腎血管性高血壓大鼠心臟功能及心臟組織中ACE及AT1的mRNA和蛋白表達(dá)的性別差異

買買提吐爾·克力木 鄔利婭·伊明 阿瓦古麗·達(dá)吾提

[摘要] 目的 觀察腎血管性高血壓大鼠心臟功能及心臟組織中血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）及AT1的mRNA和蛋白表達(dá)的性別差異。方法 75只SD大鼠采用兩腎一夾（2K1C）法建立腎血管性高血壓大鼠模型，并將其中25只雌性大鼠通過切除雙側(cè)卵巢制備雌激素低下的腎血管性高血壓模型。75只SD大鼠共分為3組，即雄性2K1C組（2K1C-M組）、雌性2K1C組（2K1C-F組）、雌性去勢手術(shù)組（2K1C-OVX組），每組25只。于32周時(shí)測體重行心臟血流動(dòng)力學(xué)檢查后，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗后液氮凍存，留取部分左心室心肌組織標(biāo)本，用免疫印跡檢測蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測組織中相關(guān)分子的mRNA表達(dá)。 結(jié)果 血流動(dòng)力學(xué)結(jié)果顯示，2K1C-OVX組的收縮壓明顯低于2K1C-F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。2K1C-OVX組室內(nèi)壓最大下降速率明顯高于2K1C-F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。RT-PCR的結(jié)果顯示，2K1C-M組的ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，而ACE2的mRNA表達(dá)量低于2K1C-F組和2K1C-OVX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。在蛋白表達(dá)方面，2K1C-M組的AT1蛋白表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，而ACE2蛋白表達(dá)量低于2K1C-F組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。 結(jié)論 腎血管性高血壓大鼠心臟功能及心臟組織中ACE1及AT1的mRNA和蛋白的表達(dá)存在性別差異。

[關(guān)鍵詞] 性別差異;腎血管性高血壓;心臟功能;腎素-血管緊張素系統(tǒng)

[中圖分類號(hào)] R544.1 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-7210（2020）07（a）-0004-04

[Abstract] Objective To investigate gender difference of cardiac function and the angiotensin converting enzyme （ACE） and AT1 mRNA and protein expression in heart tissue of renovascular hypertensive rats. Methods The renovascular hypertensive rat model was established in 75 SD rats by two-kidney one-clip （2K1C） method and 25 female rats among them were prepared with low estrogen renovascular hypertensive model by removing bilateral ovaries. A total of 75 SD rats were divided into three groups， namely， male 2K1C group （2K1C-M group）， female 2K1C group （2K1C-F group）， and female ovariectomized group （2K1C-OVX group）， with 25 rats in each group. At 32 weeks， weight was measured and cardiac hemodynamics was performed and then the heart was quickly taken out， rinsed with normal saline and frozen in liquid nitrogen. Part of the left ventricular myocardial tissue specimens were left， protein expression was detected by Western blot， and mRNA expression of relevant molecules in the tissue was detected by RT-PCR. Results The hemodynamic results showed that the systolic blood pressure of the 2K1C-OVX group was significantly lower than that of the 2K1C-F group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. The maximum indoor pressure drop rate in the 2K1C-OVX group was significantly higher than that in the 2K1C-F group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. RT-PCR results showed that ACE1， AT1a and AT1b mRNA expression levels of the 2K1C-M group were higher than those of the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， while ACE2 mRNA expression level was lower than that of the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， with statistically significant differences （all P < 0.05）. In terms of protein expression， the AT1 protein expression level in the 2K1C-M group was higher than that in the 2K1C-F group and 2K1C-OVX group， while ACE2 protein expression level was lower than that in the 2K1C-F group， with statistically significant difference （all P < 0.05）. Conclusion The cardiac function， mRNA and protein expressions of ACE1 and AT1 in cardiac tissue show gender difference in renovascular hypertensive rats.

[Key words] Gender difference; Renovascular hypertensive; Cardiac function; Renin-angiotensin system

隨著我國人民生活方式的轉(zhuǎn)變和人口老齡化，心血管疾病已成為威脅人民健康的疾病之一[1]。高血壓是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2]。高血壓患病率男性高于女性，隨著年齡增長，女性升高幅度明顯高于男性[3]。腎血管性高血壓是腎動(dòng)脈或主要分支的狹窄等諸多因素引起的疾病，是腎血流量減少所致的高血壓，狹窄或缺血進(jìn)一步導(dǎo)致腎素-血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）激活[4-5]，RAS由腎素、血管緊張素原、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、血管緊張素（AngⅡ）及相關(guān)受體構(gòu)成[6]。有研究表明，心臟組織存在局部RAS[7-10]，其對心肌細(xì)胞的增生，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定起到重要作用[11]。

本試驗(yàn)通過測定不同性別大鼠心臟局部RAS各組分蛋白及mRNA的表達(dá)，研究性別與腎血管性高血壓大鼠心臟組織腎素-血管緊張素各組分蛋白及mRNA的關(guān)系，為今后學(xué)習(xí)及研究打好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 ?體重為180～200 g的SD大鼠共75只，雌性50只，雄性25只，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)：SCXK（新）20160003，所有操作符合動(dòng)物倫理學(xué)準(zhǔn)則。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行兩腎一夾（2K1C）手術(shù)，分為雄性2K1C組（2K1C-M組）、雌性2K1C組（2K1C-F組）、雌性去勢手術(shù)組（2K1C-OVX），每組25只，術(shù)后4周用BP-6無創(chuàng)尾動(dòng)脈測壓儀測定血壓，收縮壓≥150 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）的大鼠進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間大鼠自由喂養(yǎng)，環(huán)境為SPF級(jí)。

1.1.2 試劑 ?AngⅡ放射免疫分析試劑盒和雌二醇放射免疫試劑盒由北京北方生物技術(shù)研究所提供;戊巴比妥鈉（批號(hào)：92101，由Sigma公司提供）;蛋白定量（考馬斯亮藍(lán)）試劑盒（批號(hào)：20180117）;ACE1（批號(hào)：ab11 734）、AT1R（批號(hào)：ab9391）、AT2R（批號(hào)：ab 92445）抗體（由美國Santa Cruz公司提供）;HRP標(biāo)記的二抗、免疫印跡增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒（由尚柏生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司提供）;TRIzol、RNase inhibitor、Oligd（T）18、dNTPs，PCRbuffer，均由TaKaRa公司提供。

1.1.3 儀器 ?Powerlab生物信號(hào)處理系統(tǒng)（型號(hào)：PL35-08B55-V，由澳大利亞AD Instruments公司提供）;蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀（型號(hào)：MyCycler Thermal Cycler，由美國Bio-Rad公司提供）;紫外分光光度計(jì)（型號(hào)：UV-2802，由上海尤尼柯儀器有限公司提供）;Real time PCR儀（型號(hào)：ABI QuantStudioTM 6 Flex Real-Time PCR Syste，由ABI公司提供）;數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（型號(hào)：2500，由上海天能科技有限公司提供）。

1.2 方法

1.2.1 2K1C高血壓動(dòng)物模型的制作 ?75只SD大鼠均戊巴比妥40 mg/kg腹腔注射麻醉。仰臥固定于手術(shù)臺(tái)并常規(guī)備皮，沿腹部中線分別切開皮層和肌肉層，用鑷子將腹內(nèi)器官移到一邊，分離及用內(nèi)徑為0.25 mm的U型銀夾套住腎臟動(dòng)脈。隨后分層縫合切口，后肢肌肉注射青霉素鈉8萬U預(yù)防感染，完成2K1C手術(shù)。

1.2.2 雙側(cè)卵巢切除手術(shù)（OVX） ?25只雌性SD大鼠戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉后分離雙側(cè)卵巢，結(jié)扎卵巢動(dòng)脈后切除雙側(cè)卵巢，術(shù)后給予青霉素（8萬U）預(yù)防感染。常規(guī)飼養(yǎng)，室溫20～25℃。

1.2.3 血流動(dòng)力學(xué)測定 ?手術(shù)32周后，用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥固定在操作臺(tái)上，分離右側(cè)頸總動(dòng)脈插入PES0導(dǎo)管，壓力傳感器連接導(dǎo)管，信號(hào)輸入至powerlab系統(tǒng)，并且信號(hào)穩(wěn)定后，記錄頸總動(dòng)脈舒張壓（DBP）/收縮壓（SBP），再向左心室內(nèi)推送導(dǎo)管，至出現(xiàn)明顯的心室壓波形，記錄血液動(dòng)力學(xué)參數(shù)，對不符合要求的給予剔除。

1.2.4 心臟標(biāo)本收集 ?52只SD大鼠32周齡時(shí)測體重并行血液動(dòng)力學(xué)測定后，迅速取出心臟，用生理鹽水沖洗后，液氮凍存。

1.2.5 組織勻漿液的制備 ?取心臟組織，稱重，取9倍組織重量的預(yù)冷生理鹽水，勻漿（15 000 r/min），制成10%的組織生理水勻漿液，4℃ 12 000 g離心10 min，收集上清液待測。

1.2.6 免疫印跡（Western blot） ?整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)樣本中，提取蛋白質(zhì)，每組3個(gè)樣本，經(jīng)SDS-page電泳，轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素薄膜后，以大鼠的RAS各組分特異性抗體，抗GADPH抗體等檢測蛋白表達(dá)。

1.2.7 RT-PCR ?取每組6只動(dòng)物心臟組織100 mg，將組織液氮中研磨成粉末，加入1 mL TRIzol試劑，氯仿抽提和乙醇沉淀方法準(zhǔn)備總RNA。檢測RNA樣本在260 nm和280 nm處的吸光度。在AMV逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以20 μg總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，總反應(yīng)體系為25 μL，所得cDNA于-20℃凍存。待測樣品均作復(fù)管，每次實(shí)驗(yàn)均以不加模板的PCR體系作為陰性對照。反應(yīng)條件為：94℃，5 min（熱啟動(dòng)），94℃，30 s（變性），65℃，30 s（退火），72℃，30 s（延伸），40個(gè)循環(huán)。結(jié)果用MJ Opticom monitor軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)比較

2K1C-OVX組SBP明顯低于2K1C-F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。各組間DBP、左心室舒張末期壓（LVEDP）、室內(nèi)壓最大上升速率（+dp/dtmax）比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）;2K1C-OVX組-dp/dtmax明顯高于2K1C-F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 各組心臟組織中ACE1、ACE2、AT1a、AT1b的mRNA的表達(dá)

2K1C-OVX組ACE1的mRNA表達(dá)量高于2K1C-F組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）;2K1C-M組ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，而ACE2的mRNA表達(dá)量低于2K1C-F組和2K1C-OVX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見表2。

2.3 各組心臟組織ACE1、ACE2及AT1的蛋白表達(dá)比較

2K1C-M組的AT1蛋白表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，而ACE2蛋白表達(dá)量低于2K1C-F組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）。見圖1。

3 討論

腎血管性高血壓是腎動(dòng)脈狹窄引起的腎實(shí)質(zhì)缺血所致的高血壓。常用2K1C大鼠作為該疾病的動(dòng)物模型，該模型形成高血壓的因素與其他高血壓動(dòng)物模型比較，影響因素較單一，可用來研究性激素體內(nèi)RAS系統(tǒng)激活的影響。近期研究發(fā)現(xiàn)心臟、腎臟、血管等組織器官也有獨(dú)立的RAS[12-15]，局部RAS在組織損傷和修復(fù)過程中起著重要作用[16-18]。

已有研究表明，高血壓具有性別差異，絕經(jīng)后女性血壓高于同齡男性患者，本研究顯示2K1C-F組的SBP高于2K1C-OVX組，其結(jié)果與前期試驗(yàn)結(jié)果相同[19]，關(guān)于性別與心臟局部RAS各組分的表達(dá)，各個(gè)實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果不盡相同[20]，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，2K1C-M組的ACE1、AT1a、AT1b的mRNA表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，而ACE2的mRNA表達(dá)量低于2K1C-F組和2K1C-OVX組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P < 0.05）;在蛋白表達(dá)方面，2K1C-M組的AT1蛋白表達(dá)量高于2K1C-F組和2K1C-OVX組，與前期研究結(jié)果有所不同[21]，本研究結(jié)果提示RAS各組分的mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期結(jié)果不同，即有關(guān)RAS現(xiàn)有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果不能解釋雌性腎血管性高血壓大鼠血壓水平高于雄性的原因，可能與性別及卵巢切除手術(shù)對內(nèi)源性血管收縮因子和舒張因子的影響有關(guān)。

總之，不同性別腎血管性高血壓大鼠心臟功能及心臟組織腎素-血管緊張素各組分mRNA及蛋白表達(dá)有差別，進(jìn)一步說明心臟組織局部RAS的存在，并且具有性別差異。

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（收稿日期：2019-11-12）