杭白芷根發(fā)育過程中香豆素類成分主要積累部位及含量變化研究

李博園,韓 敏，張明英，陳 瑩

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，陜西 咸陽 712046；2.西安怡康醫(yī)藥連鎖有限公司，陜西 西安 710000)

中藥白芷為傘形科(Umbelliferae)植物[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. ]或杭白芷[Angelicadahurica(Fisch. ex Hoffm. )Benth. et Hook. f. var.formosana(Boiss. )Shan et Yuan]的干燥根，具祛風(fēng)濕，活血排膿，生肌止痛等功效，是一味傳統(tǒng)中藥[1～2]。白芷藥用化學(xué)成分主要有香豆素類、揮發(fā)油類以及黃酮類，其中香豆素類中的歐前胡素及異歐前胡素是白芷質(zhì)量的主要控制成分，具有鎮(zhèn)痛、解痙等作用[3～5]。目前對中藥白芷的研究多集中在藥理和化學(xué)成分[6～8]等方面，景汝勤等人研究了白芷根的組織分化[9]，但對其結(jié)構(gòu)發(fā)育與藥用成分積累關(guān)系研究較少[10]。歐前胡素在紫外波長下呈藍色熒光，具有易溶于乙醇的性質(zhì)[11]。因此，本研究以杭白芷根為研究對象，通過顯微鏡技術(shù)觀察根的解剖結(jié)構(gòu)，結(jié)合組織化學(xué)定位法以及植物化學(xué)方法，研究根中香豆素類藥用成分的分布以及含量變化，旨在為進一步揭示杭白芷根的結(jié)構(gòu)與藥用成分的積累關(guān)系，為評價藥材質(zhì)量提供科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

杭白芷主根于2018年3-10月采自陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥用植物園栽培植株。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片法 選擇不同時期生長正常健康的植株，將主根分割成0.5～1 cm長的小段，50%～70%乙醇FAA固定液固定一周、再進行脫水、包埋，之后切片，切片厚度8 ～10 μm，番紅-固綠復(fù)合染色，中性樹膠封藏，LEICA ICC50 W型顯微鏡觀察并拍照。

1.2.2 組織化學(xué)定位法 取新鮮杭白芷主根中部，切成0.3～5 cm數(shù)個小段。取其中1小段冰凍切片，厚度30 μm，稀甘油封片后置于Leica DMBL熒光顯微鏡下，紫外光激發(fā)，觀察并拍照。陰性對照:取1小段，置于70%乙醇FAA固定液中一周，再依次經(jīng)過85%、95%、100%乙醇處理后，進行冰凍切片，切片厚度30 μm，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。陽性對照：取歐前胡素為陽性對照，配制歐前胡素標準品溶液，將其滴加在載玻片上，制作臨時裝片，于Leica DMBL熒光顯微鏡下觀察并拍照。重復(fù)實驗3次。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計 分別測量不同月份的杭白芷主根直徑，統(tǒng)一測量位置為全長1/2處，再選取相對應(yīng)位置FAA固定，按照“1.2.1”石蠟切片法進行切片染色，之后每個時期選取在同一倍數(shù)下的5個視野，進行分泌道數(shù)量的統(tǒng)計。

1.2.4 植物化學(xué)法 研究采用高效液相色譜法對杭白芷根中歐前胡素、異歐前胡素的含量進行提取測定[12]。

1.2.4.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性實驗。色譜條件：XB-C18分析柱(4.6 mm×250 mm,5μm)；流動相：乙腈-水(65：35)；檢測波長：247 nm，流速：1.0 mL·min，柱溫：30℃。

1.2.4.2 對照品溶液及供試品溶液的制備。精密稱取歐前胡素1 mg，異歐前胡素0.6 mg，加流動相溶解并制成濃度分別為1 μg·mL-1和6μg·mL-1的溶液，作為對照品溶液；取不同時期的杭白芷粉末(過3號篩)各1.000 g，精密稱定后置錐形瓶中，再加流動相40 mL，超聲30 min，靜置至室溫過濾，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，加流動相定容，0.45 μm微孔濾膜過濾作為供試品溶液備用。

1.2.4.3 精密度實驗及穩(wěn)定性實驗。取對照品溶液10 μL，進樣5次，根據(jù)峰面積計算得歐前胡素、異歐前胡素的RSD分別為1.42%和1.05%，儀器精密度良好；取同一供試品溶液，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣，按上述色譜條件測定歐前素及異歐前胡素的峰面積，表明歐前胡素與異歐前胡素在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定再根據(jù)測得的峰面積值計算RSD，RSD分別為1.37%和1.14%。

1.2.4.4 標準曲線的繪制。取對照品溶液，分別稀釋1、3、5、8、10倍，分次進樣，按上述色譜條件測定。結(jié)果歐前胡素在0.055 μg～0.555 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；異歐前胡素在0.033 μg～0.33 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.4.5 樣品含量測定。分別取供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按上述高效液相色譜(HPLC)條件測得峰面積，并計算歐前胡素和異歐前胡素的含量。

1.2.4.6 重復(fù)性及加樣回收率實驗。取9月份杭白芷，照“1.2.4.2”項下方法制備供試品溶液5份，按上述色譜條件測定，歐前胡素、異歐前胡素的平均含量分別為0.097%和0.022%，RSD為0.89%，1.07%，表明該方法重現(xiàn)性良好；取9月份杭白芷粉末(過3號篩)約0.5 g，稱定，分別加入已知濃度的對照品適量，照“1.2.4.2”項下方法制備供試品溶液后，各取10 μL注入液相色譜儀，測定，計算歐前胡素的平均加樣回收率為99.4%，RSD為0.42%；異歐前胡素的平均加樣回收率為98.9%，RSD為0.89%。

2 結(jié)果

2.1 根的結(jié)構(gòu)發(fā)育特征

杭白芷根的次生結(jié)構(gòu)由外向內(nèi)依次包括周皮、形成層、次生韌皮部、次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，1)。次生結(jié)構(gòu)開始形成以后，中柱鞘細胞不斷分裂形成木栓形成層，木栓形成層進一步分裂，向內(nèi)產(chǎn)生栓內(nèi)層細胞，向外產(chǎn)生木栓層細胞，木栓形成層細胞較小且排列緊密，栓內(nèi)層為排列較疏松單層薄壁細胞，木栓層細胞一般由5～8層，呈磚形、排列整齊的細胞構(gòu)成(圖版Ⅰ，2～3)。在木栓形成層形成早期，表皮細胞和初生皮層仍可見，之后隨著周皮的產(chǎn)生和次生維管組織的增加逐漸脫落，周皮由木栓層、木栓形成層和栓內(nèi)層細胞共同組成(圖版Ⅰ，4)。周皮內(nèi)側(cè)為皮層薄壁細胞，其細胞近圓形，排列較疏松，有細胞間隙，皮層內(nèi)可見體積較大的橢圓形分泌道分布，其次向內(nèi)是次生韌皮部(圖版Ⅰ，5)，最內(nèi)側(cè)為次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，6)。次生韌皮部由大量韌皮薄壁細胞和少量的篩管、伴胞組成，次生韌皮部中也可見數(shù)個類橢圓形的分泌道大致呈輪傘狀分布，導(dǎo)管、木纖維、薄壁細胞、木射線等共同組成次生木質(zhì)部(圖版Ⅰ，7)，在次生木質(zhì)部中，有大量的木薄壁組織細胞(圖版Ⅰ，5～7)。維管射線由次生韌皮部橫向發(fā)育出韌皮射線和次生木質(zhì)部的木射線二者共同組成(圖版Ⅰ，8)。

2.2 組織化學(xué)定位

熒光顯微鏡下觀察杭白芷橫切面可以看出，在紫外光激發(fā)下，導(dǎo)管及周皮有熒光現(xiàn)象，香豆素類的積累部位分泌道也有較明顯的熒光出現(xiàn)(圖版Ⅰ，9)，而其他部位無熒光出現(xiàn)，陰性對照除周皮和導(dǎo)管以外，其他部位無熒光，分泌道熒光消失(圖版Ⅰ，10)，歐前胡素標準品的陽性對照中，歐前胡素發(fā)出的熒光與分泌道熒光一致(圖版Ⅰ，11)。

2.3 統(tǒng)計結(jié)果

對不同時期杭白芷主根及根中分泌道進行觀察，并統(tǒng)計了主根直徑大小以及分泌道的數(shù)量。在表1中可以看出，整個發(fā)育過程中，根直徑大小以及分泌道數(shù)量隨著月份逐漸增長，9-10月后增長趨于平穩(wěn)。

表1 杭白芷根直徑大小以及分泌道數(shù)量統(tǒng)計結(jié)果

2.4 含量測定結(jié)果

以歐前胡素、異歐前胡素為評價指標(圖1為對照品HPLC圖，圖2為樣品HPLC圖)，分別測得不同時期杭白芷根中藥用成分的含量。圖3為不同時期杭白芷根中歐前胡素含量積累的動態(tài)過程，可以看出杭白芷根中的歐前胡素含量在3-5月份先緩慢增加后下降至全年最低為0.127%，而后在5-7月逐漸上升，7-8月又出現(xiàn)回落，在8-9月迅速上升，達到全年最高為0.692%，之后又出現(xiàn)下降；圖4為異歐前胡素含量積累的動態(tài)過程，異歐前胡素含量總體相比歐前胡素較低，可以看出3-7月處于上升趨勢，7-8月出現(xiàn)下降，之后再逐漸增加；總含量為歐前胡素和異歐前胡素總和，在圖5總含量的動態(tài)變化中可以看到，基本和歐前胡素變化趨勢一致，在9月份達到全年最高為0.781%。

3 討論

大多數(shù)傘形科植物中普遍存在分泌組織[13]。杭白芷根、莖以及葉中均有分泌道的存在[14～15]，本研究主要觀察了根的解剖結(jié)構(gòu)，次生結(jié)構(gòu)主要由周皮、皮層、次生韌皮部、次生木質(zhì)部所構(gòu)成，在中柱鞘和次生韌皮部中可見分泌道分布其中[10]，中柱鞘薄壁組織中的分泌道體積較大，次生韌皮部中的分泌道較小，大致呈輪傘狀分布，在北柴胡和狹葉柴胡中也有類似的現(xiàn)象[16～17]。在對不同時期根直徑大小以及分泌道數(shù)量的統(tǒng)計結(jié)果中可以看出，隨著根直徑的增長，分泌道數(shù)量也逐漸增加，當根直徑大小趨于穩(wěn)定，分泌道數(shù)量也趨于穩(wěn)定，結(jié)合組織化學(xué)定位結(jié)果，表明分泌道是香豆素類藥用成分積累的主要部位，這與蘭志瓊等在白芷根中香豆素類成分的組織化學(xué)定位研究中表明，香豆素類成分主要分布于分泌組織內(nèi)，結(jié)果基本一致[18～19]，因此分泌道的分布和數(shù)量可以作為評價杭白芷根中藥用成分香豆素類含量的重要指標之一。

進一步通過高效液相色譜法對不同時期杭白芷根中主要藥用成分歐前胡素以及異歐前胡素含量進行測定，結(jié)果表明，在杭白芷根的生長發(fā)育過程中，歐前胡素、異歐前胡素以及總含量呈”S”型曲線增長,在5-7月份歐前胡素和異歐前胡素處于明顯上升期，在7-8月盛花期可能導(dǎo)致地下部分生長緩慢，含量下降，在9月份歐前胡素以及總含量達到全年最高，而在9-10月份分泌道數(shù)量較多，增長趨勢平穩(wěn)，因此進一步說明分泌道與香豆素類藥用成分含量積累呈正相關(guān)，與藥材質(zhì)量關(guān)系緊密。