應(yīng)用PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒野毒的研究

張婕　李增奎

摘要[目的]對(duì)豬偽狂犬病毒野毒進(jìn)行檢測(cè)。[方法]根據(jù)已發(fā)表的豬偽狂犬病病毒gE基因核苷酸序列，設(shè)計(jì)合成1對(duì)引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為276 bp，優(yōu)化PCR反應(yīng)條件，建立檢測(cè)PRV野毒的PCR方法。[結(jié)果]利用建立的PCR方法檢測(cè)疑似PRV野毒感染的臨床送檢組織病料34份，陽(yáng)性樣品18份，陽(yáng)性率達(dá)52.94 %（18/34），選取6份陽(yáng)性病料PCR產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列鑒定，測(cè)序結(jié)果表明均為PRV gE基因特異性序列。[結(jié)論]該方法敏感、特異、可靠，可用于PRV野毒感染的快速診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞豬偽狂犬病毒；gE基因；PCR；檢測(cè)

中圖分類號(hào)S852.65+1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）09-02548-02

作者簡(jiǎn)介張婕（1982- ），女，土族，青海大通人，助理獸醫(yī)師，從事畜牧獸醫(yī)研究。

豬偽狂犬?。╬seudorabies，PR）是由豬偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）引起的豬的一種急性、熱性、敗血性傳染病[1-2]。PRV屬皰疹病毒科（Herpesvifidae）a皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae），具有皰疹病毒的典型特征，可引起豬的潛伏感染[3-4]。PRV的潛伏感染并不使感染豬表現(xiàn)臨床癥狀，但可使感染豬終身帶毒并排毒，增加了PR預(yù)防控制的難度，故對(duì)PRV潛伏感染豬的篩查至關(guān)重要[5]。目前，世界各國(guó)廣泛應(yīng)用PRV gE基因缺失疫苗進(jìn)行PR的防控，且歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家應(yīng)用PRV gE基因缺失弱毒疫苗與其配套的鑒別診斷方法已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了PRV的凈化[6]。我國(guó)自20世紀(jì)70年代中期以來(lái)，廣泛使用gE基因缺失弱毒疫苗，其對(duì)PR的防控起到了重要的作用，但同時(shí)也給PRV野毒感染和疫苗接種的鑒別診斷帶來(lái)了較大困難，尤其是2011年以來(lái)我國(guó)多個(gè)使用gE基因缺失弱毒疫苗免疫的規(guī)?；i場(chǎng)出現(xiàn)了PRV野毒的感染與流行[7]，亟待建立可以準(zhǔn)確診斷PRV強(qiáng)毒和疫苗毒敏感、特異的鑒別檢測(cè)方法。鑒于此，筆者根據(jù)PRV gE基因序列設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，經(jīng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立檢測(cè)PRV野毒的PCR方法，實(shí)現(xiàn)PRV野毒感染的快速鑒別診斷，以期為PR的綜合防治提供準(zhǔn)確、可靠的依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對(duì)象。PRV野毒，由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院第一實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2供試病毒。偽狂犬病病毒活疫苗（Bartha-K61株）和豬傳染性胃腸炎病毒（PEDV）豬流行性腹瀉病毒（TGEV）二聯(lián)活疫苗，均購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）弱毒疫苗（CH-1R株）和豬瘟病毒（CSFV）活疫苗（細(xì)胞源），均購(gòu)自普萊柯生物工程股份有限公司產(chǎn)品；疑似PRV野毒感染豬組織病料，由青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院第一實(shí)驗(yàn)室收集并保存。

1.1.3主要試劑。蛋白酶K、Taq酶和dNTP，均購(gòu)自TaKaRa公司；SDS、苯酚、氯仿和無(wú)水乙醇，均為國(guó)產(chǎn)分析純，市售。

1.2方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成。參照GenBank上的PRV gE基因序列，應(yīng)用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為276 bp，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列如下：F1：5′ GAGATGGGCATCGGCGATTAC 3′；R1：5′ GGGCGAGAAGAGCTGCGAGTG 3′。

1.2.2病毒DNA的提取。采用SDS蛋白酶K法提取PRV病毒基因組DNA，取病毒液500 μl，加SDS溶液至終濃度為1%和蛋白酶K至終濃度為200 μg/ml，56 ℃水浴1 h，加入等體積的酚-氯仿混合溶液，離心，取上清加入2倍體積無(wú)水乙醇沉淀病毒DNA，用75%乙醇洗滌后，加滅菌水溶解，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3影響PCR反應(yīng)的幾個(gè)重要參數(shù)的優(yōu)化。在保持相同的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下，引物F1、R1（20 μmol/L）分別加入0.1、0.5、1.0和1.5 μl；DNA分別加入2、4、6和8 μl；退火溫度分別選擇58、60、62、64和66 ℃；經(jīng)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化分別確定PCR反應(yīng)的最佳DNA用量、引物用量、退火溫度。

1.2.4特異性試驗(yàn)。用優(yōu)化確定的PCR反應(yīng)條件分別檢測(cè)PRV野毒、PRV疫苗毒的DNA以及PEDV、TGEV、PRRSV、CSFV的cDNA，核酸電泳鑒定PCR反應(yīng)的特異性。

1.2.5靈敏性試驗(yàn)。將提取的PRV DNA定量，適當(dāng)稀釋，使其含量分別為1.0、0.1、1.0×10-5、1.0×10-6 和1.0×10-7 μg，用優(yōu)化確定的PCR反應(yīng)條件分別對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，核酸電泳鑒定PCR反應(yīng)的敏感度。

1.2.6重復(fù)性試驗(yàn)。分別選取PRV野毒、PRV疫苗毒、3份PRV野毒感染陽(yáng)性病料、3份陰性病料，重復(fù)檢測(cè)3次，核酸電泳鑒定PCR反應(yīng)的重復(fù)性。

1.2.7初步應(yīng)用-臨床病料的檢測(cè)。利用建立的PCR方法檢測(cè)疑似PRV野毒感染的臨床送檢組織病料34份，核酸電泳鑒定檢測(cè)方法的臨床適用性。

2結(jié)果與分析

3討論

目前，豬偽狂犬病在我國(guó)流行廣泛，要想逐步控制和消滅該病，在使用弱毒疫苗免疫的同時(shí)，還要逐步排查與及時(shí)淘汰野毒感染豬，逐步實(shí)現(xiàn)PRV的凈化。近年來(lái)，隨著對(duì)PRV研究的不斷深入，研究學(xué)者已建立了多種鑒別PRV強(qiáng)毒感染與弱毒疫苗的方法，如唐勇等[8]、陽(yáng)愛國(guó)等[9]、白靜等[10]分別建立了鑒別診斷PRV野毒抗體的gELAT、gEELISA、gEGICA血清學(xué)方法，這些針對(duì)gE抗體的血清學(xué)方法雖然能有效區(qū)分野毒感染抗體和疫苗免疫抗體，但病毒感染的早期和潛伏感染期并不產(chǎn)生抗體，故無(wú)法做到早發(fā)現(xiàn)、早淘汰。田云等[11]建立了鑒別PRV野毒株的熒光定量PCR檢測(cè)方法，但需熒光定量PCR儀等昂貴儀器，且檢測(cè)成本較高，操作較復(fù)雜，目前只應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。有待于尋找一種更廉價(jià)的、操作簡(jiǎn)單、且能夠檢測(cè)出病毒早期感染和潛伏感染，適合基層應(yīng)用的臨床診斷方法。PCR方法作為簡(jiǎn)單、常用的分子生物學(xué)診斷技術(shù)，具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、敏感性高和快速高效等優(yōu)點(diǎn)。故研究將PCR技術(shù)引入到PRV野毒感染的檢測(cè)中，建立了檢測(cè)PRV野毒的PCR方法。該方法可有效區(qū)分PRV野毒和疫苗毒，檢測(cè)PRV疫苗毒、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV均為陰性，可以檢測(cè)到10 pg PRV野毒DNA，具有靈敏、特異、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可望用于臨床上PRV野毒感染的快速檢測(cè)，以及PRV野毒和疫苗毒的鑒別診斷，對(duì)我國(guó)PR的凈化將起到一定的促進(jìn)作用。

參考文獻(xiàn)

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