葵花盤不同產(chǎn)地、不同部位總黃酮含量的變化分析

劉吉爽，張雅蓉，徐 犇，李 納，徐文慧，陳 新

（長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117）

葵花盤為菊科植物向日葵（Helianthus annuus L.）收取果實(shí)后的干燥盤狀花序托。近年來，隨著對(duì)葵花盤化學(xué)成分、功效的深入研究，逐漸應(yīng)用于臨床?？ūP在《中藥大辭典》中記載：向日 葵花盤，味甘、性寒，歸肝經(jīng)，功用清熱平肝、止痛止血；主治高血壓、頭痛頭暈、耳鳴、痛經(jīng)、子宮異常出血、瘡疹[1]。作為中成藥玉盤消渴片組成成分之一，葵花盤藥材標(biāo)準(zhǔn)收載于《上海市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（1994年版），飲片炮制規(guī)范收載于《浙江省炮制規(guī)范》（1986年版）。

葵花盤主要含有黃酮、多糖、綠原酸、多肽等成分，其中黃酮類成分是其主要活性物質(zhì)之一[2-8]。與大多含有黃酮類成分的中藥相同，葵花盤具有明顯的降血壓、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗氧化、抗菌等藥理活性[9-10]。植物的次生代謝產(chǎn)物在體內(nèi)的分布受基因和所處生境的影響，從生源合成角度而言，植物不同組織器官的生理功能不同，不同成分在不同部位的積累分布不同，藥理活性也有一定的差異[11-12]。

目前，關(guān)于葵花盤有效成分及藥理作用的報(bào)道相對(duì)較少，不同產(chǎn)地、不同部位總黃酮含量研究未見報(bào)道?？ūP在全國(guó)廣泛分布，作為一種新興的中藥，探討不同產(chǎn)地葵花盤總黃酮的含量差異及藥材主要藥效成分含量的分布格局，為建立科學(xué)合理的質(zhì)量控制方法提供依據(jù)，對(duì)葵花盤進(jìn)一步研究、資源合理利用奠定堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 T6紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司，型號(hào)：25-1650-01-1216）、TU-1810紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司，型號(hào)：CC25-ZY1）、UV 5100）紫外-可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司，型號(hào)：REI 107002）、HWS-12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.1.2 試劑 蘆丁對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，含量為92.6%，批號(hào)100080-201610），氫氧化鈉（北京化工廠，20111213），亞硝酸鈉（天津市光復(fù)科技有限公司，20110519），硝酸鋁（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，20160513），無水乙醇（北京化工廠，分析純），超純水。

1.1.3 試藥 葵花盤采集于吉林省白城市、大安市、長(zhǎng)春市、洮南市等地區(qū)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 對(duì)照品溶液制備 取適量的蘆丁對(duì)照品精密稱定，加入60%乙醇，超聲處理使其溶解后放冷，補(bǔ)加60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻制得每1 mL含0.2 mg的蘆丁對(duì)照品溶液[13]。

2.2 供試品溶液制備 稱取葵花盤粉末（50目）1 g，于100 mL的圓底燒瓶，加50 mL石油醚（60～90℃），加熱回流脫脂處理2 h，濾過，將石油醚液棄去，藥渣置水浴揮散溶劑，同濾紙一起移入圓底燒瓶，精密移取60%乙醇50 mL，稱重，回流提取2 h，放冷至室溫，補(bǔ)足失重，搖勻，濾過，即得。

3 結(jié)果

3.1 吸收波長(zhǎng)的選擇 取蘆丁對(duì)照品溶液適量，按《中國(guó)藥典》2015年版總黃酮含量測(cè)定方法顯色，以相應(yīng)試劑為空白，在200～800 nm進(jìn)行掃描，對(duì)照品溶液在505 nm波長(zhǎng)處顯示有最大吸收，故選定檢測(cè)波長(zhǎng)為505 nm[13]。

3.2 顯色方法優(yōu)化 精密量取“2.2”項(xiàng)下溶液，照常用總黃酮測(cè)定方法顯色[13]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)顯色后產(chǎn)生白色絮狀物，連續(xù)測(cè)定多次，吸光度值差異大。取同一供試品溶液測(cè)定濾過前后吸光度，比較吸光度變化，結(jié)果續(xù)濾液的吸光度值基本穩(wěn)定。

故將供試品顯色優(yōu)化為：精密量取供試品溶液2～5 mL，置25 mL量瓶中，加60%乙醇至6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1 mL，混勻，放置6 min，再加10%硝酸鋁溶液1 mL，搖勻，放置6 min。加氫氧化鈉試液10 mL，再加60%乙醇至刻度，搖勻，放置15 min，濾過，續(xù)濾液，按相應(yīng)方法測(cè)定吸光度。結(jié)果見圖1。

圖1 過濾前后樣品1 min內(nèi)測(cè)定結(jié)果

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 照《中國(guó)藥典》2015年版，依法進(jìn)行試驗(yàn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[13]。結(jié)果在7.526 5～45.159 2 μg/mL線性關(guān)系良好，計(jì)算得回歸方程為Y=0.013 3X-0.017 8（r=0.999 5）。

3.4 儀器精密度 按《中國(guó)藥典》2015年版試驗(yàn)，依法連續(xù)測(cè)定吸光度6次[13]，表明儀器精密度良好，RSD%為0.65%（n=6）。

3.5 中間精密度實(shí)驗(yàn) 同一樣品，三個(gè)不同操作人員，三臺(tái)不同型號(hào)的紫外-可見分光光度計(jì)，不同日期測(cè)定，得出其RSD值為0.94%。

3.6 穩(wěn)定性 精密吸取“2.2”項(xiàng)下溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h測(cè)定吸光度[13]。結(jié)果顯示供試品溶液穩(wěn)定性良好，RSD%為1.34%（n=6）。

3.7 重復(fù)性 取葵花盤藥材粉末（50目）6份，按《中國(guó)藥典》2015年版試驗(yàn)[13]，結(jié)果葵花盤總黃酮的含量均值0.94%，RSD%為1.96%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

3.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取葵花盤粉末（50目）6份，每份1 g，按“2.2”項(xiàng)下要求制備，每份加入蘆丁對(duì)照品9.98 mg，按《中國(guó)藥典》2015年版依法測(cè)定[13]。結(jié)果平均回收率100.92%，RSD%為2.59%（n=6），表明方法準(zhǔn)確性良好。

3.9 不同產(chǎn)地含量測(cè)定 精密稱取吉林省內(nèi)11個(gè)不同地區(qū)的葵花盤藥材粉末1 g，按“2.2”項(xiàng)下要求制備，“3.2”項(xiàng)下要求顯色，測(cè)定并計(jì)算葵花盤樣品中的總黃酮含量。結(jié)果采集于吉林省不同地區(qū)的葵花盤總黃酮的含量存在差異，結(jié)果見圖2。

圖2 葵花盤不同產(chǎn)地總黃酮含量

3.10 不同部位含量測(cè)定 取不同產(chǎn)地葵花盤苞片、膜質(zhì)托片、花梗殘基及海綿體粉末（50目）各1 g，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備，“3.2”項(xiàng)下的方法顯色，于505 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A，計(jì)算各部位總黃酮含量。結(jié)果葵花盤各部位均含黃酮類成分，不同部位的含量存在一定差異，膜質(zhì)托片含量最高，是海綿組織的近2倍，總黃酮在葵花盤各器官中的分布格局為膜質(zhì)托片>苞片>花梗殘基>海綿組織，作為次生代謝的產(chǎn)物具有在特定部位積累的趨勢(shì)。結(jié)果見表1、圖3。

3.11 葵花盤總黃酮含量與不同部位的相關(guān)性分析 運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)總黃酮含量與不同部位（花梗殘基、膜質(zhì)托片、苞片、海綿體）的相關(guān)性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，膜質(zhì)托片、苞片總黃酮含量與其他各部位存在顯著性差異（P＜0.05），進(jìn)一步表明總黃酮含量與部位有聯(lián)系，葵花盤黃酮類成分在植物中的代謝生成和積累具有一定的部位選擇性。

圖3 不同部位總黃酮含量

表1 葵花盤不同部位總黃酮含量（n=2）（mg/g）

4 討論

黃酮類成分廣泛分布于各種生物體，具有多種藥理作用，已成為質(zhì)量控制的關(guān)鍵性指標(biāo)成分和活性成分的重要組成?？ūP具有清熱平肝、止痛、止血等作用，其中起主要作用的為黃酮類成分。相關(guān)研究表明，葵花盤總黃酮作為一種強(qiáng)抗氧劑，可清除體內(nèi)的氧自由基，阻止核酸氧化，降低嘌呤含量，促進(jìn)尿酸代謝，具有良好的治療痛風(fēng)的作用[14]。以葵花盤為原料的相關(guān)產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為醫(yī)藥和保健品的研發(fā)熱點(diǎn)，但缺乏質(zhì)量可控的標(biāo)準(zhǔn)。

本試驗(yàn)建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于葵花盤總黃酮的含量測(cè)定，對(duì)葵花盤質(zhì)量控制、保障臨床用藥安全有效具有現(xiàn)實(shí)意義和指導(dǎo)意義?？ūP總黃酮含量測(cè)定顯色時(shí)產(chǎn)生白色絮狀物，且實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)葵花盤果膠含量越高其絮狀物越多，直接測(cè)定影響紫外透過率。因此，為保證測(cè)定數(shù)據(jù)的穩(wěn)定、準(zhǔn)確和可靠，測(cè)定吸光度前需過濾?？ūP總黃酮顯色與果膠提取原理極為相似[15]，分析此現(xiàn)象的產(chǎn)生可能為提取液中的果膠與硝酸鋁形成鋁鹽，加入NaOH試液后形成絮狀物。測(cè)定吸光度前濾過處理，可減少干擾，試驗(yàn)數(shù)據(jù)更為準(zhǔn)確。

從本文結(jié)果看，不同產(chǎn)地葵花盤總黃酮含量有差異，其中白城洮河鎮(zhèn)慶生村的樣品含量最高，洮南市二龍鄉(xiāng)仁義村最低，僅0.37%，二者總黃酮含量相差近8倍，可見其成分分布具有生境選擇性。總黃酮在葵花盤四個(gè)部位分布有差異，其中膜質(zhì)托片、苞片含量較高，海綿體含量最低，表明黃酮類成分在葵花盤不同部位的代謝積累有一定的選擇性。植物的各器官在其生長(zhǎng)發(fā)育過程中起到的作用不同，其生理代謝量不同，致使各器官化學(xué)成分的分布存在差異[16]。大量研究表明，植物果實(shí)及種子的形成過程中伴隨黃酮類物質(zhì)的產(chǎn)生[17]，膜質(zhì)托片與向日葵果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，故黃酮類成分在此部位大量產(chǎn)生和積累。苞片作為向日葵光合作用的主要部位之一，是葵花盤中除膜質(zhì)托片外總黃酮含量較高的部位，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的黃酮類成分多集中于光合作用部位的結(jié)論相一致[12]。不同產(chǎn)地、不同部位葵花盤總黃酮含量分布的研究，對(duì)保證葵花盤用藥質(zhì)量及資源的進(jìn)一步開發(fā)和合理利用提供依據(jù)，為中藥有效成分生源合成途徑及成分分布提供參考。