高效凝膠過濾色譜法測定菊糖聚合度

李玲玉，李雨晨，左兆河，田寶蘭，鄭振佳*

(1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院 山東省高校食品加工技術(shù)與質(zhì)量控制重點實驗室, 山東 泰安 271018；2. 山東醫(yī)藥技師學(xué)院，山東 泰安 271000；3. 山東植益源健康科技有限公司，山東 泰安 271000)

菊糖(inulin)是一種直鏈結(jié)構(gòu)多糖，由D-呋喃果糖經(jīng)β(2→1)糖苷鍵聚合而成，其還原端末端帶有一分子葡萄糖，聚合度在2～60[1]。菊糖廣泛分布于植物、微生物和真菌中，其中菊科和桔?？浦参镏泻坑葹樨S富[2-4]。菊糖具有降血糖、降血脂、調(diào)節(jié)腸道菌群、抗癌等多種生理活性，同時也可作為天然質(zhì)構(gòu)劑應(yīng)用于生產(chǎn)巧克力、奶酪、肉餡、面條等多種食品及菊糖系列保健品等諸多領(lǐng)域[5-9]。研究發(fā)現(xiàn)菊糖的生理活性和加工特性與菊糖聚合度密切相關(guān)。例如，Padalino等[10]發(fā)現(xiàn)與低聚合度的菊粉相比，在意大利面中添加高聚合度菊粉后，面條的總膳食纖維顯著增加，有效碳水化合物和淀粉消化率含量降低；Luo等[11]發(fā)現(xiàn)高、中、低三種聚合度的菊粉均可以延緩淀粉的老化，但低聚合度菊粉效果最好。然而植物來源、收獲季節(jié)、氣候、土壤以及生產(chǎn)加工過程等各個因素均會對聚合度產(chǎn)生影響[12]。高效凝膠色譜法是利用凝膠粒徑來排阻特定大小分子的方法，按照樣品的分子量大小對其分級，大分子通過凝膠柱時被完全排阻在填料網(wǎng)孔之外先流出，小分子則穿過填料網(wǎng)孔溶劑中后流出[13]。該方法具有高效、快速、靈敏度高等特點，目前常被用于研究多聚合物的相對分子量及分布的測定，逐漸應(yīng)用于多糖、蛋白和樹脂等多種聚合物中[14]。

本文建立了一套高效凝膠過濾色譜測定相對分子量的方法，將系列不同分子量的葡聚糖樣品配制后，進入高效凝膠色譜系統(tǒng)，將測得的響應(yīng)值和出峰時間的譜圖用GPC軟件處理，繪制分子量和出峰時間關(guān)系曲線，并且利用該方法對菊苣、菊芋和牛蒡三種批次農(nóng)產(chǎn)品提取的菊糖分子量進行檢測。本研究為天然菊糖活性研究及菊糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)與市場開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本島津公司)，配有四元泵、示差檢測器(refraction index detector-10A，RID-10A)、柱溫箱、自動進樣器等；SCIENTZ-12N冷凍干燥機(寧波新芝生物科技有限公司)；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

OHpak SB-802.5 HQ色譜柱(8 mm×300 mm，6 μm，日本Shodex公司)。

葡聚糖(342 D、1000 D，2000 D，5000 D，6000 D，試劑純，上海源葉生物公司)；無水乙醇、苯酚、正丁醇、硝酸鈉、氯仿等(分析純，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司)；濃硫酸(優(yōu)級純，濟南試劑總廠)；果糖(優(yōu)級純，北京索萊寶科技有限公司)；實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 實驗材料

菊芋、菊苣和牛蒡的干切片，分別編號為a、b、c，其中菊芋a-1、a-2和a-3產(chǎn)地分別為江蘇徐州、河北衡水和福建寧化；菊苣b-1、b-2和b-3產(chǎn)地均為吉林長白山；牛蒡c-1、c-2和c-3分別為江蘇徐州的白肌、柳川理想和山東臨沂的黑皮牛蒡。

2 方法與結(jié)果

2.1 菊糖樣品制備

2.2 菊糖質(zhì)量分數(shù)的測定

以果糖為標(biāo)準(zhǔn)對照糖，采用苯酚-硫酸法測定樣品中多糖質(zhì)量分數(shù)[17-19]。以果糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度OD490nm為縱坐標(biāo)，繪制果糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=0.007 4X-0.002 3,R2=0.999 4，糖濃度在20～100 μg/mL時與吸光度具有良好的線性關(guān)系。

2.3 分子量的測定

參照李琬聰?shù)萚20]和Chen等[21]的方法測定菊糖分子量。

2.3.1 高效液相色譜條件

色譜柱：凝膠色譜柱OHpak SB-802.5 HQ (8 mm×300 mm，6 μm)；示差折光檢測器：RID-10A；進樣量：20 μL；柱溫：30 ℃；流動相0.3 mol/L硝酸鈉溶液和水，以0.3 mL/min的流速對菊糖樣品c-1進行分析，液相色譜圖見圖1。

圖1 c-1樣品高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of c-1

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的擬合

本研究考察了一次方程到五次方程的擬合形式，用標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為衡量標(biāo)準(zhǔn)。依據(jù)2.3.1高效液相色譜條件進樣，分別配制5.0 mg/mL的葡聚糖(分子量為6000 D、4000 D、2000 D、1000 D和342 D)，并用0.22 μm的水系濾頭過濾，擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=-0.001 718 157X3+0.1 504 561X2-4.498 484X+48.71 874，R2=0.999 9，見圖2。

圖2 不同分子量糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of dextran with different molecular weights

2.3.3 菊糖聚合度測定

將樣品配制為5.0 mg/mL，使用0.22 μm的水系濾頭過濾。按照標(biāo)準(zhǔn)樣品的條件進樣，獲得樣品的出峰時間和強度分布圖，將該結(jié)果帶入GPC軟件擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中計算菊糖相對分子質(zhì)量，進而檢測菊糖聚合度。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 準(zhǔn)確性

取葡聚糖對照品(342 D、2000 D和6000 D)各3份，按照1.3.3的處理方法，重復(fù)進樣3次，將GPC軟件計算得到的相對分子質(zhì)量與已知標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量的葡聚糖為對照，利用相對誤差衡量標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確度。將保留時間帶入GPC軟件擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可得葡聚糖對照品(342 D)的相對分子量分別為342 D、343 D和344 D，相對誤差分別為0、0.29%和0.58%；葡聚糖對照品(2000 D)的分子量分別為1989 D、1993 D和2003 D，相對誤差分別為0.55%、0.35%和0.15%；葡聚糖對照品(6000 D)的分子量分別為5972 D、6013 D和6044 D，相對誤差分別為0.47%、0.22%和0.73%，說明該葡聚糖對照品準(zhǔn)確度較好。

2.4.2 重復(fù)性

取多糖樣品(a-1、b-2和c-3)各3份，按照1.3.3的處理方法，重復(fù)進樣3次，將測得的3組菊糖保留時間代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算三種樣品重均分子量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。根據(jù)GPC軟件計算得到多糖樣品的重均分子量。其中a-1的相對分子量為1762 D、1786 D和1791 D，平均值為1 780 D，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.87%；b-2為3992 D、4000 D和3996 D，平均值為3996 D，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.01%；c-3為2290 D、2296 D和2294 D，平均值為2293 D，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.13%，說明重復(fù)性良好。

2.5 數(shù)據(jù)處理

本實驗采用GPC軟件計算多糖的平均分子量Mw，重復(fù)3次，并按照公式(Mw=162 DP+18)[22]，計算菊糖聚合度。利用Excel 2016 和Origin 9.0進行數(shù)據(jù)處理。

采用建立的測定方法分別分析了9批植物樣品的多糖質(zhì)量分數(shù)和相對分子量，并計算得到9批樣品的聚合度，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，本次選取的9個樣品的菊糖聚合度在10～29，不同品種，同一品種不同批次菊糖聚合度均有不同程度的差異。

表1 菊糖聚合度及多糖質(zhì)量分數(shù)Table 1 Inulin polysaccharide content and polymerization degree

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

3.1.1 流動相的選擇

從圖1中 c-1樣品分子量液相圖可以看出，以0.3 mol/L硝酸鈉溶液(a)和純水作流動相(b)出峰時間和響應(yīng)值差別不大，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在10%以內(nèi)(相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為9.41%)，但前者作流動相測定菊糖分子量基線更為平穩(wěn)，后者會出現(xiàn)基線漂移，因此該方法選用0.3 mol/L硝酸鈉溶液為流動相。

3.1.2 流速的選擇

菊糖分析過程可通過降低流速實現(xiàn)提高分離效果的目的，同時流速的降低也會使峰寬增大造成保留時間變長[23]。該色譜柱在鹽濃度0.2～0.5 mol/L時，置換流量為0.3 mL/min，該流速下目標(biāo)組分分離效果較好，因此選擇0.3 mL/min的流速為分析流速。

3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合形式的選擇

分別考察了一次到五次方程擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果顯示三次方程擬合的標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度最好，滿足分析要求，相關(guān)系數(shù)R2>0.999，其他冪次擬合的方程R2值低于0.98，可行性低于三次方程擬合，因此選擇三次方程擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3.2 結(jié)論

本研究建立了一套菊糖分子量的檢測方法，其中色譜柱為OHpak SB-802.5 HQ，進樣量為20 μL，溫度30℃，流動相為0.3 mol/L硝酸鈉溶液，流速為0.3 mL/min，利用GPC 軟件繪制三次標(biāo)準(zhǔn)曲線及計算分子量。本研究從3種菊科植物3個批次提取的菊糖分子量檢測結(jié)果看，9個樣品聚合度有不同程度的差異，不同品種及同一品種不同批次即使在提取條件完全相同時菊糖的聚合度也會不同，同時本研究建立的方法的相對誤差和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別控制在0.73%和0.87%，準(zhǔn)確性和重復(fù)性較好。該方法可以直接應(yīng)用到菊糖實際生產(chǎn)中，為后期功能性菊糖的開發(fā)及品質(zhì)控制、食品工業(yè)上菊糖作為添加劑的篩選、不同產(chǎn)地或不同品種菊科植物產(chǎn)品的開發(fā)、不同儲藏期菊糖分子量的研究等提供新思路。