羅伊氏乳桿菌對腸道環(huán)境影響的實驗教學探索

蔣 敏， 李 恒， 李 會， 史勁松

（江南大學藥學院，江蘇無錫214000）

0 引 言

微生物實驗是我院制藥工程專業(yè)本科教學的核心基礎課程之一，在本專業(yè)技能培養(yǎng)中具有極其重要的意義［1］。目前，開設的常規(guī)基礎實驗可以有效地保證學生掌握微生物學基本實驗技能，但要培養(yǎng)出雙“一流”高校人才，還需注重培養(yǎng)學習興趣和創(chuàng)新思維，重點提升分析解決問題的綜合能力，因此有必要緊密結合前沿性科研成果，圍繞微生物基本實驗核心點，輻射發(fā)散至藥理學、藥物分析等多個實驗方向，對實驗教學內容進行擴充，形成輻射狀的綜合性教學模式，提升本科教學實驗的縱橫向飽滿度。

隨著分子生物學、腸道微生學等學科的迅速發(fā)展，腸道微生態(tài)與機體健康的研究也已經(jīng)普及到食品［2］、化工［3］、醫(yī)藥［4］等多個領域，其作用也日益受到人們的關注與重視［5］，可以認為研究微生物／微生物群與其宿主的關系已成為現(xiàn)代應用微生物學的重要發(fā)展方向之一。因此開設圍繞“健康”為主旨的微生物學綜合實驗在制藥工程專業(yè)教學工作中具有一定的意義。

本綜合性實驗依托于學院腸道微生態(tài)的研究成果［6-12］，以一株前期分離得到的安全有效的益生菌［13-14］—羅伊氏乳桿菌為研究對象，由學生進行菌株觀察與鑒定，應用腸道厭氧發(fā)酵模擬器-氣相色譜對該菌株腸道“益生”作用進行定量評價，在小鼠腸道菌群失調模型上進行宏觀考察。通過開設此綜合性實驗，不僅可以促進學生鞏固經(jīng)典微生物基本操作，掌握分子生物學、藥物分析、藥理學實驗技能，還可提高學生創(chuàng)新思維和科研熱情。

1 實驗材料與儀器

1.1 實驗材料

MRS培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖20 g，檸檬酸二銨2 g，乙酸鈉5 g，K2HPO42 g，MnSO4·4H2O 0.25 g（MnSO4·H2O 0.19 g），MgSO4·7H2O 0.58 g，吐溫80 1 mL，蒸餾水1 L，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：KMOS 8.0、胰蛋白胨3.0、蛋白胨3.0、酵母提取物4.5、膽鹽3 號0.4、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.8、氯化鐵血紅素0.05、NaCl 4.5、KCl 2.5、MgCl2·6H2O 0.45、CaCl2·6H2O 0.2、KH2PO40.4、Tween80 1.0、微量元素（MgSO4·7H2O 3.0、MnCl2·4H2O 0.32、FeSO4·7H2O 0.1、CoSO4·7H2O 0.18、CaCl2·2H2O 0.1、ZnSO4·7H2O 0.18、CuSO4·5H2O 0.01、NiCl2·6H2O 0.092）2.0，pH 6.5，121 ℃濕熱滅菌20 min。

10名健康志愿者糞便；羅伊氏乳桿菌為本實驗室保存菌株；本實驗中使用的細菌基因組提取試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒等均購上海生工；PCR過程中所用引物購于上海生工，PCR過程中所用酶及試劑均購自索萊寶生物；乙酸、丙酸、丁酸、戊酸（GC，純度≥99.5%）購自阿拉丁試劑有限公司；其他試劑：分析純，上海國藥集團。

1.2 實驗儀器

顯微鏡；酶標儀；PCR擴增儀；低速離心機；厭氧工作站（37℃，80% 二氧化碳，10% 氫氣，10% 氮氣）；酸度計；渦旋儀；高壓蒸汽滅菌鍋；金屬??；氣相色譜儀；切片機；pH自動控制加液機。

1.3 實驗動物

BALB／c小鼠，雌雄各半，體重18～22 g，由上海斯萊克實驗動物責任有限公司提供，飼養(yǎng)溫度（23±2）℃，相對濕度（50±5）%，自由進食和飲水，適應性飼養(yǎng)1周。

2 實驗方法

2.1 菌株的生理生化鑒定

菌株活化后接入MRS培養(yǎng)基，37℃靜置培養(yǎng)24 h，取少量菌液并適當稀釋，涂布MRS平板，37℃厭氧培養(yǎng)48 h，于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)、生理生化鑒定。

2.2 16 S rDNA序列分析

用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細菌通用引物進行16 S rDNA的PCR擴增。PCR反應體系為25 μL：10 × PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs 2.0 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1.0 μL，ExTaq 酶0.25 μL，ddH2O 18.25 μL。PCR 反應條件：95 ℃ 預變性，2 min；循環(huán)過程為95℃變45 s，退火溫度56℃，45 s，72℃延伸90 s，共進行30個循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保持，共30個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后回收純化，送上海生工有限公司測序，測序結果在GenBank中進行BLAST比對，確定種屬類別。

2.3 體外評價

2.3.1 腸道發(fā)酵器的搭建與穩(wěn)定性評價

文獻［15］方法：結合實際研究搭建模擬腸道發(fā)酵器（見圖1），按照配方配置發(fā)酵培養(yǎng)基，高溫滅菌后向系統(tǒng)中通入高純氮氣，控制系統(tǒng)的溫度、攪拌速度、pH等，使其保持穩(wěn)定。取新鮮的健康捐獻者的糞便樣品5 g，滅菌PBS制成20%（w／v）菌懸液，震蕩混勻，離心（8 000 r／min，1 min）取上清，將上清液通過補料口接種到已經(jīng)預運行48 h的發(fā)酵罐中，調節(jié)蠕動泵以輸送新鮮培養(yǎng)基和廢液，使發(fā)酵罐的液位恒定。PCRDGGE檢測證明連續(xù)發(fā)酵的前期（0～8 d），系統(tǒng)中菌群波動較大，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，當發(fā)酵進入第9、10 d后，DGGE圖譜上條帶相似度高，種類及豐富度基本沒有變化，說明此時發(fā)酵器內的菌群處于穩(wěn)定狀態(tài)，UPGMA相似性聚類分析結果基本與DGGE結果一致。因此，本實驗選擇經(jīng)發(fā)酵器連續(xù)厭氧發(fā)酵10 d后的穩(wěn)定的腸道微生物群落為研究對象，研究羅伊氏乳桿菌的腸道調節(jié)作用。

2.3.2 實驗組設計

以穩(wěn)定恒化器中的腸道微生物菌群作為發(fā)酵系統(tǒng)，設置兩組實驗：對照組與羅伊氏乳桿菌組（接種量為1%），厭氧條件下連續(xù)培養(yǎng)36 h，取樣檢測。

2.3.3 SCFA 檢測

圖1 模擬腸道發(fā)酵器

文獻［16-17］方法：取1 mL培養(yǎng)液，4℃，12 000 r／min下離心10 min除菌體。取500 μL上清，離心去除沉淀，加入1 mL乙醚萃取15 min，低溫離心分離，取上清進樣。精密稱取乙酸、丙酸、丁酸、戊酸適量，加乙醚制成儲備液，加入內標物（50 μg／mL），待進樣。以標準物和內標物濃度比為橫坐標，對應峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，用于計算待測物濃度。采用氣相色譜法檢測短鏈脂肪酸（Short Chain Fatty Acid，SCFA）含量，色譜柱：DB-WAX 30M（I.D.0.32 mm，5 μm）；升溫程序：50℃保持3 min，以6℃／min升至120℃，保持0.5 min，以6℃／min升至220℃，保持5 min；載氣（N2）流速3 mL／min，載氣（H2）流速47 mL／min；空氣流量400 mL／min；進樣量1.0 μL；分流比1∶3。數(shù)據(jù)采用Origin 8軟件作圖，結果以平均值±標準差（mean±SD）表示。

2.4 樣品處理

2.4.1 實驗動物模型

1周的適應期后，小鼠隨機分成3組，每組8只，取兩組小鼠，連續(xù)7 d灌胃頭孢曲松鈉生理鹽水溶液（1.25 mg／g bw）造模。將模型小鼠平均分為模型組和羅伊氏乳桿菌組兩組，其中羅伊氏乳桿菌組連續(xù)15 d灌胃羅伊氏乳桿菌菌液（濃度為0.5×1010CFU／g bw）。模型組和對照組連續(xù)15 d灌胃等體積生理鹽水。

2.4.2 實驗動物及樣品處理方法

實驗定期進行稱重并監(jiān)測小鼠的攝食量，飲水量，記錄數(shù)據(jù)，灌胃結束后將小鼠頸椎脫位處死，腹部75%乙醇消毒，解剖，取盲腸內容物測定SCFA，盲腸內容物取出后，PBS沖洗，4%多聚甲醛固定，75%乙醇脫水、石蠟包埋、切片、染色，顯微鏡下觀察。

3 實驗結果

3.1 菌株鑒定結果

顯微鏡下菌落為乳白色，不透明，濕潤，中心不凸起，屬于細菌。參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》對菌株分別進行生理生化鑒定，結果如表1所示。進一步分析生理生化鑒定結果可知，該菌株均能利用糖類物質生長，同時產(chǎn)酸，且大部分菌株對膽鹽的耐受能力較強。以菌株的基因組為模板，PCR擴增長度為1.5 kb，該片段提交至GenBank中，與已報道的序列進行BLAST比對，比對結果最終確定本實驗的試驗菌為羅伊氏乳桿菌。

表1 菌株生理生化特征

3.2 體外腸道發(fā)酵器評價

SCFA是含1～6個碳原子的有機羧酸，是目前最常用的腸道微生態(tài)研究指標之一，其主要包含乙酸、丙酸、丁酸和戊酸［18］。現(xiàn)代藥理學與臨床研究表明，SCFA參與腸上皮細胞的能量供應，不僅可影響腸腔pH和電解質平衡、腸黏膜屏障的通透性、腸道高敏感和腸動力的調節(jié)，還與抗炎、抗腫瘤等密切相關。已有研究表明，不同種類SCFA的生理功能各有特點，如丁酸為腸道上皮細胞的主要能量來源，可通過激活氯離子／丁酸通道、促進鈉離子／氫離子交換等途徑促進腸道水與離子的吸收，改善腹瀉情況［19-20］，此外，丁酸還可通過抑制組蛋白去乙?；?，抑制端粒酶活動，發(fā)揮抗腫瘤效應［21］；丙酸有助于保護腸黏膜屏障，通過STAT3信號通路減少炎癥與氧化損傷［22］等。

不同組SCFA檢測結果如表2所示。數(shù)據(jù)可見，外源添加羅伊氏乳桿菌對腸道SCFA產(chǎn)生的種類沒有影響，但對含量有顯著影響。相較于對照組，添加了羅伊氏乳桿菌后，丙酸、丁酸、戊酸含量分別顯著增加了25.9、3及9倍，而乙酸未發(fā)生顯著變化。體外實驗結果表明，羅伊氏乳桿菌可影響腸道SCFA結構，從而發(fā)揮益生作用。

3.3 菌群失調模型建立及評價

3.3.1 體重檢測結果

實驗期間無小鼠死亡，各組小鼠飲水量與采食量無顯著差異。對照組小鼠體重在實驗期間無顯著變化，而模型組和羅伊氏乳桿菌組小鼠在造模后體重均有所下降，經(jīng)過15 d灌胃處理后兩組體重均有所回升，但與對照組無顯著差異。

表2 不同組SCFA的產(chǎn)生量

3.3.2 SCFA 檢測結果

不同組小鼠腸道內SCFA含量檢測結果如表3所示。數(shù)據(jù)可見，模型組小鼠腸道內SCFA含量顯著降低，其中總酸含量從（68.15 ± 6.5）mmol／L 下降至（16.27 ±0.79）mmol／L，其中乙酸含量從（32.56 ±2.32）mmol／L 顯著下降至（12.02 ±0.42）mmol／L，丁酸含量從（27.15 ±4.98）mmol／L 顯著下降至（4.25 ±1.22）mmol／L，而丙酸與戊酸幾乎檢測不出。而與模型組相比，羅伊氏乳桿菌組小鼠腸道內總酸含量［（98.55 ±3.23）mmol／L］顯著高于模型組［（16.27 ±0.79）mmol／L］，其中乙酸、丁酸、戊酸分別為（35.93±0.99），（26.07 ±4.08），（0.49 ± 0.10）mmol／L，與對照組無顯著差異；與體外結果相一致的是丙酸含量增加最明顯，為（36.05 ±4.41）mmol／L，顯著高于對照組。分析可見，抗生素干擾小鼠腸道菌群平衡，造成了SCFA顯著下降，而羅伊氏乳桿菌能夠顯著改善腸道環(huán)境，提高SCA的產(chǎn)量，但體內與體外的SCFA趨勢結果不完全一致，這可能是由于體外只能實現(xiàn)小部分腸道微生物的培養(yǎng)，導致了體內外微生物菌群的差異。

表3 盲腸內容物SCFA含量 mmol／L

3.3.3 腸道組織形態(tài)觀察

圖2所示為隨機抽取的盲腸組織切片光鏡圖，由圖可見，對照組小鼠腸道上皮細胞完整，絨毛排列整齊，模型組腸上皮細胞破壞嚴重，腸絨毛缺損明顯，排列紊亂，而經(jīng)過羅伊氏乳桿菌干擾的小鼠腸上皮結構與對照組相近，腸絨毛排列整齊且致密。

圖2 小鼠盲腸縱切面200×

表4所示為各組腸絨毛高度，數(shù)據(jù)顯示模型組小鼠腸絨毛高度［（76.4 ±7.5）μm］相較于對照組［（149.7 ±4.5）μm］顯著降低（P ＜0.05），經(jīng)過羅伊氏乳桿菌干預的小鼠腸絨毛高度［（165.9±5.1）μm］較模型組甚至空白對照組都有顯著增長（P＜0.05）。結果表明，羅伊氏乳桿菌能夠在抗生素失調模型小鼠中發(fā)揮腸道保護作用。這可能是由于羅伊氏乳桿菌能夠通過調節(jié)腸道SCFA的數(shù)量與結構，改善抗生素引起的腸黏膜損傷，促進腸絨毛的增長等［23］。

表4 各組小鼠盲腸絨毛高度

4 結 語

（1）菌株的培養(yǎng)鑒定實驗可進一步鞏固學生微生物的基本操作技能，在此基礎上增加了常規(guī)的分子操作，拓寬了傳統(tǒng)微生物實驗課的視野，為學生進一步從事相關科研工作奠定了基礎。

（2）以SCFA為定量指標，搭建了體外腸道模擬發(fā)酵器，提高微生物實驗課堂的趣味性，該實驗單元著重培養(yǎng)了學生對氣相色譜、PCR等科研型儀器的操作能力。

（3）藥理學技術等已在多學科領域得到全面普及，動物實驗單元要求學生熟練掌握解剖、取樣等技能以獲取樣本，進行關鍵性指標檢測及常規(guī)病理切片，對培養(yǎng)學生綜合實驗技能和提高科研素養(yǎng)具有重要的意義。

（4）通過本實驗項目的實施，有助于學生掌握精準化腸道微生態(tài)營養(yǎng)產(chǎn)品的開發(fā)與研究的一般方法與科研思路，為未來從事藥學、食品、微生物學等領域相關工作奠定基礎。