散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化主動脈鈣庫操縱性鈣通道信號分子及血清炎癥因子的影響

丁云錄，李馳坤，歐喜燕，李曉兵，成光宇，劉愛東

（長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，長春 130021）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種以血管壁脂質(zhì)斑塊為主要特征的慢性進行性血管疾病，其引發(fā)冠心病、腦梗塞等急性心腦血管事件而嚴重危害人類健康。中藥在治療動脈粥樣硬化慢性病變方面有明顯優(yōu)勢，中藥作用溫和持久，毒副作用低，且作用機理具有多效應(yīng)、多位點等特點，遠期效果好。散結(jié)通脈方針對冠心病痰瘀互結(jié)證進行治療，體現(xiàn)化瘀清痰利水動態(tài)治療思想，前期的臨床實踐發(fā)現(xiàn)，該處方具有逆轉(zhuǎn)和消退動脈粥樣硬化斑塊的作用。拓展了中醫(yī)防治動脈粥樣硬化的新思路，并為臨床治療提供實驗依據(jù)和安全有效的中醫(yī)藥療法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 SPF級7～8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，體質(zhì)量（20±1）g，60只，分籠飼養(yǎng)，室溫（23±1）℃，相對濕度50%，通風良好，室內(nèi)12 h明暗自動切換（光照時間7:00～19:00）。動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。散結(jié)通脈方浸膏（處方由丹參、水蛭、三七、花蕊石、茵陳、澤瀉、茯苓、砂仁、檀香等14味藥組成），性狀：棕褐色至棕色浸膏，氣微，味苦，批號：20180329，長春中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院實驗研究中心提供。阿托伐他汀鈣片，規(guī)格：10 mg/片，7片/盒，批號：20171221，浙江新東港藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品。戊巴比妥鈉，規(guī)格：500 mg/瓶，批號：WXBB6772V，美國Sigma公司產(chǎn)品。肝素鈉注射液，規(guī)格：2 mL/12 500 u/支，批號：1702101，上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司。膽固醇，規(guī)格：分析純，500 g/瓶，批號：LOT5AF10250，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司產(chǎn)品；膽酸鈉（豬），規(guī)格，分析純，500 g/瓶，批號：K01N8B47111，上海源葉生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品?？偰懝檀迹═C）檢測試劑盒，規(guī)格：10 mL×10，批號：171991；三酰甘油（TG）檢測試劑盒，規(guī)格：10 mL×10，批號：177781；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-cho）檢測試劑盒，規(guī)格：10 mL×7，批號：170651；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-cho）檢測試劑盒，規(guī)格：10 mL×8，批號：170711；中生北控生物科技股份有限公司產(chǎn)品。高敏C-反應(yīng)蛋白（hs-CRP）、E-選擇素（E-selectin）、白細胞介素-6（IL-6），規(guī)格：96T/盒，批號：E20180101A，均購自美國RD公司。Orai1抗體，規(guī)格：200 μg/mL，批號：D2318，STIM1抗體，規(guī)格：200 μg/mL，批號：K2818，均為Santa Cruz公司產(chǎn)品。美國UVP凝膠成像系統(tǒng)，型號：ChemiDoc-It 510 Imager，Ultra-Violet Products Ltd產(chǎn)品。電泳儀，型號：DYY-6C,北京市六一儀器廠產(chǎn)品。酶標儀，型號：BIO680，Japan BIO RAD公司產(chǎn)品。Junior全自動分析儀，型號：selectra junior，荷蘭威圖公司產(chǎn)品。臺式高速低溫離心機，型號：Biofuge Stratos，德國賀利氏公司產(chǎn)品?？烧{(diào)高速勻漿器，型號：FSH-2，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法[1-5]

1.2.1 動物造模與分組 選用8周齡ApoE-/-小鼠（品系C57BL/6J），雄性，60只。小鼠給予普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為正常對照組，模型對照組，陽性對照藥阿托伐他汀鈣49.72 mg/（kg·d）給藥劑量組，散結(jié)通脈方設(shè)高劑量[13.42 g/（kg·d）]、中劑量[6.71 g/（kg·d）]和低劑量[3.35 g/（kg·d）] 3個給藥劑量組，共6組，每組10只。建立動脈粥樣硬化斑塊模型，除正常對照組外，其余實驗組均飼以高脂飼料（2%膽固醇、0.4%膽酸鹽、10%脂肪、69.6%普通飼料）喂養(yǎng)12周。實驗期間自由攝食飲水，節(jié)律光照。造模同時灌胃供試藥品混懸液，正常對照組及模型對照組灌胃蒸餾水。每3日稱量各組小鼠體質(zhì)量1次，以調(diào)整給藥量。

1.2.2 檢測指標 實驗周期結(jié)束，禁食12 h，1%戊巴比妥0.5～1.0 mL腹腔麻醉，腹主動脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃下3 000 r/min離心10 min，吸取上層血清，進行血脂及血清炎癥因子檢測。取血結(jié)束后，以肝素生理鹽水灌洗心臟及主動脈根部，無菌條件下取主動脈根部，制備蛋白裂解液，進行Western blot檢測。檢測指標：Junior全自動分析儀檢測血清TC、TG、HDL-cho和LDL-cho水平。BIO680酶標儀檢測 hs-CRP、E-selectin、IL-6水平，均采用酶聯(lián)免疫法按試劑盒說明檢測。Western blot法檢測主動脈根部Orai1及STIM1蛋白表達：BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整蛋白濃度，煮沸3～5min使蛋白變性；SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜；轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到1×TBST中，漂洗1～2 min，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉60 min；TBST稀釋一抗（1:1 000），4 ℃孵育過夜；加入1×TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5～10 min，共洗滌3次；TBST稀釋二抗(1:3 000)，室溫孵育60 min；TBST洗膜3次，每次5～10 min；ECL化學發(fā)光，顯影，定影。用Quantity One軟件對凝膠圖像進行光密度分析，以目的條帶與內(nèi)參照條帶信號強度的比值代表組織中目的蛋白的表達水平。

2 結(jié)果

2.1 血脂摩爾濃度統(tǒng)計結(jié)果 本試驗研究采用喂飼高脂高膽固醇飼料方法建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從建立模型12周后所測得的試驗數(shù)據(jù)可以看出，動脈粥樣硬化模型組動物血清TC、TG、LDL-cho及TC/HDL-cho比值均較正常對照組明顯升高（分別為P＜ 0.01或P＜0.05），動脈粥樣硬化動物模型血脂水平明顯增高。散結(jié)通脈方13.5、6.75和3.40 g/kg 3個給藥組具有明顯降低模型動物血清TC、TG和LDLcho水平的作用，與動脈粥樣硬化模型組比較，分別為P＜ 0.01或P＜0.05，散結(jié)通脈方13.5、6.75 g/kg 2個劑量組還可以使TC/HDL-cho比值明顯降低，與動脈粥樣硬化模型組比較，P＜0.01和P＜0.05。見表1。

2.2 hs-CRP、E-selectin、IL-6質(zhì)量濃度統(tǒng)計結(jié)果 模型對照組與正常對照組比較，大鼠血清中hs-CRP、E-selectin、IL-6水平明顯升高，具有顯著性差異（P＜0.01或P＜0.05）。而13.5、6.75 g/kg 2個劑量組與模型對照組比較，大鼠血清中hs-CRP水平均有所下降，具有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。結(jié)果表明散結(jié)通脈方可以對抗動脈粥樣硬化患者體內(nèi)炎癥反應(yīng)，降低hs-CRP水平，進而可起到抗心肌缺血降低心血管事件發(fā)生率的作用。與模型組相比，散結(jié)通脈方13.5 g/kg劑量組血清IL-6水平明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），說明散結(jié)通脈方有效降低ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型的IL-6水平，從而抑制炎癥、穩(wěn)定動脈粥樣硬化斑塊的作用。散結(jié)通脈方13.5 g/kg劑量組E-selectin水平明顯降低，與模型對照組比較，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），提示散結(jié)通脈方可能通過下調(diào)E-selectin水平，減少白細胞在內(nèi)皮表面的黏附，進而減少泡沫細胞的形成，延緩了動脈粥樣硬化的形成。見表2。

2.3 主動脈根部Orai1、STIM1蛋白表達統(tǒng)計結(jié)果 我們以ApoE-/-小鼠為實驗對象，高脂飲食誘導動脈粥樣硬化模型，探討動脈粥樣硬化發(fā)生過程中Orai1、STIM1變化情況，研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組Orai1、STIM1蛋白表達明顯增加（P＜0.01），提示：Orai1、STIM1介導的SOCC參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展過程。在給予散結(jié)通脈方干預后，與模型組相比，散結(jié)通脈方13.5、6.75 g/kg 2個劑量組主動脈根部Orai1、STIM1蛋白表達明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.01或P＜0.05）；散結(jié)通脈方3.40 g/kg劑量組主動脈根部Orai1蛋白表達明顯低于模型組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。見表2。

表1 散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型血脂的影響（，n =10）

表1 散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型血脂的影響（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

表2 散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型炎癥因子及Orai1、STIM1蛋白表達的影響（，n =10）

表2 散結(jié)通脈方對ApoE-/-小鼠AS模型炎癥因子及Orai1、STIM1蛋白表達的影響（，n =10）

注：與模型組比較，# P ＜0.05，## P ＜0.01

3 討論

冠狀動脈粥樣硬化是導致冠心病的主要病因，中醫(yī)沒有動脈粥樣硬化病名，根據(jù)臨床表現(xiàn)，將動脈粥樣硬化性疾病歸為胸痹、脈痹范疇。西醫(yī)治療冠心病以藥物治療為主，側(cè)重于穩(wěn)定冠狀動脈粥樣硬化斑塊，常見的藥物不良反應(yīng)包含出血事件、肌肉酸痛、胃腸道反應(yīng)等影響了治療的效果。中藥在治療動脈粥樣硬化慢性病變方面有明顯優(yōu)勢，中藥作用溫和持久，毒副作用低，且作用機理具有多效應(yīng)、多位點等特點，遠期效果優(yōu)秀。國家名老中醫(yī)黃永生教授綜合古代醫(yī)家對于痰瘀的論述及自己多年的臨床實踐，根據(jù)《血證論》：“血積既久，亦能化為痰水”的論述，提出“瘀能化水”治療動脈粥樣硬化的新思路。他認為動脈粥樣硬化的治療重點為斑塊的逆轉(zhuǎn)和消退，動脈粥樣硬化斑塊為痰瘀膠結(jié)的外在體現(xiàn)，是痰瘀長時間膠結(jié)凝聚的產(chǎn)物，痰結(jié)成瘀，瘀又生痰，不斷進展和演化，痰不清，瘀難化。因此，治療上需以化痰開路，將痰濁之邪蕩滌體外，繼以化瘀成水（痰），消散斑塊。散結(jié)通脈方為全國名中醫(yī)黃永生教授臨床經(jīng)驗方，臨床使用逾20年，療效確切，臨床依據(jù)充分，本方逆轉(zhuǎn)冠狀動脈粥樣硬化斑塊有確切的療效，具有進一步開發(fā)與研究的價值和意義。本課題通過建立ApoE-/-小鼠動脈粥樣硬化模型，從主動脈鈣庫操縱性鈣通道信號分子STIM1、Orai1蛋白表達及血清hs-CRP、E-selectin、IL-6含量等方面探討痰瘀同治法穩(wěn)定易損斑塊的可能機制。

TC和TG是血漿中的主要脂質(zhì)成分，脂質(zhì)成分的異常能夠?qū)е聞用}粥樣硬化的形成并促進其發(fā)展[6]，LDL-cho是體內(nèi)膽固醇代謝轉(zhuǎn)運的主要載體，研究表明，LDL-cho的水平與動脈粥樣硬化的發(fā)病呈正相關(guān)[7]，大量的LDL-cho沉積可導致其向血管內(nèi)膜下遷移并聚集，促進其進行氧化修飾，進一步損傷血管內(nèi)皮，促使泡沫細胞增多及動脈斑塊的形成。與LDL-cho相反的是，HDL-cho可以將膽固醇攜帶到肝臟代謝，與動脈粥樣硬化發(fā)病呈現(xiàn)負相關(guān)。本次研究也證實散結(jié)通脈方具有顯著的降血脂作用。動脈粥樣硬化（AS）是一種多因性疾病，血管內(nèi)皮損傷后多種炎性細胞聚集、吸附于動脈內(nèi)膜，并合成釋放多種炎性因子如hs-CRP、腫瘤壞死因子、IL-6、IL-1等，進而刺激巨噬細胞吞噬氧化LDL-C，成為泡沫細胞，沉積為脂質(zhì)條紋，由此可見，炎性反應(yīng)貫穿了AS形成的始終，并在AS的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了極其重要作用。研究表明，AS病變的早期階段存在凋亡細胞的激活，并引發(fā)炎癥，生理狀態(tài)下巨噬細胞可吞噬凋亡細胞以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，但由于巨噬細胞大量吞噬氧化LDL-C，導致吞噬凋亡細胞能力降低。血管內(nèi)膜炎癥反應(yīng)加強可加劇AS斑塊膠原降解，纖維帽變薄，形成了易損斑塊。hs-CRP作為心腦血管疾病的敏感指標，可以作為心血管疾病的獨立預測因子，可以預測心血管疾病發(fā)生的風險，預測斑塊穩(wěn)定性和未來心血管意外事件，hs-CRP水平高低可反映斑塊的易損程度，如能降低hs-CRP的表達，可起到延緩動脈粥樣硬化及穩(wěn)定粥樣斑塊的作用[8-10]。IL-6是動脈粥樣硬化進程中的炎癥標志物，同時也是心血管疾病的獨立危險因素。IL-6能夠?qū)⒓毙匝仔苑磻?yīng)放大，促進慢性炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生，是炎癥反應(yīng)的一個中樞性調(diào)節(jié)因子[11-13]。

Ca2+作為細胞內(nèi)重要的第二信使，在介導細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導及細胞的生理機能中發(fā)揮重要作用，而Ca2+失穩(wěn)態(tài)參與了心血管疾病、糖尿病、阿爾茲海默病等疾病的發(fā)生發(fā)展。以往的研究也顯示，金屬離子對動脈斑塊的形成起促進作用，且動脈斑塊中Ca2+濃度顯著高于正常組織。生理條件下，鈣池操縱性鈣通道（store-operates cation channels，SOCC）是非興奮細胞介導外鈣內(nèi)流的重要離子通道，對細胞內(nèi)鈣的穩(wěn)態(tài)起到重要作用，直接參與調(diào)節(jié)血管平滑肌細胞的增殖、遷移、收縮等活動。鈣釋放激活鈣通道調(diào)節(jié)分子1（Orai1）和基質(zhì)交聯(lián)分子 1（STIM1）是構(gòu)成鈣池操縱性鈣通道（SOCC）的主要構(gòu)成因子[14]。有研究顯示，血小板活化在冠狀動脈易損斑塊的形成及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而SOCC則是激活血小板的關(guān)鍵，通過對冠心病患者冠狀動脈易損斑塊與SOCC及瞬時受體電位通道1（TRPC1）之間關(guān)系的探討，發(fā)現(xiàn)易損斑塊組血小板STIM1、Orai1高表達[15-16]。尿緊張素Ⅱ是促進血管平滑肌細胞增殖的血管活性肽，可通過激活SOCC增加VSMCs外鈣內(nèi)流，從而促進VSMCs增殖，且此作用可被SOCC阻斷劑或基因沉默其結(jié)構(gòu)蛋白STIM1、Orai1逆轉(zhuǎn)[17]。SOCC介導的鈣內(nèi)流在動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，STIM1、Orai1是SOCC的主要組成分子，他們之間的相互作用促成了動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生發(fā)展，由此可知，SOCC是治療動脈粥樣硬化的重要靶點[18-21]。本研究結(jié)果表明，散結(jié)通脈方可明顯降低STIM1、Orai1水平，可以通過下調(diào)鈣離子信號蛋白的表達抑制血管平滑肌細胞增殖遷移，并通過發(fā)揮調(diào)脂、抗炎等多種效應(yīng)，對動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中多因素多環(huán)節(jié)起到調(diào)節(jié)作用，進而延緩甚或逆轉(zhuǎn)不穩(wěn)定斑塊的病理進程。