated with Sclerotinia basal stalk rot resistance in sunflower using genotyping-by-sequencing[J]. PLoS One，2019，14（3）：e0213065.

[73]Perez-de-Castro A，Esteras C，Alfaro-Fernandez，et al.Fine mapping of wmv1551，a resistance gene to Watermelon mosaic virus in melon[J].? Molecular Breeding，2019，39（7）：93.劉艷艷，曹婷，劉興華，等. 32份粳稻骨干親本抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（13）：69-72.doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2020.13.013