末水壇紫菜蛋白源抗氧化肽的制備、分離純化與體外抗氧化活性

胡 曉，于 嬌,2，陳勝軍,*，楊賢慶，李來好，吳燕燕

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品加工重點實驗室，廣東 廣州 510300；2.上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

壇紫菜（Porphyra haitanensis），隸屬紅藻門（Rhodophyta）、原紅藻綱（Rhodophyceae）、紅毛菜目（Porphyridiales）、紅毛菜科（Porphyridiaceae）、紫菜屬（Porphyra）[1]，其主要分布在福建、浙江和廣東沿岸，生長于沿海潮間帶中高潮區(qū)的巖礁或筏架上，是我國特有的大型經(jīng)濟海藻之一[2-3]。中國是世界紫菜的主要生產(chǎn)國和出口國，2018年其養(yǎng)殖面積達(dá)7.62萬 公頃，年產(chǎn)量高達(dá)20.17萬 t[4]，具有巨大的碳匯潛力[5]和經(jīng)濟開發(fā)價值。我國紫菜品種包括壇紫菜、條斑紫菜、甘紫菜等，其中壇紫菜是主要養(yǎng)殖種類，占我國紫菜總產(chǎn)量的50%以上[2]。紫菜的采收期一般分為4～5 次，即頭水、二水、三水、四水紫菜和末水紫菜，營養(yǎng)品質(zhì)和市場價格隨著采收期的變化逐漸降低[6]，其中末水紫菜價格低廉，大多養(yǎng)殖戶不予采收。末水紫菜作為一種高蛋白的海洋生物資源，其經(jīng)濟效益有待開發(fā)。

紫菜具有高蛋白、低脂肪的特點，其蛋白質(zhì)含量為25%～50%（以干質(zhì)量計），是制備生物活性肽的理想蛋白源[7]。研究表明，紫菜多肽具有降血壓[8]、抗氧化[9]、降血脂[10]、抗腫瘤[2]、抗菌[11]等生理功能，在食品、藥品、化妝品等領(lǐng)域具有升值空間和推廣價值。何榮海等[12]通過對條斑紫菜蛋白酶解獲得了血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制肽，對原發(fā)性高血壓大鼠灌胃后有顯著降血壓效果。姚興存等[13]使用木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶水解條斑紫菜蛋白制備抗氧化肽，其對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基具有一定的清除能力。

自由基不僅與食品腐敗變質(zhì)有關(guān)，還與人體衰老、氧化應(yīng)激引發(fā)的各類疾病有關(guān)，如冠心病、糖尿病、高血壓、高血脂、腦血栓等慢性疾病[14-15]。研究表明，抗氧化劑既能阻止食品脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的形成，還能預(yù)防或減輕人體氧化應(yīng)激引發(fā)的各類疾病[16]。由于人工合成抗氧化劑存在致畸、致癌和致突變的安全性問題，使得人工合成抗氧化劑的應(yīng)用和推廣受到限制。因此，人們致力于制備天然、無毒的抗氧化劑以取代人工合成抗氧化劑[17-18]。其中，抗氧化肽可作為抗氧化劑應(yīng)用于功能性食品、蛋白質(zhì)補充劑和藥劑的生產(chǎn)制備[19]。本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化末水壇紫菜蛋白的酶解工藝，并對酶解產(chǎn)物進行分離純化，同時以自由基清除活性與H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型對末水壇紫菜抗氧化肽活性予以評價，旨在為末水壇紫菜的精深加工與開發(fā)利用提供理論依據(jù)及參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

末水壇紫菜樣品由汕頭市澄海區(qū)培隆紫菜養(yǎng)殖區(qū)提供，末水壇紫菜蛋白粉由中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所自制，蛋白純度為75%。

酸性蛋白酶（5 0 0 0 0 U/g）、胃蛋白酶（3 000 000 U/g）、中性蛋白酶（100 000 U/g）、木瓜蛋白酶（200 000 U/g）、堿性蛋白酶（200 000 U/g）、胰蛋白酶（250 000 U/g） 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司；抑肽酶（6 511.83 Da）、細(xì)胞色素C（12 400 Da）上海麥克林生化科技有限公司；L-氧化型谷胱甘肽（612.63 Da） 美國Sigma公司；還原性谷胱甘肽（307.3 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da） 廣州齊云生物技術(shù)有限公司；葡萄糖凝膠（Sephadex）G-15 北京酷爾化學(xué)科技有限公司；HepG2人肝癌細(xì)胞系 廣州燁善生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、丙二醛試劑盒 碧云天生物技術(shù)研究所；三氟乙酸、乙腈均為色譜純，其他試劑為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3K30臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；TDZ4-WS臺式低速離心機 上海盧湘儀離心機儀器公司；Delta320精密pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）公司；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；MILLI-Q超純水機 美國Millipore公司；倒置顯微鏡 上海光密儀器有限公司；電熱壓力蒸汽滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠；THZ-82型恒溫水浴振蕩箱 常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司；Alpha1-4冷凍干燥機 德國Christ公司；全自動酶標(biāo)儀 美國BioTek公司。

1.3 方法

1.3.1 末水壇紫菜蛋白酶解工藝流程

末水壇紫菜蛋白→酶解→滅酶→離心→酶解液→透析→冷凍干燥→粗多肽

1.3.2 末水壇紫菜蛋白水解蛋白酶的選擇

取1.0 g末水壇紫菜蛋白，加入50 mL蒸餾水充分混合，調(diào)節(jié)最適pH值，以4 000 U/g的加酶量分別加入酸性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶，調(diào)節(jié)溫度至最適溫度，水解4 h后95 ℃滅酶10 min，離心取上清液，測定水解度。不同蛋白酶水解實驗條件見表1。

表1 不同蛋白酶水解實驗條件Table 1 Hydrolysis conditions of different proteases

1.3.3 酸性蛋白酶水解末水壇紫菜蛋白響應(yīng)面試驗設(shè)計

本實驗在水解時間4 h條件下，分別考察底物質(zhì)量濃度、加酶量、pH值和溫度對末水壇紫菜蛋白水解度的影響，確定水解條件的最適范圍。依據(jù)Design-Expert 8.0.5軟件，采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗優(yōu)化顯著影響水解度的因素。根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以加酶量、pH值、溫度3 個關(guān)鍵因素為自變量，以1、0、－1分別代表自變量的高、中、低水平，共設(shè)立17 個處理組。響應(yīng)面試驗因素與水平見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 2 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.4 末水壇紫菜蛋白水解度與酶解產(chǎn)物抗氧化活性關(guān)系

在最佳工藝條件下，將末水壇紫菜蛋白分別用酸性蛋白酶水解2、4、6、8、10 h，離心取上清液，測定水解度；取酶解液于100 Da的透析袋中透析24 h脫鹽，冷凍干燥24 h即得到粗多肽，測定酶解產(chǎn)物的抗氧化活性。通過水解時間的調(diào)節(jié)以控制水解度，探討水解度與抗氧化活性的關(guān)系。

1.3.5 末水壇紫菜蛋白水解度的測定

原料總氮含量采用凱氏定氮法測定；酶解液中氨基酸態(tài)氮含量采用甲醛電位滴定法[20-21]測定。蛋白質(zhì)水解度的計算見式（1）：

式中：DH為蛋白質(zhì)水溶解度/%；m1為酶解液中的氨態(tài)氮含量/mg；m2為原料總氮含量/mg。

1.3.6 酶解產(chǎn)物抗氧化活性的測定

參照Chi Changfeng[22]、王海鳳[23]等的方法測定DPPH自由基清除率。取0.1 g酶解物凍干粉溶解于不同體積的超純水中，配成不同濃度多肽溶液；取1 mL多肽溶液加入1 mL 0.20 mmol/L的DPPH溶液（用95%乙醇溶液配置），混勻后在室溫條件下避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長處測定吸光度As；空白組為1 mL 95%乙醇溶液代替DPPH溶液，加入1 mL樣液混合，測定吸光度Ab；對照組為1 mL DPPH溶液，加入95%乙醇溶液混合，測定吸光度A0。DPPH自由基清除率按式（2）計算：

參照Ajibola等[24]的方法測定羥自由基清除率。取0.3 mL 5 mmol/L鄰氮二菲的無水乙醇溶液，加入0.2 mL 0.15 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）和0.3 mL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液，加入質(zhì)量濃度為2 mg/mL的多肽溶液混勻，加入0.2 mL體積分?jǐn)?shù)為0.1% H2O2溶液搖勻，37 ℃條件下水浴加熱60 min，在510 nm波長處測定吸光度As；以去離子水代替樣品和H2O2溶液重復(fù)上述操作，在510 nm波長處測定吸光度Ab；以去離子水代替樣品重復(fù)上述操作，在510 nm波長處測定吸光度A0。羥自由基清除率按式（3）計算：

1.3.7 末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量測定

參照朱曉連等[25]的方法，并略作修改。采用高效體積排阻色譜法，測定酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布。色譜柱為TSK-GELG2000SWXL（7.8 mm×300 mm），流動相為0.1%三氟乙酸的乙腈和0.1%三氟乙酸的雙蒸水，檢測波長為214 nm，進樣體積為10 μL，流速為0.5 mL/min，全部洗脫時長為60 min。將還原性谷胱甘肽（307.3 Da）、L-氧化型谷胱甘肽（612.63 Da）、桿菌肽（1 422.69 Da）、抑肽酶（6 511.83 Da）、細(xì)胞色素C（12 400 Da）用流動相溶解并配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.8 凝膠色譜層析

酶解產(chǎn)物冷凍干燥后，將多肽溶于去離子水中，制備質(zhì)量濃度為25 mg/mL的溶液，過0.22 μm的微孔濾膜后備用。采用紫外檢測儀在214 nm波長處檢測，根據(jù)電腦軟件記錄數(shù)據(jù)作圖。經(jīng)過多次對層析條件的分析，確定最佳層析條件：上樣量2 mL，洗脫液為去離子水，洗脫溫度為室溫，流速0.6 mL/min。收集并濃縮各洗脫峰，冷凍干燥24 h。使用完畢后，用至少2 倍柱體積的去離子水平衡色譜柱，洗脫至基線平穩(wěn)。以DPPH自由基清除率、羥自由基清除率為指標(biāo)測定不同洗脫峰的抗氧化活性。

1.3.9 細(xì)胞實驗

1.3.9.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將液氮罐中的HepG2細(xì)胞取出，置于37 ℃的溫水浴中解凍，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到25 cm2組織培養(yǎng)瓶，加入12 mL DMEM高糖培養(yǎng)基（含有10% FBS、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素），混勻后1 500 r/min低速離心5 min。置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5% CO2），每隔2 d更換一次培養(yǎng)基。

1.3.9.2 細(xì)胞模型的建立

在一般的藥物篩選實驗中，通常選擇存活率為50%至70%的誘導(dǎo)濃度作為最佳濃度，考慮到細(xì)胞存活率過低，細(xì)胞易受誘導(dǎo)物過度損傷，不利于細(xì)胞的后期修復(fù)作用，因此存活率為60%左右較為合適。經(jīng)前期研究，采用不同濃度（50、100、200、400、600、800 μmol/L）的H2O2溶液對HepG2細(xì)胞處理4 h，以細(xì)胞存活率為指標(biāo)，得到存活率為60%的最適誘導(dǎo)條件為：H2O2誘導(dǎo)濃度259 μmol/L，誘導(dǎo)時間4 h。其中，細(xì)胞存活率的測定采用MTT法。

1.3.9.3 末水壇紫菜抗氧化肽（Porphyra haitanensisantioxidant peptide，PHAP）對H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷的影響

細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁穩(wěn)定，PHAP處理24 h后，再用誘導(dǎo)濃度為259 μmol/L的H2O2溶液誘導(dǎo)4 h，即為治療組1；GSH處理24 h后，再用誘導(dǎo)濃度為259 μmol/L的H2O2溶液誘導(dǎo)4 h，即為治療組2；檢測治療組中HepG2細(xì)胞的存活率、SOD活性和MDA濃度。

表3 實驗設(shè)計Table 3 Experimental grouping

1.3.9.4 細(xì)胞活力、SOD活性和MDA濃度的測定

將對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞以1×105每孔接種到96 孔板中，在含有5% CO2的濕式培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，向各孔中加入20 μL 5 mg/mL噻唑基MTT溶液，在37 ℃下培養(yǎng)4 h，含有5% CO2的培養(yǎng)箱，在小心地丟棄孔中的上清液后，向每個孔中加入200 μL DMSO二甲基亞磺酸，并在微孔板振蕩器上振蕩15 min，在酶標(biāo)儀波長為490 nm處檢測其吸光度，并根據(jù)吸光度計算出細(xì)胞存活率。SOD活性和MDA濃度的測定參考SOD試劑盒、丙二醛試劑盒說明書進行。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所得數(shù)據(jù)為3 次平行實驗的平均值，單因素試驗結(jié)果采用SPSS 20.0軟件進行顯著性差異（P＜0.05）分析，采用Design-Expert 8.0.5軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計分析，并采用OriginPro 8作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 末水壇紫菜蛋白水解酶選擇

圖1 不同種類蛋白酶對壇紫菜蛋白的水解度的影響Fig. 1 Effect of different proteases on the DH of P. haitanensis protein

由圖1可知，酸性蛋白酶的對末水壇紫菜蛋白的水解度最高，其次分別是中性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胃蛋白酶，這表明酸性蛋白酶對末水壇紫菜蛋白的水解更充分。

2.2 單因素試驗結(jié)果

影響蛋白酶解的因素主要包括酶的種類、加酶量、酶解時間、pH值、溫度、底物質(zhì)量濃度等。實驗以水解度為指標(biāo)，分別考察底物質(zhì)量濃度、加酶量、pH值、溫度對水解度的影響。由圖2可知，隨著底物質(zhì)量濃度的增加，水解度呈現(xiàn)先快速上升后又趨于平緩的趨勢，在底物質(zhì)量濃度為2 g/100 mL時水解度達(dá)到最大，繼續(xù)增大底物質(zhì)量濃度其水解度并無顯著變化，這可能是由于較低的底物質(zhì)量濃度會影響酶與底物分子的結(jié)合。另一方面，較高的底物質(zhì)量濃度會引起底物抑制和酶失活現(xiàn)象[26]，因此底物質(zhì)量濃度選擇2 g/100 mL較為合適。隨著加酶量的增加，末水壇紫菜蛋白水解度不斷上升，當(dāng)加酶量達(dá)到5 000 U/g時，水解度達(dá)到最大，但其增長速率減小，加酶量過多可能降低酶與底物的傳質(zhì)效率，降低反應(yīng)效率。同時在一定酶活力條件下，過高的加酶量不僅增加了生產(chǎn)成本，還增加了酶解產(chǎn)物中雜質(zhì)的含量，對后續(xù)的活性測定有一定的干擾作用，因此選擇加酶量為4 000 U/g較為合適。隨著pH值的升高，末水壇紫菜蛋白水解度呈現(xiàn)迅速增大后下降的趨勢，在pH 3.0時水解度達(dá)到最大，這與酸性蛋白酶的最適pH值范圍2.5～5.0相符合，因此pH值選擇3.0較為合適。隨著溫度的升高，末水壇紫菜蛋白水解度呈現(xiàn)先增大后又下降的趨勢，在55 ℃時水解度達(dá)到最大。溫度過低會影響酶和底物分子在溶液中的擴散，溫度過高會引起酶分子的結(jié)構(gòu)變化，從而使酶部分失活[27]，因此溫度選擇55 ℃較合適。

圖2 底物質(zhì)量濃度（A）、加酶量（B）、pH值（C）和溫度（DD）對末水壇紫菜蛋白水解度的影響Fig. 2 Effects of substrate concentration (A), enzyme to substrate ratio (B),pH (C) and temperature (D) on the DH of P. haitanensis protein

2.3 響應(yīng)面分析

2.3.1 數(shù)學(xué)模型的建立與顯著性分析

經(jīng)Design-Expert 8.0.5.0軟件對表4結(jié)果進行分析，得到末水紫菜蛋白水解度的二次回歸模型：Y/%=10.57+0.48A+2.35B－0.83C－0.29AB－0.32AC+0.26BC－0.68A2－1.67B2－2.87C2。

末水紫菜蛋白水解度的方差分析和顯著性分析見表5。末水紫菜蛋白水解度模型P＜0.000 1，失擬項P=0.0849＞0.05，表明該回歸模型極顯著；模型表明回歸模型與試驗結(jié)果的擬合度高，可用于末水紫菜蛋白水解度的分析和預(yù)測。一次項系數(shù)A、B、C和二次項系數(shù)A2、B2、C2的P＜0.05，表明這些因素對末水紫菜蛋白水解度的影響顯著。由A、B、C的F值大小可以推斷出，3 個因素對末水紫菜蛋白水解度影響主次順序為B＞C＞A。

表4 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果Table 4 Experimental design and corresponding results for respond surface analysis

表5 回歸方程的方差分析Table 5 Analysis of variance for the fitted regression model

2.3.2 交互作用的響應(yīng)面和等高線圖

經(jīng)過Design-Expert 8.0.5軟件處理，得到加酶量、pH值、溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖。如圖3所示，加酶量和pH值（AB）、加酶量和溫度（AC）、pH值和溫度（BC）交互作用對末水紫菜蛋白水解度的影響顯著，與顯著性分析結(jié)果相符。

根據(jù)所得到的響應(yīng)面模型，經(jīng)Design-Expert 8.0.5軟件處理得到最優(yōu)工藝為加酶量4 239.64 U/g、pH 3.67、溫度54.36 ℃，在此條件下末水紫菜蛋白水解度為11.47%?？紤]到實際可操作性，調(diào)整工藝參數(shù)為加酶量4 240 U/g、pH 3.7、溫度54 ℃，在此條件下進行3 組驗證實驗，末水紫菜蛋白水解度為11.44%、11.35%、11.42%，取平均值為11.40%，與理論值較為接近，表明響應(yīng)面模型對優(yōu)化末水紫菜蛋白水解度的制備工藝可行。

圖3 加酶量、pH值和溫度交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig. 3 Response surface and contour plots indicating the interactive effects of three hydrolysis parameters on DH

2.4 末水紫菜蛋白水解度與抗氧化活性的關(guān)系

圖4 酶解產(chǎn)物水解度與抗氧化活性的關(guān)系Fig. 4 Relationship between DH and antioxidant activities of hydrolysates

由圖4可知，隨著水解時間的延長，水解度呈現(xiàn)出逐漸升高的趨勢，但其升高速率逐漸降低，當(dāng)水解時間為10 h時，水解度最高為14.89%。隨著水解度的逐漸升高，末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物對DPPH自由基清除率均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。水解時間為4 h，水解度為11.40%時，酶解產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性達(dá)到最大值，其半抑制率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.68 mg/mL；隨著酶解時間持續(xù)延長，具有抗氧化活性的肽段被降解為分子質(zhì)量更小的片段，導(dǎo)致DPPH自由基清除率下降。Zhuang Yongliang等[28]從水母酶解產(chǎn)物中分離出3 種分子質(zhì)量分別為＜2 kDa、2～6 kDa和6～10 kDa的多肽，通過體外抗氧化活性實驗發(fā)現(xiàn)分子質(zhì)量較小的多肽具有較高的還原能力和超氧陰離子自由基清除活性。因此，有待對末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物進行進一步的純化，分離出PHAP，評價其活性。

2.5 末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布

表6 末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布Table 6 Molecular mass distribution of P. haitanensis protein hydrolysates

由表6可知，酶解初期，3～5、5～10 kDa和＞10 kDa的大分子組分占比逐漸下降，而1～3、＜1 kDa的小分子組分占比逐漸上升；酶解后期，3～5、5～10 kDa和＞10 kDa的大分子組分被降解完，1～3 kDa的組分繼續(xù)被降解，因此1～3 kDa的組分占比逐漸下降，而＜1 kDa的組分占比逐漸上升。

2.6 酶解產(chǎn)物的分離純化

凝膠過濾色譜可用于分離水溶性的物質(zhì)，如多糖、蛋白、多肽等化合物，還可用于脫鹽。由于當(dāng)酶解時間為4 h時，末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物中小于1 kDa的小分子肽占比73.46%，因此根據(jù)Sephadex的分子質(zhì)量分離范圍，選擇Sephadex G-15對該酶解產(chǎn)物進行分離純化較為合適。如圖5所示，從Sephadex G-15中主要洗脫出3 個峰組分，分別記為A1、A2和A3，根據(jù)各組分的洗脫時間可知其分子質(zhì)量大小為A1＞A2＞A3。由圖6可知，A3組分的抗氧化活性最高，其質(zhì)量濃度為1 mg/mL時的DPPH自由基清除率為73.32%，羥自由基清除率為30.15%。A3是通過凝膠過濾層析分離出來的分子質(zhì)量相近的小分子肽混合物，將其收集、濃縮、干燥后即得壇紫菜PHAP。目前采用酶解法從水產(chǎn)蛋白制備分離得到的PHAP大多以分子質(zhì)量小于1 000 Da的寡肽為主，Wang Yonggang等[29]從鮭魚中制備分離得到分子質(zhì)量為271.3 Da的PHAP（Pro-Arg），Sampath Kumar等[30]從竹莢魚中制備分離得到分子質(zhì)量為518.5 Da的PHAP（Ala-Cys-Phe-Leu）。此外，還有研究從紅藻蛋白酶解物中分離鑒定出高活性抗氧化寡肽[31]。

圖5 末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物的凝膠色譜圖Fig. 5 Chromatogram of P. haitanensis hydrolysates puri fied on gel filtration column

圖6 末水壇紫菜蛋白酶解產(chǎn)物不同分離組分的DPH自由基和羥自由基清除活性Fig. 6 DPPH and hydroxyl radical scavenging activity of different fractions in P. haitanensis hydrolysates

2.7 細(xì)胞抗氧化活性

2.7.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

圖7 PHAP、GSH對HepG2損傷細(xì)胞形態(tài)的影響Fig. 7 Effects of PHAP and GSH on the morphology of injured HepG2 cells

如圖7所示，通過倒置顯微鏡下觀察模型組中人肝癌HepG2細(xì)胞形態(tài)，與對照組相比，人肝癌HepG2細(xì)胞數(shù)量明顯減少，出現(xiàn)邊緣不清晰，形態(tài)變圓，細(xì)胞黏連等現(xiàn)象，表明H2O2成功誘導(dǎo)了氧化損傷模型。分別采用質(zhì)量濃度為200 μg/mL的PHAP和GSH處理HepG2細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)治療組細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞生長趨于良好，排列緊密，表明PHAP和GSH對HepG2細(xì)胞的氧化損傷具有一定的保護作用。

2.7.2 細(xì)胞活力、SOD活性和MDA濃度的測定結(jié)果

表7 PHAP、GSH對人肝癌HepG2氧化損傷細(xì)胞活力、SOD性和MDA含量的影響Table 7 Effects of PHAP and GSH on cell viability, SOD activity and MDA content in injured HepG2 cells

如表7所示，與模型組對比，治療組1與治療組2的細(xì)胞活力均有提升，表明PHAP和GSH能增強模型組中人肝癌HepG2細(xì)胞活力，同時PHAP提升細(xì)胞活力的效果更為顯著。為進一步探討其作用機理，測定治療組中SOD活性和MDA濃度。由表7可知，模型組的SOD活性為20.82 U/μL，治療組1中SOD活性升至24.19 U/μL，治療組2中SOD活性無明顯增強。與GSH相比，PHAP能顯著增強模型組中人肝癌HepG2細(xì)胞中的SOD活性；模型組的MDA濃度為1.42 μmol/mL，治療組1中MDA濃度降至0.74 μmol/ mL，治療組2中MDA濃度降至0.79 μmol/mL。與GSH相比，PHAP能顯著降低模型組中人肝癌HepG2細(xì)胞中的MDA濃度。

由此可知，PHAP對H2O2氧化損傷后的人肝癌HepG2細(xì)胞具有修復(fù)作用，其既能增強SOD活性，還能降低脂肪氧化產(chǎn)物MDA的含量。

3 結(jié) 論

單因素方差分析結(jié)果表明加酶量、pH值和溫度對末水壇紫菜蛋白水解度的影響具有顯著性，而底物質(zhì)量濃度不具備顯著性。采用Box-Behnken試驗設(shè)計及響應(yīng)面試驗優(yōu)化顯著影響水解度的因素，結(jié)果表明水解時間4 h、底物質(zhì)量濃度2 g/100 mL、加酶量4 240（U/g）、pH 3.7、溫度54 ℃的條件下，水解度最高為11.40%。通過水解時間的調(diào)節(jié)以控制水解度，探討水解度與抗氧化活性的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)當(dāng)水解時間為4 h時，酶解產(chǎn)物的水解度為11.40%，其對DPPH自由基清除活性最強。采用Sephadex G-15對酶解物進行分離純化，發(fā)現(xiàn)組分A3抗氧化活性最高，其1 mg/mL時DPPH自由基清除率為73.32%，羥自由基清除率為30.15%。通過建立H2O2誘導(dǎo)人肝癌HepG2細(xì)胞的氧化應(yīng)激評價模型，發(fā)現(xiàn)末水壇紫菜PHAP能顯著提升HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力，增強其SOD活性，并降低脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量，具有明顯修復(fù)HepG2細(xì)胞氧化損傷的能力，是一種高活性抗氧化肽。